一、体外诱导人胚胎干细胞向神经细胞分化的研究进展（论文文献综述）
张云峰[1]（2021）在《促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究》文中研究指明绵羊是一种非常重要的家养动物,利用基因修饰手段来改良或育种是一个方向。目前利用转基因技术进行分子育种,存在较难控制外源基因与效率较低等问题。基于小鼠胚胎干细胞（ESC）的基因打靶技术能进行精确有效的敲入或敲出。由于绵羊ESC很难分离获得,利用同样具有多能性的诱导多能干细胞（iPSC）代替ESC进行精确遗传工程操作成为目前急需解决的问题。目前绵羊的iPSC存在诱导效率低,难以获得完全重编程的iPSC的问题。microRNA是基因表达转录后的调节器,研究证明ESC特异性的miRNAs能促进体细胞重编程。因此,筛选能促绵羊体细胞重编程的miRNAs,并探讨其重编程机制,有望建立一种高效获得绵羊iPSC的体系,对优质绵羊培育具有应用价值,也为获得绵羊ESC奠定基础。生殖细胞是唯一将基因组和表观遗传信息传递给下一代的细胞谱系,但在体外重建生殖细胞发育一直是生物学研究的挑战。随着小鼠多能干细胞在体外可以分化为原始生殖细胞样细胞（PGCLC）,进而发育为卵母细胞并能进行生殖系传代,为绵羊多能干细胞在体外生产PGC提供了理论依据和方法。研究绵羊iPSC定向分化为雌性PGCLC,为绵羊PGC的发育研究可以提供一种细胞模型,为后期分化为功能卵子奠定了基础,对提高绵羊优质配子利用,加快畜群的改良速度具有重要的应用价值。目的:（1）筛选出能促进绵羊体细胞重编程的microRNA;（2）初步探索microRNA在绵羊体细胞重编程过程中的机制;（3）建立一种利用绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞的方法。方法:（1）组织块法分离培养妊娠45d左右的绵羊胎儿肾细胞（SKC）,作为重编程的起始细胞;胰酶消化法分离CF-1小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）,丝裂霉素C处理后,作为诱导绵羊iPSC的饲养层细胞。（2）结合文献报道和数据库综合分析在小鼠和人干细胞中高表达或可促进重编程的miRNAs,筛选出可能促绵羊体细胞重编程的miR302/367簇、miR200b-200a-429簇、miR200c-141簇,并包装慢病毒;同时将Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Nanog、Lin28、SV40T、h TERT等八种人源转录因子包装慢病毒;利用不同慢病毒感染SKC进行诱导重编程,通过碱性磷酸酶（AP）染色统计诱导效率,筛选出可促进绵羊体细胞重编程的最优miRNA;并对获得的绵羊iPSC从AP染色、实时定量PCR、细胞免疫荧光、核型分析、甲基化测序分析、拟胚体分化这几个方面进行鉴定。（3）利用miRbase和Target Scan等生物信息平台预测miR-200c靶基因,并送公司合成oar-miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照;设计引物,克隆靶基因结合位点的3’UTR区及突变3’UTR,构建ZEB1和TWISTNB靶基因的双荧光素酶报告分析载体。（4）通过oar-miR-200c mimics转染细胞,利用荧光素酶报告载体分析与靶基因的作用;利用qRT-PCR检测靶基因的转录水平;利用Western blot检测靶基因的蛋白水平;探讨oar-miR-200c在绵羊体细胞重编程过程的作用机制。（5）设计引物,扩增克隆绵羊生殖相关基因DAZL和BOULE,并构建慢病毒载体PLVX-Dazl和PLVX-Boule,并进行包装慢病毒。（6）组织块法分离培养原代绵羊卵巢细胞;DAZL和BOULE慢病毒感染绵羊iPSC,建立转基因绵羊iPSC;通过摸索培养体系和条件,利用绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞;利用qRT-PCR检测绵羊生殖细胞特异因子的转录水平,利用Western blotting检测生殖细胞特异因子的蛋白水平。结果:（1）成功分离绵羊体细胞SKC,其表达角蛋白CK18;成功分离小鼠CF-1MEF细胞,并制备饲养层细胞,能很好的支持siPSC生长。（2）筛选的三个miRNA簇,成功包装miRNA慢病毒;成功包装8种转录因子的慢病毒;慢病毒感染绵羊SKC后,通过诱导效率比较分析,筛选出miR-200c-141簇可将重编程效率提高到0.95%;获得的绵羊iPSC经鉴定呈阳性;（3）成功构建miR-200c靶基因ZEB1和TWISTNB的双荧光素酶报告载体;（4）双荧光素酶报告分析,oar-miR-200c靶向ZEB1和TWISTNB的3’UTR;qRT-PCR和Western blotting检测oar-miR-200c可显着降低ZEB1和TWISTNB基因的表达,但可增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率;（5）成功构建绵羊生殖相关基因慢病毒载体LVX-Dazl-F2A-mcherry-IRES-NEO和PLVX-Boule-F2A-mcherry-IRES-NEO,并成功包装慢病毒;（6）成功建立稳转Dazl和Boule基因的绵羊iPSC,在培养液中添加Activin A、bFGF、BMP4、LIF、EGF等因子及卵巢细胞培养上清,可使绵羊iPSC分化为PGC样细胞,分化第八天可表达生殖相关标记蛋白PRDM1、PRDM14和VASA,其基因Dazl、Boule、Prdm14和Vasa的mRNA转录呈高水平状态。结论:（1）成功筛选出miR-200c-141可以促进绵羊体细胞重编程为iPSC;（2）oar-miR-200c靶向Zeb1和Twist NB基因的3’UTR,显着降低Zeb1和Twist NB表达水平,增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率。（3）利用生殖系相关基因DAZL和BOULE的慢病毒感染绵羊iPSC,在添加activin A、b FGF、BMP4、LIF、EGF等因子的条件下,可以将绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞。
肖倩茹[2]（2020）在《基于人头发丝支架的体外三维心肌组织的构建及其收缩性能的研究》文中认为目前,心血管疾病仍然是威胁人类健康的头号杀手。心血管疾病的传统药物开发和研究主要依赖于动物模型,但由于种间差异,动物模型并不能很好地模拟人体心脏的真实环境,因此,即便这些药物顺利地通过了动物实验,也有较大可能在临床上表现出很强的毒副作用,最终不得不被撤回。因此,针对心血管疾病的药物开发仍然面临着巨大的挑战。近年来,科研人员们致力于利用人源细胞构建体外心脏模型的研究。体外心脏模型可以更真实地模拟人体心脏的生理和功能环境,有效提高临床前药物评估的安全性和可靠性。本论文主要研究了人源心肌细胞的来源,并利用人头发丝作为支架材料构建体外心肌组织,研究了体外心肌组织的收缩性能。由于成人心肌细胞是终末分化细胞,缺乏增殖和再生的能力,因此,体外人源心肌细胞的获取主要依赖于干细胞分化。人多能干细胞,包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞,具有很强的增殖能力以及在特定条件下向不同细胞系分化的潜能。本文主要通过小分子诱导法和商用试剂盒法两种方法来诱导人诱导多能干细胞向心肌细胞方向分化。小分子诱导法首先通过糖原合成激酶3抑制剂CHIR99021分子来激活Wnt信号通路,然后再利用IWR-1分子来抑制Wnt信号通路,从而诱导人诱导多能干细胞分化为心肌细胞。而商用试剂盒法则是通过在不同的培养时间点添加不同的试剂,来获得心肌细胞。通过比较两种方法我们可以发现,小分子诱导法成本较低,可以获得单层收缩的心肌细胞,而商用试剂盒法虽然成本较高,但其心肌分化效率也更高。两种分化方法在我们后续的体外心肌组织构建和研究实验中均有涉及。在确定心肌细胞的来源以后,我们采用了人头发丝作为支架材料来构建体外心肌组织。首先,我们构建了以短直头发丝作为悬挂模板的体外心肌组织（心肌条）并对其进行了长期培养。结果表明,头发丝作为悬挂模板有助于悬挂心肌条的形成,心肌条可以很好地在头发丝之间收缩,并且该支架可以支持心肌条的长期培养（最长培养时间达118天）。随后,我们又将人头发丝制备成弹簧结构,并将头发丝弹簧与短直头发丝一起组合作为支架,来构建心肌组织,并研究了头发丝弹簧与短直头发丝的不同组合方式对心肌组织的收缩性能的影响。结果表明,头发丝弹簧的引入可以使得体外工程化心肌组织的收缩更具有立体感,并且明显提升工程化心肌组织的收缩性能。最后,为了更定量地了解体外心肌组织的收缩力,我们制备了一系列不同直径和不同长度的头发丝弹簧,并测量了弹簧的弹性系数,我们发现头发丝弹簧的弹性系数可以低至0.019 N/m,与原子力显微镜用于测量细胞的探针的弹性系数相当,足以测量心肌组织的收缩力。于是,我们用头发丝弹簧和两根短直头发丝组建了一个测量心肌组织收缩力的装置。该装置可以在体外心肌组织的培养过程中,实时地通过视频观察,测算出心肌组织的收缩力。
刘茜[3]（2020）在《mTOR信号通路在人脐带血造血干/祖细胞红系定向分化中的作用及机制研究》文中指出背景:红细胞成分输血已广泛应用于临床各个领域疾病的治疗,是血液病、免疫缺陷综合征、严重创伤、器官移植、恶性肿瘤等疾病得以有效治疗的重要保障,更是重型再生障碍性贫血、重型地中海贫血及镰刀形红细胞贫血等疾病骨髓移植之外唯一有效和维持患者生命的治疗手段。目前,临床使用的红细胞等血制品仍依赖于献血志愿者外周血捐献,然而,全球献血量中存在供给和需求的不平衡,输血存在血液相容性及感染的风险。在献血志愿者之外找到更为充足、安全、经济的血液替代来源一直是世界范围内的重要研究方向。在过去的几十年里,许多研究小组已经建立了体外诱导包括人骨髓、外周血、脐带血等来源的造血干/祖细胞分化为红细胞的方法,并在免疫缺陷小鼠模型及非人类灵长类动物（NHP）模型中证实了体外培养得到的红细胞的生理。然而目前已有的诱导方法所获得的红细胞在脱核效率与扩增效率方面都远未达到临床应用的要求。因此,只有充分阐明人红细胞分化、增殖各调控层面及信号通路间的相互作用与机理,尤其是终末期成熟的调控机制,才能突破目前的技术瓶颈,建立并优化大规模体外诱导分化的方法,提高分化终末期脱核成熟及扩增效率,使之尽早用于临床,同时为治疗地中海贫血、慢病性贫血等疾病中出现的无效红系造血,改善患者的贫血症状提供新的药物作用靶点与思路。目前自噬被认为是红细胞终末成熟的主要机制。自噬相关的信号调节通路非常复杂,mTOR信号通路是其中最主要的负性调节因子。雷帕霉素是最早发现的mTOR抑制剂,已经被FDA批准用于临床。然而,雷帕霉素到底是治疗贫血还是导致贫血,存在争议。我们前期在动物体内的研究发现,mTOR信号通路是在红细胞分化早期造血干细胞分化和增殖中所必须的;体内和体外对mTOR通路的抑制显示可部分纠正缺陷红细胞成熟的异常。但由于受实验材料及手段的限制,mTOR在人红细胞分化与终末期成熟过程中的作用及分子机制,目前尚缺乏足够的直接证据。目的:1)观察人脐带血来源的造血干细胞向红系定向分化过程中,mTOR信号通路对细胞增殖,分化和成熟的影响。2)研究mTOR通路调控人脐带血来源的造血干细胞的红系定向分化的机制。3)优化体外诱导人造血干/祖细胞红系定向分化的培养体系,提高红细胞的终末期成熟效率。方法:1)采用密度梯度离心与免疫磁珠法分离纯化人脐带血CD34+细胞。2)采用无血清无饲养层体系体外诱导人脐带血来源的CD34+细胞向红细胞定向分化。3)实验分组:在红系定向分化不同时间点（Day8,Day11,Day18,Day22,Day44）,向培养基中加入50n M雷帕霉素作为药物处理组,以未处理组和DMSO组（溶剂组）作为对照组。4)通过流式细胞术检测进行细胞表面抗原CD34、CD36、CD71和CD235a染色,以分析分化进程;CFDA SE染色后比较细胞增殖能力;PI染色后比较细胞周期;Brd U染色后进一步验证细胞增殖和细胞周期的结果;Annexin V-FITC/7-AAD染色检测凋亡率;DRAQ5染色后,检测脱核细胞比例;CD235a和Mito Tracker染色后,流式细胞术检测红细胞中线粒体的清除;H2DCFDA染色后检测活性氧水平;JC-1染色检测成熟末期红细胞线粒体膜电位变化。5)Wright-Giemsa染色观察分化过程中细胞的形态,May-Grünwald-Giemsa（MGG）染色观察挑出的BFU-E/CFU-E细胞形态及表型。6)CD235a和Mitotracker染色后,用激光共聚焦检测CD235a阳性细胞中Mitotracker的平均荧光强度。Lysotracker和Mitotracker染色后,用激光共聚焦检测检测红细胞中线粒体自噬。7)RT-q PCR检测珠蛋白基因,红系分化特异性基因,脱核相关基因及mTOR下游基因及自噬相关基因的转录水平。8)Western blot检测脱核相关基因,mTOR下游基因及自噬相关基因的蛋白表达。结果:1)从人脐带血中纯化得到CD34+细胞,并成功诱导其向红细胞分化。2)集落形成实验显示,在分化早期,雷帕霉素处理细胞后,BFU-E和CFU-E-E数目显着降低,尤其是BFU-E形成明显被抑制。3)在分化早期,雷帕霉素处理细胞后,细胞增殖被抑制,细胞周期停滞在G0/G1期,凋亡和分化进程未受影响,同时检测发现G1-S过渡调控基因p27的m RNA水平和蛋白水平升高。4)在红系分化中、后期,雷帕霉素处理使红细胞脱核率增高,珠蛋白转录水平增高,活性氧水平降低,且促进了成熟末期红细胞内的线粒体清除。5)雷帕霉素处理细胞后,mTOR通路的下游靶蛋白（p70S6及S6）磷酸化水平降低,mTOR通路被抑制,大部分自噬相关基因的m RNA和蛋白水平升高。结论1)我们在体外建立的无血清无饲养层培养体系可成功诱导人脐带血CD34+细胞向红细胞定向分化,且在我们建立的人脐带血CD34+细胞红系分化体系中,于分化的第18天加入雷帕霉素处理可明显提高红细胞终末期脱核成熟的效率而不降低细胞数量。2)mTOR信号通路对于人红系早期分化与细胞增殖是必需的,mTOR通路抑制导致了细胞周期停滞与细胞增殖抑制,从而抑制了BFU-E与CFU-E等红系集落的形成,但凋亡率和分化进程未有明显改变。3)在人红系分化中后期,mTOR通路的抑制使自噬过程增强,从而提高了红细胞的脱核效率,促进了线粒体清除,并最终促进了红细胞的终末期成熟。
张思炫[4]（2020）在《糖胺聚糖类似物及光热纳米材料协同诱导胚胎干细胞神经分化的研究》文中研究说明胚胎干细胞向神经细胞的诱导分化在神经退行性疾病的治疗中具有良好的应用前景,如何高效的诱导干细胞向神经细胞定向分化是当前亟需解决的关键问题。糖胺聚糖（GAG）相关信号通路和视黄酸（RA）相关信号通路作为干细胞神经分化过程中最为关键的两种信号通路,在基础研究和实际应用中都受到了广泛的关注。然而,信号分子利用度低是上述两类策略中存在的共性问题。基于此,本论文旨在开发一种新型的细胞分化诱导平台,既能利用糖胺聚糖类似物作用于GAG相关信号通路以促进神经分化,同时提高RA的细胞利用率进一步促进神经细胞的分化和成熟,通过以上两种方式协同作用于神经分化信号通路,达到提高干细胞神经分化效率和纯度的目的。具体研究内容如下:（1）以金纳米粒子（GNP）为载体,研究糖胺聚糖类似物和RA光热传输的协同作用对小鼠胚胎干细胞神经分化的影响。首先通过可逆加成-断裂链转移自由基聚合（RAFT）的方法合成分别含有糖胺聚糖功能性单元（糖单元和磺酸单元）的聚合物聚N-甲基丙烯酰葡萄糖（PMAG）和聚对苯乙烯磺酸钠（PSS）,并通过胺解法得到巯基化的聚合物。随后通过不同的比例将上述两种聚合物组装到金纳米粒子表面,得到糖胺聚糖类似物改性的纳米粒子复合物。该复合物利用GNP与细胞膜之间的相互作用将功能单元富集到细胞膜表面,提高功能单元激活GAG相关信号通路的效率,达到促进神经分化的效果。同时,利用GNP自身的光热转换效应,在一定的激光照射条件下将RA传输到细胞内,提高其与细胞核上相应受体结合的几率从而进一步提高分化效率,以此来提高干细胞神经分化的效率和纯度。免疫荧光染色和实时定量聚合酶链式反应（qPCR）实验结果表明:当两种聚合物按投料比为1:1进行组装时,获得的纳米粒子复合物即GNP-M1S1具有最佳的促分化效果。更为重要的是,在0.80 W/cm2激光功率照射10s条件下,GNP-M1S1实验组分化细胞β3-tubulin基因的表达量增加320倍左右,分化细胞中神经细胞百分比提高到87%左右。该结果表明,金纳米粒子表面糖胺聚糖功能单元的修饰以及光热效应的协同不仅能够显着提高胚胎干细胞向神经细胞的分化效率,而且对分化神经细胞的纯度也有显着提升。（2）基于静电纺丝支架材料研究糖胺聚糖类似物及光热金纳米材料对胚胎干细胞神经分化的影响。首先通过同轴静电纺丝技术制备负载糖胺聚糖类似物和金纳米棒（GNR）的核壳结构支架材料,纤维内核为含糖单元和磺酸单元的聚合物PMAG和PSS,纤维外壳为包载GNR的聚己内酯（PCL）壳层。支架材料的高孔隙率为细胞提供良好的生长微环境,纤维结构中负载的聚合物释放后作用于细胞,激活GAG相关信号通路以促进干细胞分化;同时,利用纤维壳层中GNR的光热效应将RA因子输送到细胞内部,与细胞核上的受体结合,进一步促进干细胞的神经分化。实验结果表明:纺丝结构中糖胺聚糖类似物和金纳米棒的引入均具有促神经分化的作用;同时,GNR光热效应的协同显着增强了 PCL@GNR和PCL&P@GNR支架材料的促神经分化效果,尤其是PCL&P@GNR支架材料,在0.66 W/cm2激光功率照射30 s的条件下,促神经分化效果达到最佳,神经细胞标志性基因β3-tubulin的相对表达量提高250倍左右。该结果表明,这种新型的复合支架材料在金纳米棒光热效应的协同下具有优异的促神经分化效果。综上所述,本论文基于糖胺聚糖类似物和神经诱导分子RA在胚胎干细胞神经分化中的重要作用,分别以金纳米粒子和静电纺丝材料作为载体,既利用糖胺聚糖类似物作用于GAG相关信号通路,同时又通过光热效应提高RA向细胞内的传输,通过上述两种策略的协同提高干细胞神经分化的效率和纯度。本论文的工作为构建胚胎干细胞神经分化诱导平台提供了新的思路和方向,不仅对神经退行性疾病的细胞治疗具有重要的理论研究意义和实际应用价值,同时也为其他类型细胞的定向诱导分化提供了指导。
王雪姣[5]（2020）在《葛根素诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究》文中研究表明背景:心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）作为世界上危害人类尤其是中老年人生命健康的主要疾患之一,因其极高的发病率以及近年来的年轻化趋势,而备受广大医者和学者的关注。急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）作为心血管疾病中重要一员,其科学实验及临床治疗的研究更是成为热点和难点。已经发育成熟的心肌细胞作为终末分化细胞,当发生心肌梗死时,心肌细胞不同程度受损甚至坏死,功能丧失。临床对于AMI的治疗方法主要包括药物治疗、介入治疗等,都是针对心肌梗死早期用于挽救受损但是还未凋亡的心肌细胞及其功能,但对于已经坏死或凋亡的心肌细胞却是回天乏术。心肌细胞坏死或凋亡,功能性心肌细胞由无功能的成纤维细胞取代进而形成瘢痕组织,心室重构,心脏功能下降,最终导致心力衰竭,导致患者生活质量下降,严重的威胁患者生命。由于心肌细胞损伤的不可逆性,解决心肌细胞的缺失成为心肌梗死治疗的根本问题。随着科学技术的进步,细胞生物工程学的发展使干细胞替代疗法成为治疗心肌梗死的一种新的具有前景的治疗方法。干细胞具有自我复制和多向分化的能力,使干细胞移植治疗心肌梗死成为研究热点。多项基础实验和临床试验已经表明干细胞移植能够修复受损的心肌细胞,促进血管新生,减少梗死面积,促进心脏功能的恢复。自2003年美国FDA率先批准对心肌梗死等疾病采用自体骨髓干细胞移植进行治疗,此后全球范围内开始了干细胞治疗的相关研究,骨髓间充质干细胞是其中应用最为广泛和成熟的。骨髓间充质干细胞（bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs）与胚胎干细胞等其他干细胞相比以下优点:具有容易获取,容易分离,体外培养及扩增具有稳定性,没有免疫排斥问题,不涉及医学伦理道德问题,具有多向分化潜能,运用恰当的诱导剂在适当条件下可以分化为骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、内皮细胞、干细胞、平滑肌细胞、心肌样细胞,上述优点使其成为了干细胞移植治疗心肌梗死等心血管疾病的重要种子细胞。BMSCs可以通过与心肌细胞共培养,基因修饰及药物诱导等方法分化为心肌细胞,但其分化率及安全性有待进一步提高。葛根素是葛根的重要成分,它可以影响骨髓间充质干细胞的分化。葛根素及其多种制剂已经通过各种药剂形式广泛应用于临床各种心血管疾病的治疗。葛根素作为中药有效成分,与西药相比,毒副作用更小,使用更安全,临床推广价值显着。目前已有研究发现,葛根素不仅能保护受损心肌细胞、保护心血管,还能在体外诱导胚胎干细胞分化为心肌样细胞,提高心室细胞分化效率。目的:本实验应用葛根素体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞,从形态学和分子生物学层面探讨葛根素对骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的诱导能力,通过其诱导分化最适浓度的筛选提高分化率,为心肌梗死等心血管疾病的干细胞移植治疗提供理论基础。方法与结果:为了探讨葛根素诱导BMSCs分化为心肌样细胞的可行性,运用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠的四肢骨的BMSCs。对第2代BMSCs分别运用0（对照组）、50、100、200μmol/L葛根素进行体外定向诱导。观察培养细胞的形态,结果可见,BMSCs由0小时的悬浮状态到24小时时均匀贴壁;3天后可见细胞圆钝突起;7天后细胞呈现长梭形等不规则状态。葛根素诱导7天后,细胞增殖加快,细胞形态更加修长;诱导28天后,细胞呈现方向性的紧密排列状态。BMSCs的形态经过不同浓度葛根素诱导无差异。运用流式细胞技术对第3代BMSCs进行表面抗原鉴定,结果显示,CD29、CD45、CD90的阳性率表达分别为95.1%、7.4%和93.4%。表明细胞为纯化的BMSCs。运用免疫细胞化学检测法检测间隙连接蛋白43（Cx43）、心肌肌钙蛋白I（c Tn I）、心肌肌钙蛋白T（c Tn T）在诱导4周后各组的表达。结果显示,各诱导组均可见Cx43、c Tn I及c Tn T的阳性表达,空白对照组表达呈阴性,其中100μmol/L诱导组较其他组的阳性表达最高,差异具有统计学意义（P<0.05）。运用激光共聚焦荧光技术检测间隙连接蛋白43（Cx43）、心肌肌钙蛋白I（c Tn I）、心肌肌钙蛋白T（c Tn T）,对比诱导4周后对照组与100μmol/L诱导组的表达,提示100μmol/L诱导组呈阳性表达,对照组呈阴性表达,差异显着。运用Western blotting检测法检测间隙连接蛋白43（Cx43）、心肌肌钙蛋白I（c Tn I）、心肌肌钙蛋白T（c Tn T）在各组诱导4周的BMSCs的表达。结果显示,各组均在蛋白水平表达Cx43、c Tn I及c Tn T,其中100μmol/L诱导组的表达最高,对照组最低,差异有统计学意义（P<0.05）。实时荧光定量PCR（RT-q PCR）技术检测心肌早期转录因子GATA-4和心肌细胞增强因子2c（MEF2c）在各诱导组诱导分化1周、2周、4周细胞的表达,检测T-box5和amphiphysin-2（Bin1）在空白对照组与100μmol/L诱导组诱导分化1周、2周、4周细胞的表达。结果显示,经葛根素诱导后,各个基因的表达与对照组相比整体呈现上升趋势。虽然各个基因的最高表达量呈现在不同时间段,但都出现在100μmol/L诱导组。各诱导组相比,GATA-4的最高表达量出现在100μmol/L诱导组诱导4周时,MEF2c的最高表达量出现在100μmol/L诱导组诱导2周时。100μmol/L诱导组与空白对照组相比,T-box5的最高表达量出现在100μmol/L诱导组诱导1周时,Bin1的最高表达量出现在100μmol/L诱导组诱导4周时。相较于其他诱导组,100μmol/L组表达最高（P<0.05）。结论:1.采用全骨髓贴壁法分离培养的SD大鼠四肢骨髓细胞可以纯化为骨髓间充质干细胞。2.不同浓度葛根素可以在体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。3.100μmol/L为葛根素体外诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的最佳浓度。
韩雨[6]（2020）在《人诱导多能干细胞向成骨样细胞逐步诱导分化的研究》文中认为骨组织是人体行使运动、支撑、保护等功能的重要组成部分,但由外伤、感染、肿瘤和先天性疾病等因素造成的不同类型的骨缺损却非常常见,且是临床治疗中的难点之一,同样颌骨的缺损也一直是口腔外科、种植修复所面临的一大难题。目前,为解决骨的来源、排异反应及力学要求等问题,骨组织再生工程成为解决骨缺损修复临床治疗问题的有效途径之一。其中,骨组织工程的关键因素是成骨细胞,成骨细胞是骨形成的基础细胞,如何获得足够数量的成熟的成骨细胞也就成为目前骨组织工程在基础研究和临床应用中的关注重点。人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells,hiPSCs）具有和人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）一样的多能性,能进行无限增殖和分化为三胚层中的各种体细胞,且hiPSCs是由人体体细胞重编程获得的,避免了hESCs存在的伦理问题,在组织发育、药物筛选和细胞疗法等领域显示出良好的应用前景。因此本课题的主要研究目的是高效率诱导hiPSCs分化为成骨样细胞,为骨组织工程提供足够数量的高质量的种子细胞。针对目前hiPSCs成骨向诱导方法起始分化条件不一致的问题,本课题分别探究了拟胚体（embryoid bodies,EBs）诱导法的最佳悬浮培养时间和单层诱导法的理想起始分化细胞密度。首先,将hiPSCs来源的EBs悬浮培养3-10天,利用RT-PCR技术分析了中胚层、神经嵴、间充质及成骨相关基因在这些样本中的表达。然后,选取悬浮时间为3天、5天、7天和10天的EBs,将其接种于明胶表面并利用成骨诱导培养基诱导分化14天,最后利用RT-PCR技术、碱性磷酸酶实验、茜素红实验及免疫荧光技术比较成骨分化效率。结果表明,3-5天是通过拟胚体法进行成骨向诱导分化的最佳悬浮时间。此外,当hiPSCs在Matrigel表面汇合到不同的细胞密度（20%、50%、80%和100%）时,采用单层诱导法进行7天、14天、21天和28天的成骨向分化,并利用上述方法分析成骨分化效率,结果表明80%起始分化密度适于单层成骨诱导分化。上述结果为接下来继续利用单层法诱导hiPSCs定向成骨分化体系的构建奠定了基础。最后,通过查阅文献,针对在胚胎向中外胚层分化过程中起重要作用的信号通路,选择CHIR99021、CYC、FGF2、SB431542、LY294002和BMP4等相关化合物,构建体外hiPSCs经中外胚层向成骨样细胞分化的诱导体系。同时,借鉴诱导hPSCs经中胚层定向诱导分化为心肌细胞的经验及逐步诱导hPSCs成骨分化的研究,将诱导hiPSCs中胚层向分化时间分为2天（D0-D2阶段）和5天（D3-D5阶段）。首先,当hPSCs在Matrigel表面汇合到80%的细胞密度时,利用上述化合物分别进行2天的中胚层向诱导,并利用RT-PCR技术检测中胚层及成骨相关基因的表达。随后,利用成骨诱导培养基继续诱导其分化14天并检测成骨分化效率。结果显示:CHIR99021和SB431542是D0-D2阶段的最有效的化合物。在确定前2天条件的基础上,继续利用上述化合物分别进行3天的中外胚层向诱导,利用RT-PCR技术检测中胚层、神经嵴、间充质及成骨相关基因的表达,并分析继续成骨分化14天后的成骨效率,确定了D3-D5阶段最有效的化合物为BMP4。后期,将继续探索小分子诱导中外胚层样细胞向间充质样细胞分化,继而向成骨样细胞分化,最终实现高效率的hiPSCs成骨分化,对继续构建成分明确的hiPSCs定向成骨分化诱导体系具有重要意义。
伟人悦[7]（2020）在《猪诱导多能性干细胞定向分化为血管内皮细胞的研究》文中进行了进一步梳理心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）是目前全球范围内导致患者死亡的最主要因素之一。冠状动脉类疾病（coronary artery disease,CAD）是心血管疾病中的一种,其致病机理为:由于血管内皮功能障碍引发血管损伤或血管功能丧失,造成心脏的血液灌注减少,最终引发心肌缺血甚至心肌梗塞。但是传统的药物针对该类疾病的治疗具有很大局限性,因此细胞移植治疗成为相关医疗及科研人员的关注点。胚胎干细胞（embryo stem cell,ESCs）和诱导多能性干细胞（induced pluripotent stem cell,i PSCs）是细胞移植治疗的种子细胞来源。但是ESCs的临床应用涉及到医学伦理问题和异体移植后的免疫排斥风险,i PSCs的应用将为心血管疾病的治疗提供便利。目前,很多研究人员对i PSCs向血管内皮细胞的定向分化进行了探索,相关研究主要集中在小鼠和人上。猪作为一种重要的农用家畜,其器官大小及生理学特征与人体具有很大的相似性,猪的寿命又相对较长,因而被认为是研究人类心血管及代谢性疾病的良好动物模型。对于猪诱导多能性干细胞的建系、培养及定向分化为血管内皮细胞体系的研究将为创建猪心血管疾病模型提供保障。目前,很多研究组通过不同的方法建立了猪i PS细胞系,但是关于其向血管内皮细胞定向分化的研究少之又少。2013年,Gu等首次报道了将猪脂肪间充质来源的i PSCs诱导分化为内皮细胞的方法,但其采用了周期较长且效率较低的拟胚体诱导分化途径,培养液成分也相对复杂。针对上述问题,我们进行了以下四部分研究:（1）使用无血清单层细胞诱导的方式对四种猪多能性干细胞系（猪胚胎来源的干细胞系Penk6和Pe WCHX,猪诱导多能性干细胞系Pilw4和M10）进行诱导分化,并检测细胞分化前期谱系特异性基因的表达趋势,从而筛选出中胚层分化潜能最高的猪多能性干细胞系;（2）使用不同的细胞因子或化学小分子组合对上述细胞进行诱导,筛选出促进细胞向中胚层分化的最优组合;（3）优化上述培养体系,建立一种无血清无饲养层的猪i PSCs向血管内皮细胞定向分化的诱导方法;（4）使用上述方法分别诱导人和猪的多能性干细胞向内皮细胞分化,并比较二者分化进程中的差异。研究结果表明,猪胚胎来源的Penk6和Pe WCHX细胞系在诱导分化过程中细胞形态无明显变化,猪诱导多能性干细胞M10和Pilw4在诱导分化过程中失去克隆形态并有部分细胞死亡。谱系特异性基因的表达检测结果显示,Penk6、Pe WCHX和M10细胞没有启动向原条期的分化且中胚层标记基因的表达变化无规律,Pilw4细胞的原条期、内胚层以及中胚层标记基因的表达水平均是先提高后下降,说明该细胞启动了分化进程。据此,我们选择猪诱导多能性干细胞系Pilw4进行后续实验。首先,我们使用四种前人报道的诱导人ESCs向血管内皮细胞分化的单层培养方法对pi PSCs进行定向诱导,在其中选择能够有效促进pi PSCs向中胚层分化的方法用于后续实验。接下来,我们对上述方法进行优化并研究了CHIR99201和BMP4在诱导分化前期的作用。实验根据第0至4天的不同处理方案分为6组进行:F,在第0至2天不添加CHIR99021、第3至4天添加FGF2;FB,第0至2天不添加CHIR99021、第3至4天添加FGF2和BMP4;BFB,第0至2天添加BMP4、第3至4天FGF2和BMP4;CF,在0至2天添加CHIR99201、3至4天添加FGF2;CFB,在0至2天添加CHIR99201,第3至4天添加FGF2和BMP4;CBFB,在第0至4天添加CHIR99021和BMP4,第3至4天添加FGF2和BMP4。上述6组从第5天开始处理一致:第5至7天培养液中添加VEGF和BMP4,8至10天换用商品化的内皮细胞培养液进行培养,第11天对细胞进行流式分选以及血管内皮细胞鉴定。实验结果显示,F、FB、BFB三组在诱导分化前期原条期标记基因的表达水平很低,完成诱导周期后CD31阳性细胞百分比仅为3.12%-5.16%;CF、CFB、CBFB三组在诱导分化前期原条期和内胚层标记基因的表达水平先上升后下降,中胚层标记基因表达水平持续上升,完成诱导周期后CD31阳性细胞百分比均高于12%,其中实验组CFB,CBFB的CD31阳性细胞率分别为21.3%和17.1%。以上结果表明,CHIR99201在pi PSCs向血管内皮细胞分化的前期具有促进作用,在诱导分化中期添加BMP4能够显着提高血管内皮细胞的诱导效率。此后,我们利用优化后的诱导步骤,从pi PSCs中获得了血管内皮细胞,该细胞具有与猪主动脉血管内皮细胞（AOCs）相似的形态、基因表达模式和功能特征。此外,我们使用相同的诱导步骤对人胚胎来源的干细胞进行诱导分化,结果表明人胚胎干细胞的分化效率远低于pi PSCs的分化效率,这可能与诱导过程中二者谱系基因表达模式上的差异相关。综上所述,我们建立了一种无血清的不依赖于饲养层的单层细胞诱导分化方法,可以将猪诱导多能性干细胞定向分化为具有功能的血管内皮细胞。该研究为评价大动物体内血管内皮细胞自体移植效果以及创建猪心血管疾病模型提供了可能。
李自立[8]（2020）在《人多能干细胞向原始生殖细胞诱导及表观遗传调控机制的研究》文中研究表明第一部分构建H1 ESCs荧光报告细胞系并优化PGCLCs诱导效率【目的】由于人早期生殖细胞的不可获得性,通过h PSCs体外向生殖细胞诱导为人类早期生殖细胞的研究提供了体外模型。但是由于人早期原始生殖细胞缺乏特异的表面标记,不易与周围未分化的体细胞区分,所以本实验通过CRISPR-Cas9基因编辑技术在PGCs特异性基因BLIMP1终止密码子前插入一个m Kate2红色荧光蛋白基因,用于检测BLIMP1基因的表达情况。在PGCs体外诱导分化的过程中,可以通过流式细胞分析技术或荧光显微镜观察荧光蛋白的表达,以确定PGCs的分化效率,并利用此报告基因细胞系检测不同诱导方案的诱导分化效率以优化PGCs诱导培养体系。【方法】通过在线软件在BLIMP1基因终止密码子附近设计三对sg RNA,克隆进p X330载体。转染293FT细胞后,对基因组测序确定能够准确造成DNA双键断裂的sg RNA序列。同时我们构建了构建同源重组质粒,在BLIMP1基因5’端同源臂终止密码子前面连接一段T2A-m Kate2-Lox P-EF1a-neo-Lox P序列,然后再和BLIMP1基因3’端同源臂进行连接,并对与sg RNA同源DNA区域进行突变避免切割同源重组质粒。用Fugene6转染试剂同时转染sg RNA质粒和同源重组质粒至H1 ESCs中,第二天用50μg/ml G418筛选细胞10天,再传800个细胞至10 cm培养皿中获得单克隆细胞。用Collagenase IV消化单克隆至48孔板中,传代至24孔板后提取DNA用PCR法鉴定出正确插入的克隆。再转染CRE酶质粒去除G418抗性基因,同样用PCR方法鉴定出正确克隆并用Sanger测序确定没有点突变。流式细胞术鉴定敲入细胞系的多能性,并用目前报道的PGCLCs诱导体系对诱导培养基和细胞因子浓度进行优化,以获得诱导效率最高的PGCLCs诱导培养体系。用RT-q PCR检测诱导第四天EB（Embryoid Bodies）是否表达PGCs特异基因。【结果】在第一步敲入经PCR验证后,获得具有G418抗性的正常插入克隆3个,基因编辑成功率为12.5%。转染CRE酶去除G418抗性之后,阳性克隆为13个,Sanger测序未发现点突变,基因编辑成功率为46.4%。流式细胞术鉴定阳性细胞系仍表达POU5F1,SOX2,NANOG等多能性标记。通过GK15培养基预诱导42h之后再用500ng/ml BMP4和10 ng/ml LIF的a RB27培养基进行PGCLCs诱导能够将PGCLCs的诱导效率稳定在35%-60%。且第四天EB高表达BLIMP1,SOX17,TFAP2C,NANOS3等PGCs特异性基因。【结论】本部分通过CRISPR-Cas9基因编辑技术成功在PGCs特异基因BLIMP1终止密码子后敲入一个红色荧光基因,为体外诱导人多能干细胞向PGCs分化提供了实验平台。用该细胞系进一步优化现有的PGCLCs的诱导培养体系,获得了高效率的适合本实验室及细胞的PGCLCs诱导体系。第二部分TET基因敲除细胞系建立及其向PGCLCs诱导效率的差异【目的】多能干细胞在体外具有分化为体内所有细胞的能力包括生殖细胞,小鼠多能干细胞在体外已能够分化为卵子和精子样细胞,并能够在体外受精获得存活的后代。人原始生殖细胞是卵子和精子的祖细胞,其发育分化过程中会经历全基因组去甲基和重新甲基化的表观遗传重编程过程,而该过程主要由TET去甲基化酶负责,且这一过程主要在PGCs发育7周以前完成。而由于伦理和材料限制,7周以前的PGCs细胞几乎无法获得,所以体外模拟PGCs发育过程为了解表观遗传重编程机制提供了良好的实验材料。而h ESCs诱导的PGCs为我们研究早期生殖细胞表观遗传调控机制带来了新的途径。本部分实验通过CRISPR-Cas9基因编辑技术对TET基因家族进行敲除研究TET基因家族对PGCs诱导分化的影响。【方法】通过CRISPR-Cas9基因编辑技术在基因敲入H1 ESCs细胞系中对TET基因家族进行敲除,并用第一部分建立的BLIMP1-m Kate2荧光报告系统检测H1 ESCs在体外向PGCs分化过程中PGCLCs的诱导效率,研究TET基因家族对PGCs分化过程中表观遗传调控机制。Dot-blot检测各组细胞5hm C和5m C的含量,同时运用荧光定量PCR和免疫荧光染色检测PGCs特异性基因的表达。运用亚硫酸盐测序检测PGCs特化过程中关键基因SOX17和BLIMP1启动子区域甲基化水平。【结果】对TET基因家族进行敲除后我们发现TET2,TET3单独敲除及TET2/3同时敲除细胞对PGCLCs的诱导效率没有显着的影响。当有TET1敲除的组合包括TET1,TET1/2,TET1/3敲除后PGCLCs的诱导效率下降,并且TET1/2/3同时敲除的TKO（triple-knockout）细胞系在诱导第四天没有PGCLCs细胞。通过Dot-blot实验发现在有TET1基因敲除后h ESCs DNA中5hm C修饰显着下调,但不影响5m C的修饰水平,且PGCs分化过程中关键基因SOX17,BLIMP1,TFAP2C,NANOS3等表达量均低于未进行基因敲除的WT（wild type）细胞系,这些基因在TKO细胞系中的表达显着下调,而TET2和TET3及TET2/3同时敲除细胞系中这些基因的表达和WT组没有显着差异。TET2/3 DKO TET1基因杂合突变细胞系和WT组结果一致。免疫荧光染色结果和RT-q PCR结果相一致。亚硫酸盐测序发现TKO细胞系SOX17和BLIMP1基因启动子区域甲基化水平在ESCs状态和诱导第四天EB中均高于WT组。【结论】本部分实验通过体外PGCs的诱导,研究早期PGCs发育过程中表观遗传调控机制,发现TET去甲基化酶的缺失导致PGCs诱导过程中PGCs分化特异基因SOX17和BLIMP1启动子呈高甲基化状态使SOX17和BLIMP1的表达下调,ESCs无法向PGCs分化。因此TET基因家族在PGCs发育过程中对PGCs分化特异基因SOX17和BLIMP1具有重要的调控作用,且TET1基因在该过程中的作用最为重要。第三部分外源性及内源性SOX17和BLIMP1的过表达可重建TKO细胞系向PGCLCs诱导【目的】已有文献报道在多能干细胞中同时过表达SOX17和BLIMP1可促进PGCLCs的诱导分化,通过在TKO细胞系中使用化学小分子诱导的慢病毒方法启动外源SOX17和BLIMP1基因的表达;或运用d Cas9-TET1 CD技术改变SOX17和BLIMP1基因启动子甲基化水平启动内源性SOX17和BLIMP1的表达重建TKO细胞系向PGCLCs的诱导。【方法】构建doxycycline（DOX）和trimethoprim（TMP）诱导表达SOX17和BLIMP1的慢病毒质粒,病毒包装后感染TKO和WT细胞系,用G418和puromycin筛选后获得稳定细胞系。通过流式检测过表达SOX17和BLIMP1后PGCLCs的诱导效率,并用荧光定量PCR和免疫荧光染色进一步验证PGCs特异基因及蛋白的表达,亚硫酸盐测序检测SOX17和BLIMP1基因启动子区域甲基化水平。再构建DOX诱导稳定表达d Cas9-TET1 CD的TKO细胞系,并在SOX17和BLIMP1启动子区域设计sg RNA靶向位点,通过单独转染诱导后用RT-q PCR确定SOX17和BLIMP1表达量最高的sg RNA序列,并将筛选出的sg RNA构建为一条慢病毒质粒,病毒包装感染后筛选稳定细胞系。检测方法和直接过表达SOX17和BLIMP1部分一致。【结果】在WT细胞系中同时过表达SOX17和BLIMP1可高效率（90%）的获得PGCLCs细胞,在TKO细胞系中同时过表达SOX17和BLIMP1可以获得70%左右的PGCLCs细胞。荧光定量PCR显示TKO细胞系中内源性的SOX17和BLIMP1表达较低,均为外源性的SOX17和BLIMP1表达,但是其他PGCs特异性基因表达如NANOS3,TFAP2C,NANOG等均表达上调。而SOX17和BLIMP1启动子区域还是呈高甲基化状态。在PGCLCs诱导过程中在运用d Cas9-TET1 CD技术降低TKO细胞系中SOX17和BLIMP1启动子甲基化修饰之后也能诱导得到PGCLCs细胞。荧光定量PCR和免疫荧光染色结果显示SOX17,BLIMP1,TFAP2C等PGCs特异性基因表达升高,且SOX17和BLIMP1启动子区域甲基化修饰水平低于未加DOX的TKO细胞系,但是仍高于WT组从而导致诱导效率低于WT组。【结论】PGCs分化过程中TET基因家族对PGCs特异基因SOX17和BLIMP1启动子的表观遗传修饰调控了PGCs的分化,确定了DNA甲基化的表观遗传修饰和转录因子调控间的密切关系,也进一步确定了SOX17和BLIMP1在人PGCs分化过程中具有重要作用。第四部分鉴定SOX17和BLIMP1启动子甲基转移酶并敲除可重建TKO细胞系向PGCLCs诱导【目的】在第三部分我们发现在TKO细胞系中过表达或启动内源性SOX17和BLIMP1的表达能够重建PGCLCs的诱导,且因为TKO细胞系SOX17和BLIMP1基因启动子区域被甲基化从而抑制了PGCLCs的分化。人细胞内有三个对基因组DNA进行甲基化修饰的甲基化酶:DNMT1,DNMT3A和DNMT3B,我们通过Ch IP-q PCR和CRISPR-Cas9基因编辑技术在本部分探索对SOX17和BLIMP1基因启动子进行甲基化修饰的甲基转移酶,研究表观遗传调控对PGCs特化的作用。【方法】运用DNMT1,DNMT3A,DNMT3B抗体对WT和TKO细胞系SOX17和BLIMP1启动子区域进行Ch IP-q PCR检测,确定对SOX17和BLIMP1启动子区域进行甲基化的甲基转移酶。再用CRISPR-Cas9基因编辑技术对该酶进行敲除,获得QKO（quadruple-knockout）细胞系。将QKO细胞系向PGCLCs诱导,通过流式细胞术检测诱导效率,荧光定量PCR和免疫荧光染色检测PGCs特异性基因和蛋白的表达,Dot-blot检测5hm C和5m C的表达,亚硫酸盐测序检测PGCs特异性基因SOX17和BLIMP1启动子甲基化程度。【结果】Ch IP-q PCR结果显示DNMT3B为对SOX17和BLIMP1启动子区域进行甲基化的甲基转移酶,在TKO细胞系中对DNMT3B基因进行敲除后能够部分恢复PGCLCs的诱导,且PGCs特异性基因表达均上调。免疫荧光染色结果也显示PGCs特异性标记在QKO细胞诱导的PGCLCs中有表达。Dot-blot结果显示QKO细胞系5hm C和TKO细胞系一致仍显着低于WT组,5m C在WT,TKO,QKO三组细胞系之间没有明显差异。亚硫酸盐测序结果显示在PGCs诱导第四天EB中,SOX17和BLIMP1启动子区域甲基化水平在QKO细胞中较TKO细胞降低,但是仍高于WT组。【结论】在PGCs特化过程中,TET去甲基化酶将SOX17和BLIMP1基因启动子去甲基化从而使细胞向PGCs方向发育,DNMT3B甲基化酶则负责对SOX17和BLIMP1基因启动子进行甲基化,抑制细胞向PGCs方向发育。本部分实验研究了PGCs分化过程中表观遗传修饰对转录因子的调控作用,使我们更加全面的了解PGCs分化的调控机制。
徐辰泽[9]（2020）在《小鼠胚胎干细胞诱导分化为胚胎睾丸支持样细胞方法和分子机理研究》文中认为胚胎睾丸支持细胞（embryonic Sertoli cells,eSCs）是雄性胚胎发育过程中形成的第一种雄性特异性细胞,对性别决定具有至关重要的作用,并且分泌多种营养物质,能够对其它种类细胞,如精原干细胞（spermatogonia stem cells,SSCs）起到支持扩增或分化等功能。因此,对胚胎睾丸支持细胞发育形成机理进行研究有助于揭示胚胎性腺发育和性别决定机制,为将来的临床应用提供指导作用。然而,采用常规的组织分离方法从小鼠雄性胚胎中难以大量提取胚胎睾丸支持细胞,阻碍了对胚胎睾丸支持细胞的基础理论研究和实验应用。因此,建立新的胚胎睾丸支持细胞的体外诱导获取方法具有重要意义。近年来,有研究添加维甲酸（retinoic acid,RA）和激活素A（ActivinA）等物质,诱导小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）分化形成中间中胚层（intermediate mesoderm,IM）来源细胞,再通过卵泡刺激素（follicle stimulating hormone,FSH）等蛋白因子化合物诱导胚胎睾丸支持样细胞（embryonic Sertoli-like cells,eSLCs）的形成。然而,这种诱导分化方法的分化途径和分子机制仍未阐明。另有研究将成纤维细胞进行基因重编程,通过转分化方式诱导出胚胎睾丸支持样细胞,表明5种发育相关因子Wt1、Gata4、Sf1、Sox9和Dmrt1的表达可能对胚胎睾丸支持细胞的形成具有重要功能。因此,本论文根据以上小鼠胚胎睾丸支持样细胞的诱导方法,结合已知的胚胎睾丸支持细胞在体内的发育途径和分子机理,首先在体外诱导小鼠胚胎干细胞分化形成中间中胚层来源细胞,接着通过对Wt1、Gata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1这6种发育相关因子分别进行时序性调控表达,成功诱导形成小鼠胚胎睾丸支持样细胞,建立了一种新的小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型。主要结果如下:一、比较并建立了小鼠胚胎干细胞培养和分化诱导方法。为提供分化潜能状态良好的大量小鼠胚胎干细胞,研究比较了不同滋养层和培养条件,结果表明采用TM4细胞来源的条件培养基和小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts,MEF）滋养层进行培养,提高了小鼠胚胎干细胞复苏后的聚集和增殖能力。为建立合适的小鼠胚胎干细胞诱导方法,本研究首先根据已知方法通过添加维甲酸和激活素A诱导小鼠胚胎干细胞向中间中胚层来源细胞进行分化。接着,针对Wt1、Gata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1这6种发育相关因子,比较了直接在细胞中进行转录表达调控和添加外源重组蛋白两种方法的诱导效果。结果表明通过慢病毒介导的转录表达调控方法更能有效诱导潜在的小鼠胚胎睾丸支持细胞祖细胞,即体腔上皮样细胞（coelomic epithelial-like cells）（CK18+）和性腺发育相关细胞（AMH+）的分化形成。二、建立了小鼠胚胎干细胞向小鼠胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型。为了在体外模拟出体内小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持细胞的发育途径,研究根据小鼠胚胎中雄性性腺细胞的发育规律,在小鼠胚胎干细胞向中间中胚层来源细胞诱导分化后,采用四环素启动子和光控启动子控制Wt、G1ata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1这6种发育相关因子进行时序性表达,并在诱导14天后鉴定出有潜在的胚胎睾丸支持样细胞（FSHR+/AMH+）形成。通过细胞形态学、特异性标志物的蛋白表达和标志性基因的转录表达,鉴定和分析了小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞诱导分化的过程。结果表明:小鼠胚胎干细胞在0-8.5天分化形成中间中胚层来源细胞;在9.5-11.5天从中间中胚层来源细胞中分化形成体腔上皮体细胞样细胞（coelomic epithelial somatic-like cells）;在11.5-12.5天体腔上皮体细胞样细胞分化为SF1阳性前体样细胞（SF1-positive precursor-like cells,SPLCs）,并发育为 SF1 阳性性腺前体样细胞（SF1-positive gonadal precursor-like cells,SGPLCs）;在12.5天之后SF1阳性性腺前体样细胞发育形成胚胎睾丸支持样细胞;在12.5-14.5天,胚胎睾丸支持样细胞形成环状结构;在14.5天之后,细胞组成的环状结构继续发育为管束状结构,与小鼠睾丸生精小管骨架结构相似。这些结果显示,建立的小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化过程与已知的小鼠胚胎内性腺发育和细胞分化途径相似。三、初步鉴别6种发育相关因子对小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞分化途径的诱导作用。研究通过对6种发育相关因子Wt1、Gata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1的表达调控进行组合,利用不同细胞的特异性标志物进行鉴定,初步鉴别出这些因子对小鼠胚胎干细胞诱导分化途径的影响。结果表明Wt1和Gata4拘调控表达与分化形成体腔上皮体细胞样细胞有关;Sf1基因的表达与SF1阳性前体样细胞和SF1阳性性腺前体样细胞的形成相关;Sry和Sox9基因在诱导作用上表现相似,与SF1阳性性腺前体细胞向雄性分化决定的过程相关;Dmrt1基因的表达影响到胚胎睾丸支持样细胞形成的细胞数量。四、基于小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型,研究不同发育分化阶段的分子机理。为了探索小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化机理,研究将分化过程分为三个阶段:（1）体腔上皮体细胞样细胞、SF1阳性前体样细胞和SF1阳性性腺前体样细胞的分化形成阶段;（2）SF1阳性性腺前体样细胞向胚胎睾丸支持样细胞的分化阶段;（3）胚胎睾丸支持样细胞发育维持阶段。分子机制主要采用慢病毒转染方法调控目标因子进行过表达,或采用CRISPR/Cas9敲除（knock out,KO）方法抑制目标因子的表达来进行研究。结果显示:（1）Wt1基因的过表达有利于激活体腔上皮组织发育相关基因,并上调Gata4和Sf1的转录表达。Gata4能激活功能因子Lhx9进行表达。Wt1和Gata4可能对体腔上皮体细胞样细胞和SF1阳性前体样细胞分化形成具有重要作用;（2）Sf1能激活Amh、Amhr2、Insl3、Dax1等因子的表达,并促进体腔上皮体细胞样细胞向SF1阳性前体细胞的分化发育。另外,Sf1基因的表达可能对细胞的上皮样向间质样形态转变（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）、迁移和聚集能力具有影响。Sf1无法单独激活雄性分化决定关键因子Sry和Sox9的表达。然而,Sf1的表达缺失将阻碍雄性分化决定过程;（3）Sry和Sox9是雄性分化决定的关键基因。Sry的过表达能激活Sox9进行表达,然而Sox9的过表达无法单独激活Sry进行表达。Sry或Sox9的过表达能激活一些相似的雄性分化决定相关下游基因,促进SF1阳性性腺前体样细胞向胚胎睾丸支持样细胞进行诱导分化。在Sry和Sox9不表达的情况下,SF1阳性性腺前体样细胞可能发生雌性分化决定过程,向卵巢支持样细胞（ovarian supporting-like cell）（AMH+/WNT4+）进行分化发育;（4）Dmrt1的过表达能激活Amh、Ptgds、Fgt9、Gdnf等雄性发育相关的功能因子,抑制Wnt4、Foxl2等雌性分化决定因子,从而帮助维持雄性发育过程、保持胚胎睾丸支持样细胞的生理特性、促进其形成生精小管的组织结构、并避免发生睾丸支持样细胞向卵巢支持样细胞的转化。五、诱导胚胎睾丸支持样细胞的功能成熟,并检验其生理特性和生精滋养功能。为验证这些诱导胚胎睾丸支持样细胞是否具有与天然胚胎睾丸支持细胞相似的潜在生理功能和特性,实验先采用包含睾酮等物质的条件培养基促进诱导形成的小鼠胚胎睾丸支持样细胞的发育和功能成熟,再通过流式细胞分选后用于小鼠睾丸组织的细胞移植试验和精原干细胞共培养试验。结果显示,在小鼠睾丸生精小管移植实验中,注入的睾丸支持样细胞能够与小鼠自身睾丸细胞相融合、分散生长、并无明显成瘤性,与阳性对照组中异源小鼠睾丸提取的成熟睾丸支持细胞的移植结果相似,表明这些诱导睾丸支持样细胞的生理特性接近于天然形成的成熟睾丸支持细胞;在精原干细胞共培养试验中,诱导睾丸支持样细胞能够滋养精原干细胞发育为雄性配子样细胞,表明诱导出的睾丸支持样细胞具备一定的生殖细胞滋养功能。综上,本论文建立了一种小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型,并基于模型研究了相关的分子机理,为胚胎发育学、性别决定机理和临床应用提供了研究基础和技术平台。
王璐[10]（2019）在《淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究》文中研究指明干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞,具有十分广阔的应用前景,已被广泛应用至多种疾病的临床研究中,但是临床上移植入体内的干细胞存活率低,限制了其推广应用。因此,亟需新的治疗策略改进干细胞抵御体内恶劣微环境的能力。天然药物独具优势,前期实验发现淫羊藿素（icaritin,ICT）预处理后的人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）治疗急性肝衰竭大鼠,死亡率进一步降低,肝脏病理、肝功能得到进一步改善,但是内在机理尚不清楚。预实验发现ICT可以增加体外培养的hUC-MSCs的细胞活力,调节多种细胞因子的分泌,并减少细胞的凋亡,电镜下可见ICT减少了自噬小体包裹的线粒体数量,因此,本研究将从细胞凋亡与线粒体自噬入手,探索淫羊藿素影响人脐带间充质干细胞的机制,为中药联合干细胞疗法提供理论依据。目的:本研究首先通过文献综述,为实验提供理论支持;随后在体外采用无血清培养部分模拟体内微循环障碍的环境,使用ICT干预hUC-MSCs,探索其是否具有抗凋亡作用,并深入研究是否通过HGF（肝细胞生长因子）/c-Met通路发挥作用;观察ICT能否干预hUC-MSCs的线粒体自噬过程;同时采用蛋白质谱,分析ICT预处理后的hUC-MSCs的差异表达蛋白,并进行GO分析、KEGG分析、蛋白互作分析等生物信息学分析,评估淫羊藿素参与的生物学过程。方法:人脐带间充质干细胞无血清培养72小时作为基本的造模方式,模拟微循环障碍的体内环境。不同浓度的ICT干预造模细胞,用MTS法测定其0D值,筛选最佳处理浓度。BrdU掺入试验检测Control组（正常培养组）、Serum free组（无血清培养组）、ICT组（淫羊藿素组）、HGF组（肝细胞生长因子组）的细胞增殖率。ELISA法检测ICT促进hUC-MSCs的HGF分泌情况。WB与qRT-PCR法检测ICT影响hUC-MSCs的c-Met受体表达情况。转染构建c-Met+MSCs,通过qRT-PCR和WB检验其转染效率。使用CCK8法筛选c-Met受体抑制剂克唑替尼（crizotinib）的最佳作用浓度。采用AnnexinV-FITC/PI凋亡检测,评估各组细胞凋亡率。qRT-PCR与WB检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3、Bax的表达。MTS法检测不同浓度的自噬抑制剂3MA对造模细胞的影响。使用qRT-PCR、WB以及免疫荧光显微镜检测线粒体外膜蛋白tomm20、线粒体内膜蛋白timm23、线粒体基质蛋白细胞色素c氧化酶亚基II（MT-C02）、自噬相关蛋白LC3B的表达情况。透射电镜观察各组细胞的超微结构,重点观察其线粒体自噬水平。采用qRT-PCR筛选ICT干预hUC-MSCs线粒体自噬的相关通路。使用JC-1膜电位检测试剂盒检测膜电位情况。采用蛋白质谱进行各组细胞差异蛋白的生物信息学分析。结果:1.不同浓度的淫羊藿素处理无血清培养hUC-MSCs,各处理浓度均提高了其细胞活力,但是仅50ng/ml（0.1uM）、100ng/ml具有统计学意义（P<0.05）。选择50ng/ml为最佳处理浓度进行后续实验。BrdU检测显示较Control组,Serum free组增殖率下降（P<0.05）,而使用ICT或者HGF均提高了细胞增值率（P<0.05）。2.人脐带间充质干细胞本身可分泌HGF,也表达HGF的受体c-Met,而ICT能够促进其表达更高水平的HGF与c-Met受体（P<0.05）。构建c-Met+MSCs后,WB与qRT-PCR法证实了基因转染成功。根据细胞抑制率,筛选4 u M为克唑替尼（c-Met受体抑制剂）的最佳处理浓度。MSCs在无血清培养72h时凋亡率较高,c-Met+MSCs的细胞凋亡率显着降低（P<0.01）,克唑替尼处理后,细胞凋亡率显着增高（P<0.01）,提示HGF/c-Met通路对于MSCs具有抗凋亡作用。WB显示,对比MSCs组,c-Met+MSCs组Bcl-2的表达上调且Cleaved caspase-3、Bax表达下调（P<0.05）,克唑替尼则使Bcl-2蛋白水平降低,Cleaved caspase-3和Bax蛋白表达增加,qRT-PCR验证了上述结论。提示HGF/c-Met通路通过调控凋亡蛋白的表达发挥抗凋亡作用。3.MSCs在无血清培养72h时凋亡率较高,ICT或HGF处理后,MSCs凋亡率显着降低（P<0.05）。当使用c-Met受体抑制剂克唑替尼时,拮抗了 ICT的抗凋亡作用,差异有统计学意义（P<0.01）。这表明克唑替尼可以抑制ICT对MSCs的保护作用,ICT对MSCs的抗凋亡作用与HGF/c-Met通路相关。WB显示,ICT或HGF处理后的MSCs的Bcl-2表达上调且Cleaved caspase-3、Bax表达下调（P<0.05）,对比ICT组,加用克唑替尼后可使Bcl-2蛋白水平降低,使Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表达增加,qRT-PCR验证了上述结论。提示ICT通过HGF/c-Met通路调控凋亡蛋白的表达发挥抗凋亡作用。4.低浓度的自噬抑制剂3-MA对造模细胞的活性具有促进作用（P<0.05）,而高浓度的自噬抑制剂3-MA抑制了细胞活性（P<0.01）。提示无血清培养条件下,适度的抑制细胞自噬有利于细胞的存活,而过度的抑制细胞自噬则会降低细胞活力,不利于细胞存活。5.与Control组比较,Serum free组MSCs的线粒体外膜蛋白tomm20、线粒体内膜蛋白timm23、线粒体基质蛋白细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ（MT-C02）均会减少,自噬蛋白LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表达均增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率提高,线粒体膜电位降低,提示线粒体自噬水平被上调,电镜可见细胞内“线粒体自噬体”（被自噬小体包裹的线粒体）显着增多,损伤线粒体增加,细胞形态不佳,证实了无血清培养增加了线粒体自噬;而ICT或者HGF干预后上述线粒体蛋白表达增加,自噬蛋白LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表达均减少,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率降低,线粒体膜电位升高,提示线粒体自噬水平被下调。电镜可见胞内“线粒体自噬体”减少,损伤线粒体减少,细胞形态得到一定的改善,证实了ICT和HGF均减少了线粒体自噬。6.采用qRT-PCR进行Pink1/Parkin通路,FUNDC1通路以及Bnip3/Nix通路的筛选,结果如下:Pink1、Bnip3的mRNA与前述线粒体自噬趋势相符,Nix、FUNDC1的mRNA呈现出相矛盾的趋势。7.蛋白质谱分析:通过GO分析,发现Control组与Serum free组的差异蛋白,以及ICT组与Serum-free组之间,HGF组与Serum free组之间的差异蛋白,均参与细胞凋亡、自噬、线粒体自噬相关的生物过程（P<0.05）。对ICT组与Serum free组的差异蛋白进行分析,AKT1位于蛋白互作中心节点位置,KEGG分析PI3K-AKT通路具有统计学意义,可作为研究的重点通路。对于HGF组与Serum free组之间的差异蛋白进行分析,筛选出NF-κ B通路作为研究重点通路。结论:1.淫羊藿素能够通过HGF/c-Met通路降低无血清培养的人脐带间充质干细胞的凋亡率,与调节Cleaved Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表达水平有关。2.淫羊藿素或肝细胞生长因子均可降低无血清培养的人脐带间充质干细胞的线粒体自噬水平,减少损伤线粒体数目,改善细胞形态,增加线粒体蛋白tomm20、timm23、MTC02的表达,提高线粒体膜电位。3.蛋白质谱分析发现淫羊藿素或肝细胞生长因子介导的差异蛋白参与细胞凋亡、自噬、线粒体自噬相关的生物过程,对于ICT,PI3K-AKT通路可作为研究重点通路,对于HGF,NF-κ B通路可作为研究重点。
二、体外诱导人胚胎干细胞向神经细胞分化的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、体外诱导人胚胎干细胞向神经细胞分化的研究进展（论文提纲范文）
（1）促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 诱导多能干细胞的研究进展 |
| 2.1.1 体细胞重编程的机制 |
| 2.1.2 多能干细胞由不同信号通路调节 |
| 2.1.3 提高体细胞重编程效率的研究 |
| 2.2 家畜诱导多能干细胞的研究现状 |
| 2.2.1 猪诱导多能干细胞 |
| 2.2.2 绵羊和山羊诱导多能干细胞 |
| 2.2.3 牛诱导多能干细胞 |
| 2.3 miRNAs与多能干细胞 |
| 2.3.1 miRNA简介及生物学功能 |
| 2.3.2 miRNA在多能干细胞中的作用 |
| 2.3.3 miRNAs促进体细胞重编程 |
| 2.4 多能干细胞定向分化原始生殖细胞的研究进展 |
| 2.4.1 形成原始生殖细胞的关键因子和基因 |
| 2.4.2 ESC/iPSC定向分化原始生殖细胞的途径 |
| 2.4.3 ESC/iPSC体外诱导分化为生殖细胞的培养体系 |
| 3 研究内容 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 促进绵羊体细胞重编程miRNAs的筛选研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物和细胞 |
| 1.1.2 主要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂耗材 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 绵羊肾细胞(SKC)分离培养及鉴定 |
| 1.2.2 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离培养与饲养层细胞制作 |
| 1.2.3 促绵羊体细胞重编程miRNAs的初步筛选 |
| 1.2.4 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 1.2.5 慢病毒包装 |
| 1.2.6 慢病毒收集及病毒滴度测定 |
| 1.2.7 miRNAs促绵羊肾上皮细胞重编程效率比较 |
| 1.2.8 siPSC的鉴定 |
| 1.2.9 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊体细胞的分离纯化 |
| 2.2 MEF细胞分离培养及饲养层细胞的制备 |
| 2.3 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 2.4 成功包装各类慢病毒 |
| 2.5 促绵羊SKC重编程的miRNAs筛选 |
| 2.5.1 慢病毒成功感染SKC |
| 2.5.2 比较不同miRNA诱导绵羊SKC的效率 |
| 2.5.3 miR-200c-141+8因子诱导绵羊iPSC |
| 2.6 由miR-200c-141促进重编程获得的siPSC的多能性鉴定 |
| 2.6.1 AP染色鉴定 |
| 2.6.2 细胞免疫荧光技术鉴定siPSC中多能性蛋白因子表达 |
| 2.6.3 qPCR鉴定siPSC中多能性因子基因转录 |
| 2.6.4 siPSC中多能基因Nanog启动子甲基化分析 |
| 2.6.5 siPSC核型分析 |
| 2.6.6 siPSC向拟胚体(EB)三胚层分化鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 绵羊iPSC的特征及诱导效率 |
| 3.2 miRNA提高干细胞诱导效率 |
| 4 小结 |
| 试验二 miR-200c提高羊体细胞重编程机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 miR-200c靶蛋白的预测 |
| 1.2.2 合成绵羊miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照 |
| 1.2.3 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 1.2.4 双荧光素酶报告基因分析miR-200c靶基因 |
| 1.2.5 实时荧光定量PCR检测miR-200c靶基因的m RNA水平 |
| 1.2.6 Western blot检测miR-200c靶基因的蛋白水平 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 miR-200c靶基因的预测 |
| 2.2 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 2.2.1 靶基因ZEB1和TWISTNB3’UTR区扩增测序 |
| 2.2.2 靶基因双荧光素酶报告载体的构建 |
| 2.3 靶基因双荧光素酶报告系统分析 |
| 2.4 实时荧光定量PCR检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin转录水平 |
| 2.5 Western blot检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin蛋白表达水平 |
| 3 讨论 |
| 3.1 TGF-β信号通路与细胞重编程 |
| 3.2 miRNA提高重编程的机制 |
| 4 小结 |
| 试验三 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 1.2.2 PLVX-Dazl和 PLVX-Boule的慢病毒包装 |
| 1.2.3 慢病毒滴度测定 |
| 1.2.4 绵羊卵巢细胞的分离培养 |
| 1.2.5 绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞样细胞(PGCLC) |
| 1.2.6 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞鉴定 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 2.1.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE的扩增 |
| 2.1.2 成功构建绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体 |
| 2.1.3 成功包装慢病毒LV-DAZL和 LV-BOULE |
| 2.2 绵羊卵巢细胞分离培养 |
| 2.3 稳转DAZL和 BOULE基因siPSC的建立 |
| 2.4 原始生殖细胞样细胞(PGCCL)的鉴定 |
| 2.4.1 绵羊PGC样细胞的分化条件和过程 |
| 2.4.2 细胞免疫荧光技术检测绵羊PGC样细胞 |
| 2.4.3 实时定量RT-PCR验证绵羊PGC样细胞 |
| 3 讨论 |
| 3.1 原始生殖细胞与多能干细胞 |
| 3.2 体外重构原始生殖细胞的方法 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（2）基于人头发丝支架的体外三维心肌组织的构建及其收缩性能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 心血管疾病的研究现状 |
| 1.1.1 心血管疾病的发病原因及危害 |
| 1.1.2 心血管疾病的治疗及面临的挑战 |
| 1.2 干细胞 |
| 1.2.1 干细胞概述 |
| 1.2.2 胚胎干细胞 |
| 1.2.3 成体干细胞 |
| 1.2.4 诱导多能干细胞 |
| 1.3 心脏组织工程 |
| 1.3.1 体外心肌细胞的来源 |
| 1.3.2 生物材料支架在心脏组织工程方面的应用 |
| 1.3.3 力的测量在心脏组织工程方面的应用 |
| 1.4 本论文的主要研究工作 |
| 参考文献 |
| 第二章 体外诱导人诱导多能干细胞向心肌细胞方向分化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 人诱导多能干细胞的培养及表征 |
| 2.2.3 小分子诱导人诱导多能干细胞向心肌细胞方向分化 |
| 2.2.4 心肌分化试剂盒诱导人诱导多能干细胞向心肌细胞方向分化 |
| 2.2.5 心肌细胞的表征 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 人诱导多能干细胞的形态特征 |
| 2.3.2 小分子诱导分化所得的心肌细胞的形态及收缩性能 |
| 2.3.3 心肌分化试剂盒诱导分化所得的心肌细胞的形态及收缩性能 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于人头发丝的三维平台用于体外工程化心肌组织的长期培养 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 人头发丝的形态表征 |
| 3.2.3 心肌细胞的形态表征 |
| 3.2.4 基于人头发丝的三维细胞培养平台的搭建 |
| 3.2.5 基于人头发丝平台的体外工程化心肌组织的构建及长期培养 |
| 3.2.6 体外工程化心肌组织的表征 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 人头发丝的微观形态 |
| 3.3.2 心肌细胞的形态 |
| 3.3.3 体外工程化心肌组织的形态随时间的变化 |
| 3.3.4 体外工程化心肌组织的收缩性能随时间的变化 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 基于人头发丝弹簧的三维平台用于体外心肌组织的培养 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 人头发丝弹簧的制备 |
| 4.2.3 两种基于人头发丝弹簧的三维平台的搭建 |
| 4.2.4 基于人头发丝弹簧的体外心肌组织的构建与培养 |
| 4.2.5 基于人头发丝弹簧的体外工程化心肌组织的收缩性能的表征 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 基于人头发丝弹簧的支架的制备 |
| 4.3.2 基于人头发丝弹簧的体外工程化心肌组织的构建 |
| 4.3.3 基于人头发丝弹簧的体外工程化心肌组织的收缩性能 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 人头发丝弹簧用于体外心肌组织收缩力测量的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂与仪器 |
| 5.2.2 不同直径和不同长度的人头发丝弹簧的制备 |
| 5.2.3 人头发丝弹簧的弹性系数的测量 |
| 5.2.4 人头发丝弹簧的循环拉伸试验 |
| 5.2.5 人头发丝弹簧的结构变化表征 |
| 5.2.6 基于人头发丝弹簧的心肌细胞收缩力的测量装置的搭建 |
| 5.2.7 体外工程化心肌组织的培养及其收缩力的测量 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 不同直径和不同长度的人头发丝弹簧的制备 |
| 5.3.2 不同直径和不同长度的人头发丝弹簧的弹性系数测量结果 |
| 5.3.3 人头发丝弹簧的结构变化 |
| 5.3.4 人头发丝弹簧的1000 次循环拉伸试验结果 |
| 5.3.5 人头发丝弹簧用于体外工程化心肌组织的收缩力测量的结果 |
| 5.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 论文总结 |
| 6.2 论文的创新点 |
| 6.3 论文的后续工作及展望 |
| 攻读博士学位期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（3）mTOR信号通路在人脐带血造血干/祖细胞红系定向分化中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 输血治疗的重要性及面临的挑战 |
| 1.2 体外制备的红细胞的研究现状 |
| 1.3 自噬是红细胞最终成熟的主要机制 |
| 1.4 自噬与红系分化 |
| 第二章 材料及方法 |
| 2.1 实验仪器及设备 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 器械的处理 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 统计学方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 体外诱导人脐带血造血干祖细胞向红细胞定向分化体系的建立 |
| 3.2 雷帕霉素对人脐带血造血干细胞红系分化早期增殖的影响及机制 |
| 3.3 雷帕霉素对人脐带血造血干细胞红系分化中晚期分化和成熟的影响及机制 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 无血清、无饲养层体系体外诱导人脐血CD34+细胞生成红细胞 |
| 4.2 mTOR在人脐带血来源造血干细胞红系定向分化早期增殖阶段的重要作用 |
| 4.3 mTOR与人脐带血造血干细胞红系定向分化进程 |
| 4.4 mTOR在人脐带血来源造血干细胞红系定向分化中晚期与红细胞成熟的关系 |
| 4.5 总结和展望 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 自噬调控红细胞成熟 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）糖胺聚糖类似物及光热纳米材料协同诱导胚胎干细胞神经分化的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 胚胎干细胞神经分化在神经系统疾病治疗中的应用 |
| 1.2 胚胎干细胞神经分化的诱导方法 |
| 1.3 利用糖胺聚糖类似物诱导胚胎干细胞神经分化的研究 |
| 1.4 利用视黄酸传输诱导胚胎干细胞神经分化的研究 |
| 1.5 课题的提出 |
| 1.5.1 研究目的与意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 糖胺聚糖类似物改性光热金纳米粒子双路径协同促进胚胎干细胞神经分化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 不同分子量巯基化糖胺聚糖类似物的合成 |
| 2.2.4 糖胺聚糖类似物改性金纳米复合物的制备及表征 |
| 2.2.5 细胞培养 |
| 2.2.6 改性金纳米复合物对小鼠胚胎干细胞活性的影响 |
| 2.2.7 改性金纳米复合物表面化学成分对小鼠胚胎干细胞神经分化效率的影响 |
| 2.2.8 改性金纳米复合物光热效应对小鼠干细胞神经分化的影响 |
| 2.2.9 金纳米粒子复合物和FGF2结合实验 |
| 2.2.10 金纳米粒子光热效应对培养基中视磺酸浓度的影响 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 糖胺聚糖类似物的合成及表征 |
| 2.3.2 糖胺聚糖类似物改性金纳米复合物的制备 |
| 2.3.3 糖胺聚糖类似物改性金纳米复合物对小鼠胚胎干细胞生长的影响 |
| 2.3.4 糖胺聚糖类似物改性金纳米复合物表面化学成分对小鼠胚胎干细胞神经分化效率的影响 |
| 2.3.5 糖胺聚糖类似物改性金纳米复合物的光热效应及对细胞活性的影响 |
| 2.3.6 糖胺聚糖类似物改性光热金纳米复合物对小鼠胚胎干细胞神经分化效率和纯度的影响 |
| 2.3.7 糖胺聚糖类似物改性光热金纳米复合物促进胚胎干细胞神经分化的机理探究 |
| 2.4 本章小节 |
| 第三章 基于静电纺丝支架材料研究糖胺聚糖类似物及光热金纳米材料对胚胎干细胞神经分化的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 金纳米棒的合成及表征 |
| 3.2.4 同轴静电纺丝制备包载糖胺聚糖类似物的支架材料 |
| 3.2.5 含金纳米棒静电纺丝支架材料的制备及表征 |
| 3.2.6 细胞培养 |
| 3.2.7 含金纳米棒静电纺丝支架材料的光热效应及激光照射条件的筛选 |
| 3.2.8 糖胺聚糖类似物和光热金纳米棒的协同效应促进胚胎干细胞的神经分化 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 金纳米棒的表征 |
| 3.3.2 同轴静电纺丝制备包载糖胺聚糖类似物支架材料的表征 |
| 3.3.3 含金纳米棒静电纺丝材料光热效应的表征 |
| 3.3.4 激光照射条件对含金纳米棒静电纺丝材料形态的影响 |
| 3.3.5 纺丝材料糖胺聚糖类似物和金纳米棒的光热效应对神经分化的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 论文总结及展望 |
| 4.1 论文总结 |
| 4.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 硕士论文工作期间科研成果与奖励 |
| 致谢 |
（5）葛根素诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 间充质干细胞适用于心血管疾病治疗的特性及其发挥作用的机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）人诱导多能干细胞向成骨样细胞逐步诱导分化的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 骨与骨的发育 |
| 1.2 骨缺损与骨再生 |
| 1.3 干细胞在骨组织工程中的应用研究现状 |
| 1.4 人多能干细胞体外成骨分化研究 |
| 1.4.1 拟胚体法成骨分化研究 |
| 1.4.2 单层法成骨分化研究 |
| 1.4.3 人多能干细胞逐步成骨分化研究 |
| 1.5 选题依据与研究目标 |
| 1.5.1 研究对象 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 研究目标 |
| 第二章 拟胚体悬浮培养时间影响hiPSCs体外成骨分化效率的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 hiPSCs的培养 |
| 2.3.2 拟胚体的形成和悬浮培养 |
| 2.3.3 拟胚体的体外成骨分化 |
| 2.3.4 细胞RNA的提取和反转录 |
| 2.3.5 荧光定量PCR |
| 2.3.6 茜素红染色和定量实验 |
| 2.3.7 免疫荧光实验 |
| 2.3.8 碱性磷酸酶染色 |
| 2.3.9 统计学分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 hiPSCs来源的拟胚体的自发分化过程分析 |
| 2.4.2 拟胚体的悬浮时间对hi PSCs成骨分化效率的影响分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 hiPSCs起始分化密度影响单层法成骨分化效率的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 hiPSCs的培养 |
| 3.3.2 单层法诱导hi PSCs体外成骨分化 |
| 3.3.3 细胞活性检测 |
| 3.3.4 茜素红染色和定量实验 |
| 3.3.5 细胞RNA的提取和反转录 |
| 3.3.6 荧光定量PCR |
| 3.3.7 免疫荧光实验 |
| 3.3.8 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 hiPSCs成骨分化过程中的细胞形貌及细胞活性分析 |
| 3.4.2 起始分化密度对hiPSCs成骨分化效率的影响分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 利用化合物诱导hPSCs经中外胚层向成骨样细胞分化的初步研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 人多能干细胞的培养 |
| 4.3.2 化合物诱导人多能干细胞向中胚层分化 |
| 4.3.3 诱导人多能干细胞经中胚层后继续成骨分化 |
| 4.3.4 细胞RNA的提取和反转录 |
| 4.3.5 荧光定量PCR |
| 4.3.6 细胞活性检测 |
| 4.3.7 流式细胞术检测 |
| 4.3.8 茜素红染色和定量实验 |
| 4.3.9 统计学分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 不同化合物在D0-D2 阶段作用对h PSCs成骨分化效率的影响分析 |
| 4.4.2 不同化合物在D3-D5 阶段作用对h PSCs成骨分化效率的影响分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
| 附病例 |
（7）猪诱导多能性干细胞定向分化为血管内皮细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 血管内皮细胞与心血管疾病 |
| 1.1.1 血管内皮细胞的发生 |
| 1.1.2 血管内皮细胞的病变与心血管疾病 |
| 1.1.3 心血管疾病的治疗现状 |
| 1.2 多能性干细胞 |
| 1.2.1 多能性干细胞的分类和特征 |
| 1.2.2 多能性干细胞应用的前景和挑战 |
| 1.3 多能性干细胞向血管内皮细胞的定向分化 |
| 1.3.1 多能性干细胞向血管内皮细胞定向分化的研究进展 |
| 1.3.2 多能性干细胞向血管内皮细胞定向分化的鉴定 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及材料 |
| 2.1.2 主要仪器及设备 |
| 2.1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 常用试剂及配制方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 病毒包装 |
| 2.2.3 猪诱导多能性干细胞的建系 |
| 2.2.4 细胞多能性鉴定 |
| 2.2.5 Realtime-PCR检测 |
| 2.2.6 猪多能性干细胞向血管内皮细胞的诱导分化 |
| 2.2.7 流式细胞分选 |
| 2.2.8 血管内皮细胞的功能鉴定 |
| 2.2.9 数据统计与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪多能性干细胞的获得及鉴定 |
| 3.1.1 猪诱导多能性干细胞的获得及鉴定 |
| 3.1.2 猪多能性干细胞的培养及鉴定 |
| 3.2 不同来源的猪多能性干细胞向中胚层分化潜能的比较 |
| 3.2.1 不同来源的猪多能性干细胞向中胚层诱导过程中的形态比较 |
| 3.2.2 不同来源的猪多能性干细胞向中胚层诱导过程中谱系标记基因的表达比较 |
| 3.3 piPSCs向中胚层分化的诱导体系的筛选 |
| 3.4 piPSCs向血管内皮细胞诱导分化体系的建立 |
| 3.4.1 不同处理对piPSCs向中胚层分化过程中谱系标记基因表达的影响 |
| 3.4.2 不同处理对piPSCs向血管内皮细胞分化效率的影响 |
| 3.4.3 piPSCs来源的血管内皮细胞(pi PSC-ECs)的鉴定 |
| 3.5 piPSCs和 h ESCs向血管内皮细胞分化进程的比较 |
| 3.5.1 piPSCs和 h ESCs向中胚层分化过程中谱系标记基因的表达比较 |
| 3.5.2 piPSCs和 h ESCs向血管内皮细胞分化效率的比较 |
| 3.5.3 pi PS-ECs和 h ES-ECs的形态、基因表达和体外功能的比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 不同来源的猪多能性干细胞向中胚层的分化潜能 |
| 4.2 猪多能性干细胞向中胚层分化的调控 |
| 4.3 猪诱导多能性干细胞来源的血管内皮细胞的鉴定 |
| 4.4 多能性干细胞向血管内皮细胞诱导分化体系的物种特异性 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（8）人多能干细胞向原始生殖细胞诱导及表观遗传调控机制的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 构建 H1 ESCs 荧光报告细胞系并优化 PGCLCs 诱导效率 |
| 1 前言 |
| 2 材料(对象)与方法 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 实验细胞和质粒 |
| 2.1.2 实验试剂和耗材 |
| 2.1.3 实验试剂配置 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 胚胎干细胞培养 |
| 2.2.2 基因敲入质粒构建 |
| 2.2.3 多能干细胞转染 |
| 2.2.4 单克隆细胞筛选 |
| 2.2.5 基因敲入细胞系PCR及 Sanger测序鉴定 |
| 2.2.6 流式细胞术鉴定基因敲入细胞系多能性 |
| 2.2.7 基因敲入细胞系向PGCLCs诱导体系 |
| 2.2.8 流式细胞术检测PGCLCs诱导效率 |
| 2.2.9 荧光定量PCR |
| 2.2.10 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 构建H1ESCs荧光报告细胞系 |
| 3.2 优化基因敲入细胞系向PGCLCs诱导效率 |
| 4 讨论 |
| 5 实验小结 |
| 第二部分 TET基因敲除细胞系建立及向PGCLCs诱导效率的差异 |
| 1 前言 |
| 2 材料(对象)与方法 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 实验细胞和质粒 |
| 2.1.2 实验试剂和耗材 |
| 2.1.3 实验试剂配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒构建 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 单克隆细胞筛选 |
| 2.2.4 基因敲除细胞系PCR及 Sanger测序鉴定 |
| 2.2.5 流式细胞术鉴定基因敲除细胞系多能性 |
| 2.2.6 Dot-blot检测各组敲除细胞系5hmC和5mC变化 |
| 2.2.7 CCK8检测细胞增殖 |
| 2.2.8 流式细胞术检测各组细胞PGCLCs诱导效率 |
| 2.2.9 免疫荧光染色 |
| 2.2.10 荧光定量PCR |
| 2.2.11 亚硫酸盐测序 |
| 3 结果 |
| 3.1 成功建立TET1/2/3基因不同敲除组合细胞系 |
| 3.2 TET1/2/3 基因不同敲除组合对PGCLCs诱导的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 实验小结 |
| 第三部分 外源性及内源性SOX17和BLIMP1 的过表达可重建TKO细胞系向PGCLCs诱导 |
| 1 前言 |
| 2 材料(对象)与方法 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 实验细胞和质粒 |
| 2.1.2 实验试剂和耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒构建 |
| 2.2.2 慢病毒包装 |
| 2.2.3 细胞感染及筛选 |
| 2.2.4 流式细胞术检测各细胞系向PGCLCs诱导效率 |
| 2.2.5 荧光定量PCR |
| 2.2.6 免疫荧光染色 |
| 2.2.7 亚硫酸盐测序 |
| 3 结果 |
| 3.1 外源性SOX17和BLIMP1 过表达重建TKO细胞系向PGCLCs诱导 |
| 3.2 通过d Cas9-Tet1 CD改变SOX17和BLIMP1 基因启动子甲基化水平重建TKO细胞系向PGCLCs的诱导 |
| 4 讨论 |
| 5 实验小结 |
| 第四部分 鉴定SOX17和BLIMP1 启动子甲基转移酶并敲除可重建TKO细胞系向PGCLCs诱导 |
| 1 前言 |
| 2 材料(对象)与方法 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 实验细胞和质粒 |
| 2.1.2 实验试剂和耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 ChIP-qPCR |
| 2.2.2 质粒构建 |
| 2.2.3 细胞转染 |
| 2.2.4 单克隆细胞筛选 |
| 2.2.5 基因敲除细胞系PCR及 Sanger测序鉴定 |
| 2.2.6 流式细胞术鉴定基因敲除细胞系多能性 |
| 2.2.7 Dot-blot检测敲除细胞系5hmC和5mC变化 |
| 2.2.8 流式细胞术检测基因敲除细胞系向PGCLCs诱导效率 |
| 2.2.9 免疫荧光染色 |
| 2.2.10 荧光定量PCR |
| 2.2.11 亚硫酸盐测序 |
| 3 结果 |
| 3.1 ChIP-q PCR检测SOX17和BLIMP1 基因启动子甲基转移酶 |
| 3.2 SOX17和BLIMP1 启动子甲基转移酶DNMT3B敲除对PGCLCs诱导的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 实验小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 多能干细胞体外向生殖细胞诱导研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件1 攻读学位期间发表论文目录 |
| 附件2 英文缩略词一览表 |
（9）小鼠胚胎干细胞诱导分化为胚胎睾丸支持样细胞方法和分子机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 胚胎干细胞的研究现状 |
| 1.1.1 胚胎干细胞的来源与种类 |
| 1.1.2 胚胎干细胞的体外培养 |
| 1.1.3 胚胎干细胞的分化诱导 |
| 1.1.4 胚胎干细胞的临床应用 |
| 1.2 睾丸支持细胞的研究现状 |
| 1.2.1 睾丸支持细胞的特性 |
| 1.2.2 睾丸支持细胞的滋养功能 |
| 1.2.3 睾丸支持细胞的免疫豁免功能 |
| 1.2.4 睾丸支持细胞骨架结构有助于形成血睾屏障 |
| 1.2.5 胚胎睾丸支持细胞诱导雄性分化决定 |
| 1.3 胚胎干细胞向胚胎睾丸支持细胞的分化途径研究 |
| 1.3.1 胚胎睾丸支持细胞的分化来源 |
| 1.3.2 小鼠胚胎睾丸支持细胞的发育形成过程 |
| 1.3.3 小鼠胚胎睾丸支持细胞形成的分子机理 |
| 1.3.3.1 体腔上皮和中性性腺的形成相关因子 |
| 1.3.3.2 雄性分化决定相关因子 |
| 1.3.3.3 胚胎睾丸支持细胞的生长发育相关因子 |
| 1.3.4 现有的胚胎睾丸支持细胞体外诱导方法 |
| 1.3.4.1 控制胚胎干细胞的细胞群落细胞量方法 |
| 1.3.4.2 通过加入重组蛋白,诱导中胚层来源细胞向睾丸支持样细胞分化 |
| 1.3.4.3 通过重编程成纤维细胞诱导转分化出睾丸支持样细胞 |
| 1.4 本文主要研究内容、目的和意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 工具耗材 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.2.1 常用试剂 |
| 2.2.2.2 配制试剂和培养基 |
| 2.2.2.3 细胞材料 |
| 2.2.2.4 核酸分子实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞提取方法 |
| 2.3.1.1 小鼠胚胎干细胞的提取 |
| 2.3.1.2 小鼠胚胎成纤维细胞的提取 |
| 2.3.1.3 精原干细胞和成熟睾丸支持细胞的提取 |
| 2.3.2 核酸扩增技术 |
| 2.3.2.1 聚合酶链反应技术(PCR) |
| 2.3.2.2 感受态细胞转化 |
| 2.3.2.3 核酸琼脂凝胶电泳 |
| 2.3.3 基因转导方法 |
| 2.3.3.1 慢病毒转染 |
| 2.3.3.2 脂质体转染 |
| 2.3.3.3 聚醚酰亚胺阳离子聚合物转染 |
| 2.3.4 细胞鉴定方法 |
| 2.3.4.1 定量聚合酶链反应技术(qPCR) |
| 2.3.4.2 蛋白质印迹分析(WB) |
| 2.3.4.3 免疫荧光电镜检测方法(IF) |
| 2.3.4.4 免疫细胞化学检测法(ICC) |
| 2.3.4.5 流式细胞分析技术(FCM) |
| 2.3.4.6 PKH26活细胞荧光染色 |
| 2.3.4.7 组织石蜡切片制箭 |
| 第3章 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞诱导分化模型 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 小鼠胚胎干细胞的诱导分化方法 |
| 3.2.1.1 目的基因扩增方法 |
| 3.2.1.2 pcDNA3.1(+)载体常表达质粒的构建 |
| 3.2.1.3 FUW-TetO载体四环素控制表达质粒的构建 |
| 3.2.1.4 FUW-lightO载体光控制质粒的构建 |
| 3.2.2 小鼠胚胎干细胞的体外培养方法 |
| 3.2.2.1 TM4细胞和小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备 |
| 3.2.2.2 TM4细胞条件培养基的制备 |
| 3.2.3 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞定向分化实验设计方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 小鼠胚胎干细胞诱导分化方法分析 |
| 3.3.1.1 慢病毒转染、脂质体转染和阳离子聚合物对目的基因的转染效率比较 |
| 3.3.1.2 目的基因重组蛋白在不同细胞系中的表达 |
| 3.3.1.3 基因转导调控诱导和蛋白因子诱导胚胎干细胞定向分化效果比较 |
| 3.3.2 TM4细胞对小鼠胚胎干细胞体外培养结果 |
| 3.3.2.1 TM4细胞作为滋养层对小鼠胚胎干细胞体外培养的影响 |
| 3.3.2.2 TM4细胞条件培养基对小鼠胚胎干细胞聚集、增殖和多能性影响 |
| 3.3.3 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞体外诱导分化过程鉴定 |
| 3.3.3.1 小鼠胚胎干细胞诱导分化过程的形态学分析 |
| 3.3.3.2 小鼠胚胎干细胞诱导分化过程特异性生物标志物分析 |
| 3.3.3.3 小鼠胚胎干细胞诱导分化过程中细胞标志性基因的转录表达鉴定 |
| 3.3.3.4 上皮细胞和间质细胞标志性基因表达鉴定分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞分化模型的分子机理 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 关键因子的诱导功能鉴定方法 |
| 4.2.2 关键因子的分子调控机理研究方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 关键因子在胚胎干细胞诱导分化过程中的功能分析 |
| 4.3.1.1 关键因子对胚胎干细胞诱导分化过程的影响 |
| 4.3.1.2 Sry和Sox9功能比较分析 |
| 4.3.1.3 剔除Sry表达调控后的关键因子诱导功能分析 |
| 4.3.2 诱导分化阶段及其关键因子的功能分析 |
| 4.3.2.1 体腔上皮发育和SF1阳性前体样细胞形成阶段的因子功能鉴定 |
| 4.3.2.2 SF1阳性性腺前体样细胞向胚胎睾丸支持样细胞分化阶段的因子功能鉴定 |
| 4.3.2.3 胚胎睾丸支持样细胞生长发育相关因子功能鉴定 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 诱导形成的小鼠睾丸支持样细胞的功能鉴定 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 诱导睾丸支持样细胞与精原干细胞共培养实验 |
| 5.2.1.1 睾丸支持样细胞滋养层的制备方法 |
| 5.2.1.2 睾丸支持样细胞与精原干细胞的共培养方法 |
| 5.2.2 诱导睾丸支持样细胞的小鼠睾丸移植实验 |
| 5.2.2.1 诱导睾丸支持样细胞和天然睾丸支持细胞的活细胞染色方法 |
| 5.2.2.2 诱导睾丸支持样细胞注射小鼠睾丸组织的移植方法 |
| 5.2.2.3 移植细胞的鉴定方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 诱导睾丸支持样细胞对精原干细胞体外发育为雄性配子样细胞的结果分析 |
| 5.3.2 诱导睾丸支持样细胞移植在小鼠睾丸组织中的生长情况 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 讨论、结论与展望 |
| 6.1 讨论 |
| 6.1.1 小鼠胚胎干细胞体外向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型 |
| 6.1.2 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞诱导分化模型的分子机理探讨 |
| 6.2 结论 |
| 6.3 创新点 |
| 6.4 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间论文发表情况 |
| 附录 1 |
| 附录 2 |
| 附录 3 |
| 附件 |
（10）淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 研究背景 |
| 一、补肾中药调控干细胞的相关研究 |
| 1. 淫羊藿对干细胞的调控 |
| 2. 其他补肾中药对干细胞的调控 |
| 二、HGF在干细胞领域的研究进展 |
| 1. HGF的概述 |
| 2. HGF对干细胞的影响 |
| 三、线粒体自噬的研究进展 |
| 1. 线粒体自噬的概述 |
| 2. 中药调控线粒体自噬 |
| 第二部分 淫羊藿素通过HGF/c-Met通路增强人脐带间充质干细胞抗凋亡能力的实验研究 |
| 一、实验材料 |
| 1. 实验细胞 |
| 2. 实验仪器 |
| 3. 实验试剂与耗材 |
| 4. 主要试剂的配制 |
| 二、实验方法 |
| 1. 细胞培养 |
| 2. MTS法测细胞活力 |
| 3. CCK8法测细胞活力 |
| 4. BrdU掺入试验测细胞增殖率 |
| 5. 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 6. western blot(化学)方法检测蛋白表达 |
| 7. qRT-PCR检测mRNA表达水平 |
| 8. 质粒提取与细胞转染 |
| 9. ELISA法测蛋白表达 |
| 10. 统计学方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 淫羊藿素促进人脐带间充质干细胞的细胞活力与增殖活性 |
| 2. HGF/c-Met通路在人脐带间充质干细胞中具有抗凋亡作用 |
| 3. 淫羊藿素通过HGF/c-Met通路抑制人脐带间充质干细胞凋亡 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞线粒体自噬的实验研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 1. MTS法测细胞活力 |
| 2. western blot(荧光)方法检测蛋白表达 |
| 3. qRT-PCR检测mRNA表达水平 |
| 4. MitoTracker与目标蛋白共标记进行免疫荧光显微镜检测 |
| 5. 线粒体膜电位检测(JC-1) |
| 6. 电镜检测 |
| 7. 统计学方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 自噬抑制剂3-MA对无血清培养人脐带间充质干细胞的影响 |
| 2. 淫羊藿素增加无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体蛋白 |
| 3. 淫羊藿素抑制无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体自噬 |
| 4. 淫羊藿素提高无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体膜电位 |
| 四、讨论 |
| 第四部分 淫羊藿素预处理人脐带间充质干细胞蛋白质组学分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 蛋白浓度测定结果 |
| 2. 差异蛋白筛选结果 |
| 3. 生物信息学分析 |
| 四、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、体外诱导人胚胎干细胞向神经细胞分化的研究进展（论文参考文献）
- [1]促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究[D]. 张云峰. 石河子大学, 2021(01)
- [2]基于人头发丝支架的体外三维心肌组织的构建及其收缩性能的研究[D]. 肖倩茹. 东南大学, 2020(02)
- [3]mTOR信号通路在人脐带血造血干/祖细胞红系定向分化中的作用及机制研究[D]. 刘茜. 汕头大学, 2020(02)
- [4]糖胺聚糖类似物及光热纳米材料协同诱导胚胎干细胞神经分化的研究[D]. 张思炫. 苏州大学, 2020(02)
- [5]葛根素诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究[D]. 王雪姣. 河北北方学院, 2020(06)
- [6]人诱导多能干细胞向成骨样细胞逐步诱导分化的研究[D]. 韩雨. 兰州大学, 2020(01)
- [7]猪诱导多能性干细胞定向分化为血管内皮细胞的研究[D]. 伟人悦. 东北农业大学, 2020(04)
- [8]人多能干细胞向原始生殖细胞诱导及表观遗传调控机制的研究[D]. 李自立. 华中科技大学, 2020(01)
- [9]小鼠胚胎干细胞诱导分化为胚胎睾丸支持样细胞方法和分子机理研究[D]. 徐辰泽. 华东理工大学, 2020(01)
- [10]淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究[D]. 王璐. 广州中医药大学, 2019(08)