一、Genome organization and phylogenetic tree analysis of Garlic virus E,a new member of genus Allexivirus（论文文献综述）
顾启玉[1]（2020）在《大蒜气生鳞茎水培诱导技术研究》文中研究说明大蒜属于无性繁殖作物,在种植过程中长期进行无性繁殖以及重茬等多种因素,导致植物体病毒积累严重,进而严重影响大蒜的产量和品质,而大蒜离体快繁技术可以有效的解决上述问题。研究中常常用热处理结合茎尖培养的方法来进行大蒜的脱毒,但是此方法操作难度大,操作人员需有较高的技术,而且繁殖的系数低,生产成本高。气生鳞茎是由蒜薹顶端花苞内的鳞芽长成,生长速度快,体积小,数量多,萌芽率高,遗传稳定,且携带病毒率低,其形成的试管苗可自然脱毒,是离体条件下进行大蒜脱毒育苗的首选材料。但气生鳞茎在田间自然成熟会影响蒜头的膨大,造成大蒜的减产,而且气生鳞茎如大蒜一样,本身具有休眠性,因此开发出高效的气生鳞茎诱导技术、人工破眠技术及充分研究气生鳞茎的休眠解除机制是彻底解决这些问题的关键。本研究首先以‘苍山蒜薹’为材料,利用水培的方法诱导出气生鳞茎,然后以诱导形成的气生鳞茎为外植体直接诱导试管苗,研究不同破眠方式对气生鳞茎休眠解除的影响以及试管苗的脱毒效果,同时探究了外源GA3和FL解除气生鳞茎休眠的生理过程,最后把试管苗移栽到露地,研究组培苗与常规苗的生长特性差异。主要结果如下:1、以长度为20 cm的带花苞蒜薹诱导形成气生鳞茎效果最佳,最适营养液为霍格兰基础营养液+1 mg·L-1NAA+1 mg·L-1ABA,pH为6.0,气生鳞茎诱导率可达100%,数量多且气生鳞茎单重大。2、每平方米培养300根蒜薹最为适宜,若密度过大,诱导形成的气生鳞茎数量少且气生鳞茎单重少,若密度过小,会造成资源的浪费,营养液不能被充分的利用。营养液中加入200 mg·L-1链霉素、200 mg·L-1头孢和200 mg·L-1青霉素最为适宜,可减少气生鳞茎诱导过程中营养液的更换次数,既能保持营养液的清洁,抑制藻类生物的繁殖和生长,又不会对气生鳞茎的形成产生影响。3、通过比较外源GA3和FL两种打破大蒜气生鳞茎休眠的效果得出,用250 mg·L-1的GA3浸泡12 h后,气生鳞茎的萌芽率最高可达62.5%,而用20 mg·L-1的FL浸泡12 h后,气生鳞茎的萌芽率最高可达70.8%,综合分析得出,用FL打破大蒜气生鳞茎休眠的效果优于GA3。4、气生鳞茎休眠时,脱落酸和细胞分裂素的含量较高,内源赤霉素的含量较低,呼吸强度微弱,生长基本处于停滞状态。受到外源GA3和FL的刺激后,呼吸作用逐渐加强,内源赤霉素的含量也随之增加,脱落酸和玉米素核苷含量降低,碳水化合物逐渐降解,物质代谢活跃,休眠解除。5、通过DAS-ELISA、RT-PCR两种方法检测气生鳞茎的脱毒效果,结果表明,气生鳞茎试管苗对洋葱黄矮病毒的脱除率可达94.19%,能够完全脱去大蒜普通潜隐病毒。6、通过对比气生鳞茎组培苗与常规苗生理特性差异得出:气生鳞茎组培苗生长势和品质好于常规苗,但其抗性较差。
杨萌萌[2]（2020）在《葡萄座腔菌病毒多样性与新型病毒分子生物学特性研究》文中研究指明中国梨的栽培面积和产量均居世界首位,但由葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）所引起的梨轮纹病在梨主产区的发生较为普遍,对梨产量、品质构成较大威胁,生产上对解决此问题的需求日益迫切。具有弱毒特性的真菌病毒具有潜在的生防价值,本研究以从我国梨轮纹病样中分离的B.dothidea为材料,开展B.dothidea携带病毒多样性研究,并对新鉴定出的真菌病毒分子生物学特性进行系统性研究,为深入了解来源于B.dothidea中的真菌病毒特性提供新的有用信息和完善真菌病毒分类系统提供试验支撑,并为梨病害绿色防治提供新的具有生防潜能的真菌病毒资源。主要研究结果如下:1.葡萄座腔菌病毒的多样性通过对来源于我国8个省的梨产区289个B.dothidea菌株的双链RNA（ds RNA）进行检测后,发现这些菌株在0.8-10.0 kb之间共携带有22种不同大小的ds RNA片段,说明这些菌株中携带有丰富的ds RNA病毒。其中在5.0-7.5 kbp范围内的ds RNA片段的携带率最高,为35.7%。其次为Bd CV1的基因组ds RNA,携带率为29.2%,然后是两条～2.0 kbp ds RNA和Bd RV1的基因组ds RNA。这些ds RNA片段在不同菌株中共存在29种不同的组合模式,表明不同病毒在B.dothidea中可能存在多种复合侵染模式。对不同省份的菌株中ds RNA片段分别进行统计,发现来源于不同梨产区的B.dothidea菌株携带的ds RNA病毒种类存在较大的差异。为进一步明确来源于我国梨的B.dothidea携带病毒的多样性,从中选取156个菌株进行宏病毒组分析。结果显示,共发现有13个科72种病毒,其中55种为新型病毒。这些病毒中+ss RNA病毒有52种,ds RNA病毒19种,-ss RNA病毒仅1种。基于Rd Rp的氨基酸序列对其中的41种病毒进行系统发育分析,发现共有36种病毒属于已知的病毒科,包括Narnaviridae、Botourmiaviridae、Alphaflexiviridae、Deltaflexiviridae、Partitiviridae、Totiviridae、Ambiguivirida、Fusariviridae和Bipartitiviridae;还有5种病毒尚不能确定其分类地位,为此建议基于这些病毒成立Botourmiaviridae下的一个新的病毒属Botryosoulivirus和一个新的病毒科Mycobromoviridae以确立相关病毒的分类地位。本部分内容对B.dothidea菌株中的病毒多样性进行了系统研究,明确了这些菌株共携带有22种不同大小的外源ds RNA种类,这些ds RNA在不同菌株中存在29种不同的侵染模式,并发现来源不同梨产区菌株中携带的ds RNA病毒具有较大差异。此外,对部分菌株进行高通量测序进一步发掘了B.dothidea中的真菌病毒种类,研究共发现72种病毒,其中55种为新型病毒,并选取了其中的41种病毒序列进行系统发育分析,发现这些病毒可归类于10个病毒科下。2.葡萄座腔菌中鉴定的三种新病毒及其分子生物学特性通过对来源于辽宁梨的B.dothidea弱毒菌株L153中病毒种类的鉴定,发现该菌株携带有5种病毒,其中4种为+ss RNA病毒,分别是Botryosphaeria dothidea botrexvirus 1（Bd BV1）、Botryosphaeria dothidea narnavirus 2（Bd NV2）、Bd NV3和Bd NV4,另外一种为ds RNA病毒Botryosphaeria dothidea partitivirus 1（Bd PV1）。其中Bd BV1包含两条+ss RNA基因组,长度分别为5033 bp和1063 bp。RNA1包含4个开放阅读框（ORF1-4）,ORF1能够比对到甲型线型病毒科（Alphaflexiviridae）成员的复制酶,ORF3能够比对到酵母（Cryptococcus neoformans）的假定蛋白,其它ORF则比对不到任何同源蛋白信息。对ORF1进行保守结构域比对分析发现存在有3个保守结构域,分别为病毒的甲基转移酶（Vmethyltransf）、病毒的解螺旋酶（Viral＿helicase）和依赖RNA的RNA聚合酶（Rd Rp）。RNA2包含一个开放阅读框,编码病毒的外壳蛋白（CP）。值得注意的是RNA2链的3′末端248个核苷酸与RNA1相应位置的末端序列完全一致,其中包含了RNA1的ORF4部分和非翻译区,目前在真菌病毒中尚无这种结构的报道。基于复制酶氨基酸序列的系统发育分析表明Bd BV1与Botrexvirus属中的单一病毒Bot VX聚在同一分支,可能为该属的一个新成员。但Bd BV1具有与其相近的真菌病毒Bot VX差异较大的基因组结构。Bd BV1-CP序列与其相近病毒均存在一个典型的盐桥保守结构域,该结构域是侵染植物的弯曲杆状病毒所特有疏水结构域。通过对菌株L153仅不携带Bd BV1的单孢后代菌株L153-29进行生物学特性进行研究,发现该菌株在菌落特征、菌丝形态和致病性方面较其母代菌株L153的异常状态均有较大的恢复,表明菌株L153的生长异常和弱毒特性主要与携带病毒Bd BV1有关。此外,对菌株L153中的病毒粒子进行电镜观察发现该菌株中携带有两种形态的病毒粒子,一种可能为Bd PV1的球形病毒粒子,另外一种是线型的病毒粒子。对这种线型的病毒粒子长度进行测量统计发现最长能达到5451.5 nm,这是B.dothidea线型病毒粒子的首次发现,也是截至目前发现的最长的病毒粒子。通过SDS-PAGE检测发现菌株L153中的病毒粒子有5种结构蛋白,其中P35、P25和P15为未知蛋白。通过肽指纹图谱鉴定（PMF）,发现P35为线型病毒粒子CP所编码。采用Bd BV1 RNA2编码的CP原核表达产物制备多克隆抗体进行免疫电镜观察的结果显示,线型病毒粒子周围富集有抗体,表明来菌株L153中的线型病毒粒子即为Bd BV1。从来源于山东梨的B.dothidea菌株MSD53中鉴定出一种单组分ds RNA病毒,暂命名为Botryosphaeria dothidea victorivirus 2（Bd VV2）。Bd VV2的基因组全长为5090 bp,包含两个开放阅读框,分别编码病毒的CP和Rd Rp。将该病毒的CP和Rd Rp进行比对分析,发现均与整形病毒科的成员具有较高的同源性,其中与Sphaeropsis sapinea RNA viruses 1（Ss RV1）的相应蛋白的同源性最高,分别为68%和60%。Bd VV2病毒粒子球形,直径约38 nm。基于CP和Rd Rp序列系统发育分析表明,Bd VV2为整形病毒科维多利亚病毒属的新种。从来源于江西梨的B.dothidea菌株G91中鉴定出一种新的+ss RNA病毒,暂命名为Botryosphaeria dothidea botourmiavirus 1（Bd BOV1）。Bd BOV1基因组全长2547bp,包含一个开放阅读框,可能编码病毒的Rd Rp。通过基因组全长比对分析,发现该病毒与新建立的Botourmiaviridae病毒科的成员具有较高的同源性。基于Rd Rp的系统发育分析,该病毒与Magoulivirus病毒属的Magnaporthe oryzae ourmia-like virus（Mo OLV）和Rhizoctonia solani ourmia-like virus（Rs OLV1）相聚最近,但又独立于Magoulivirus和Botourmiaviridae的其它属之外。表明Bd BOV1可能为Magoulivirus病毒属的新成员或者可能与其相近病毒属于一个新病毒属。
吕锐玲[3]（2018）在《湖北省水稻纹枯病菌病毒多样性及三个与寄主毒力相关新病毒的分子特性研究》文中进行了进一步梳理茄丝核菌（Rhizoctonia solani）是一类寄主范围广、危害严重的世界性的重要植物病原真菌,由其引起的纹枯病是水稻上三大病害之一,严重影响稻谷产量及品质。真菌病毒是在真菌中复制和增殖的一类病毒,在真菌界中广泛存在,部分病毒与寄主致病力衰退相关,具有防治作物真菌病害的潜力。本研究对分离自湖北省水稻植株上的茄丝核菌中的病毒多样性进行了分析,进而对三个新病毒的分子特性进行了研究,具体研究结果如下:水稻纹枯菌中蕴藏丰富的病毒资源。从湖北省襄阳市、随州市等9个地级市辖区内共分离获得水稻纹枯菌菌株174个。对分离的菌株进行宏病毒组高通量测序,获得10G转录组数据量,其中约1%的序列注释到了病毒信息。对获得的reads序列进行拼接,得到了324个与NCBI数据库中病毒相关的contig序列。根据病毒核酸类型划分,单链DNA（ssDNA）病毒占1%,双链RNA（dsRNA）病毒占35%,正单链RNA（+ssRNA）病毒占55%,负单链RNA（-ssRNA）病毒占9%。其中dsRNA病毒主要包括双分病毒科（Partitiviridae）和一些未分类的dsRNA病毒。+ssRNA病毒主要包括内源病毒科（Endornaviridae）、裸露病毒科（Narnaviridae）、低毒病毒科（Hypoviridae）和甜菜坏死黄脉病毒科（Benyviridae）。-ssRNA病毒主要包括单股负义链病毒目（Mononegavirales）、布尼亚病毒目（Bunyavirales）和未分类的负链病毒。ssDNA病毒仅有2个contig。总体来看,这些序列匹配到的病毒以dsRNA病毒中的Partitiviridae和+ssRNA病毒中的Narnaviridae为优势类群,并且各种核酸类型的病毒都占有一定的比例,表明纹枯菌中病毒资源非常丰富。菌株HG81携带有两个新的双分病毒,分别命名为RsPV3（Rhizoctonia solani partitivirus 3）和RsPV4（Rhizoctonia solani partitivirus 4）。RsPV3和RsPV4均包含有2个dsRNA节段,RsPV3的dsRNA1和dsRNA2全长分别为1993核苷酸（nt）和1733 nt,均含有1个单独的ORF,其中dsRNA1的ORF编码含有618个氨基酸（AA）的依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRp）,dsRNA2的ORF编码全长486 AA的衣壳蛋白（CP）;RsPV4的dsRNA1和dsRNA2全长分别为1981 nt和1694 nt,分别含有1个完整的ORF,其中dsRNA1的ORF编码一个含625 AA的RdRp,dsRNA2的ORF编码含479 AA的CP。基于的RdRp和CP氨基酸序列进行聚类分析,RsPV3和RsPV4均与双分病毒科Alphapartitivirus属的RsPV2亲缘关系较近,在核酸水平上分别有61%和65%的相似性,是Alphapartitivirus属的新成员。RsPV3和RsPV4的病毒颗粒是直径约为30 nm的球形病毒粒子。通过PEG介导的方法将RsPV3和RsPV4的病毒粒子转染到强毒力菌株190的原生质体中,获得了转染子T26和T28菌株。相比190菌株,转染子T26和T28生长速度缓慢,形成的菌核小且大小不均匀,致病力显着下降。因此,RsPV3或/和RsPV4与寄主低毒特性有相关性。解析了纹枯菌单股负义链RNA病毒RsRhV1基因组分子特性。菌株XY175含有一个单股负义链RNA病毒,命名为RsRhV1（Rhizoctonia solani rhabdovirus 1）,其基因组全长11716 nt,G+C含量为40%;3’端非编码区（UTR）有87 nt,5’端的UTR含有244 nt,且3’-UTR和5’-UTR序列有明显的互补特性。RsRhV1基因组推定含有5个ORFs（ORFⅠ-Ⅴ）,该5个非重叠ORF在病毒基因组上呈线性排列。5个ORFs之间的间隔区长度在28-232 nt之间、富含A/U高度保守序列。RsRhV1的5个ORFs都包含高度保守的基因转录终止序列（3’-AUACUUUUUUU-5’）和基因转录起始序列（3’-UUGUC-5’）,同时也包含了高度保守的基因间隔（G/CA）区域。这与典型的弹状病毒的基因转录终止、起始和间隔区域的序列是一致的。RsRhV1病毒ORFⅠ推定编码N基因（核衣壳蛋白基因）,ORFⅣ推定编码为G基因（糖蛋白基因）,ORFⅤ推定编码为L基因,L基因除了含有RdRp保守结构域外,还含有对mRNA帽子结构的形成所必须的保守GxxTx（n）HR基序。ORFⅡ编码蛋白在NCBI数据库中没有发现同源序列信息,ORFⅢ编码的蛋白与真菌Glarea lozoyensis的锌指结构（C2H2和C2HC）有同源性（相似性46%）。RsRhV1的ORFII和ORFIII分别对应的是弹状病毒科病毒的磷酸化蛋白（Phosphoprotein,P）和基质蛋白（Matrix protein,M）。弹状病毒科病毒的L蛋白序列聚类分析,RsRhV1并未与弹状病毒科病毒的任何成员聚为一簇,而是单独成为分支。RsRhV1病毒粒子直径为20-50nm、长度约800-1000nm的线形病毒粒子,这与子弹状的弹状病毒科病毒粒子形态不同。因此,基于寄主、病毒自身分子特性及其聚类分析,表明RsRhV1是弹状病毒科的新成员且具有其独特性,这是弹状病毒首次在纹枯菌中报道。通过原生质体再生获得XY175菌株的衍生菌株175A1-VF13、175A1-VF15和175A1-VF32。在致病力测定上,含有RsRhV1病毒的175A1-VF15菌株与不含RsRhV1病毒的175A1-VF13和175A1-VF32菌株相比较,175A1-VF15菌株致病力较强,推测RsRhV1病毒存在时,菌株XY175具有强致病力。本研究对采集自湖北省的水稻纹枯病菌中的真菌病毒的多样性进行了分析,并深入研究了三个新的与致病力相关病毒,不仅积累了潜在的控制水稻纹枯病的真菌病毒资源,还对全面认识和理解真菌病毒多样性及病毒进化方面也具有良好的促进作用。
刘敏[4]（2018）在《活性氧介导的大蒜试管苗玻璃化发生机制》文中研究表明试管苗玻璃化是植物组织培养中普遍存在的一种生理障碍。大蒜试管苗极易发生玻璃化,发生后不易恢复,严重影响组织培养技术在大蒜脱毒快繁、种质创新和遗传改良中的应用。玻璃化发生机理至今尚未明确,导致玻璃化防控因缺乏理论基础而效果有限。研究表明,玻璃化试管苗中存在活性氧代谢紊乱,但两者的相互关系还缺乏系统的研究和阐述。为了从内源活性氧作用的角度解析大蒜试管苗玻璃化发生的机理,本研究以大蒜品种‘二水早’为材料,采用生理生化分析、荧光定量PCR、高通量测序、RACE等技术和方法,系统分析诱导和缓解试管苗玻璃化的不同处理下,大蒜试管苗活性氧代谢特征,探讨低浓度外源H2O2缓解试管苗玻璃化的机制,筛选大蒜试管苗荧光定量PCR的内参基因,挖掘大蒜试管苗玻璃化的关键候选基因。主要研究结果如下:1.在高浓度H2O2和培养基低pH处理第2天,低浓度琼脂和高浓度BA处理第8天,试管苗内源ROS迅速增加,其玻璃化率也随之提高。与此同时,4个胁迫处理下试管苗SOD、POD和CAT的基因表达量和酶活性显着上升,AsA和GSH含量降低,试管苗总抗氧化能力和自由基清除率下降,MDA含量提高,膜透性增加,细胞膜完整性降低,活性氧代谢发生紊乱。在100 μM SA和500μM AsA处理下,试管苗ROS增加缓慢,APX、GR、GPX的基因表达和酶活性增强,内源AsA和GSH含量增加,活性氧代谢基本稳定,试管苗发生率降低。试验结果显示,活性氧代谢保持相对稳定,是缓解试管苗玻璃化发生的关键。2.在低浓度外源H2O2（50μM）引发处理下,试管苗保持较高的O2-产生速率和适宜的内源H2O2浓度,GPX、APX和GR基因表达上调、酶活性提高,CAT基因的表达及其酶活性降低,内源AsA和GSH含量增加,AsA/DHA和GSH/GSSG比例提高;在此基础上,后续再进行诱导玻璃化的胁迫处理件,试管苗活性氧代谢基本维持平衡状态,质膜伤害程度低,试管苗保持较低的玻璃化率。相反,较高浓度外源H202（250μM）引发处理造成试管苗的氧化胁迫,后续再进行胁迫处理,ROS积累增加,质膜伤害程度严重,试管苗玻璃化率加剧。试验结果说明,外源H2O2对试管苗玻璃化的发生的影响因浓度不同表现出“双重作用”:低浓度外源H2O2具有信号分子作用,调控活性氧代谢维持相对稳定,使试管苗玻璃化率降低;较高浓度外源H2O2具有氧化伤害作用,直接诱导氧化胁迫,使试管苗玻璃化率提高。3.利用qPCR结果进行表达稳定性分析,明确了 α-微管蛋白（TUA）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、聚泛素（UBQ）、亲环蛋白（CYP）和肌动蛋白（ACT）分别是8个候选内参基因中最适合应用在大蒜不同基因型、不同器官、不同发育时期、不同非生物胁迫和不同培养基处理的稳定的内参基因。4.以‘二水早’为试验材料,构建了对照和胁迫处理下的大蒜试管苗转录组测序文库,利用高通量测序和生物信息学分析筛选到735个试管苗玻璃化发生候选基因,除编码NADPH氧化酶、CAT、POD等与活性氧产生和清除相关的酶基因外,激素（细胞分裂素、生长素、乙烯、水杨酸、赤霉素、脱落酸）代谢和水通道蛋白相关基因均参与了大蒜试管苗玻璃化发生过程。利用RACE技术克隆了关键候选基因质膜水通道蛋白（AsPIP1;1、AsPIP1;2和AsPIP2;1）的cDNA全长,分析3个基因的特征序列和表达模式。结果发现,在易发生玻璃化的大蒜品种（‘二水早’）和器官（花序轴）中,AsPIPs表达量显着低于鳞茎盘等其它组织。AsPIPs参与了大蒜试管苗玻璃化的发生和恢复。低浓度或高H2O2、培养基低pH值、高浓度BA、低浓度Agar等易诱发试管苗玻璃化和内源ROS紊乱的因素,均可诱导AsPIPs在玻璃化过程中的特异表达。
张天昊[5]（2018）在《大蒜X病毒开放阅读框6编码p15蛋白的功能研究》文中提出大蒜属于百合科（Lilicacene）葱属植物（Alliums）。自然情况下大蒜为多种病毒复合侵染,主要包括马铃薯Y病毒属病毒,麝香石竹潜隐病毒属病毒和青葱X病毒属病毒。大蒜X病毒（Garlic virus X,GarVX）是导致大蒜病毒病害的重要病原之一,隶属葱X病毒属（Allexivirus）。Gar VX是单链正义RNA病毒,由8106个核苷酸组成,除去3’末端poly（A）结构外,具有六个开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,其中ORF6编码的15kDa（p15）蛋白推测为一个半胱氨酸富集蛋白（cysteine-rich proteins,CRPs）。据报道称,植物病毒编码的CRPs蛋白多为病毒致病的决定因子,同时许多病毒的CRPs具有沉默抑制作用,但p15具体功能未知。本研究中,我们以GarVX ORF6编码的p15蛋白为研究对象。构建p15蛋白的绿色荧光表达载体,通过共聚焦显微镜观察显示p15蛋白定位在细胞外周、细胞核和核仁中。马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）介导p15蛋白过量表达（PVX-p15）与PVX-GFP对比能引起本氏烟矮化,叶片畸形并导致PVX的积聚增加,表明p15为PVX-p15的病毒致病因子。此外,使用农杆菌浸润16c烟草表达和芜菁皱纹病毒（TCV）运动互补测定,证明p15具有弱RNA沉默抑制活性。核定位信号（Nuclear localization sequence,NLS）缺失突变体（p15m）不在细胞核内的积累,其PVX-p15m的致病能力减弱,但是沉默抑制作用没有消失。综上所述,本实验对GarVX p15的功能进行了初步验证,明确了P15能定位到细胞核和核仁中,PVX过量表达p15实验表明p15为PVX-p15的病毒致病因子,同时p15具有沉默抑制子功能,且其核定位突变体与p15的致病性有关,但不影响其抑制子功能。对GarVX p15的功能研究有助于了解该属病毒的致病机制。
汪沛[6]（2016）在《辣椒及大蒜病毒多重RT-PCR检测体系的建立》文中指出辣椒、大蒜均具有较高的营养价值和独特的风味,是蔬菜作物和调味品之一,但辣椒病毒病广泛发生,造成减产30%-50%甚至绝收；大蒜无性繁殖过程中病毒可在植物体内逐代积累,导致种性退化。辣椒、大蒜的病毒病防治,需要有快速、有效的检测方法,以确定病毒感染情况或脱毒效果与质量。本研究以辣椒的烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus,TMW）、黄瓜花叶病毒（Cucumber Mosaic Virus, CMV）、马铃薯Y病毒（Potato Virus Y, PVY）、蚕豆萎蔫病毒-2 （Broad Bean Vascula Wilt Virus-2, BBWV-2）和大蒜的韭葱黄条病毒（Leek Yellow Stripe Virus, LYSV）、洋葱黄矮病毒（Onion Yellow Dwarf Virus, OYDV）、葱潜隐病毒（Shallot Latent Virus, SLV）、青葱X病毒属病毒（Allexiviruses）为研究对象,分别建立了四重RT-PCR检测体系,并用这两个体系分别对湖南辣椒、大蒜病毒发生情况进行了研究。此外,对湖南长沙、茶陵Allexiviruses病毒分离物作了分型鉴定。主要研究结果如下：1、以湖南长沙、株洲醴陵疑似感病辣椒为材料,设计特异性引物,分别建立了CMV、TMV、PVY、BBWV-2的单重RT-PCR检测体系；以复合侵染样品为材料,建立了能同时检测CMV （323bp）、TMV （237 bp）、PVY （480bp）和BBWV-2 （1057bp）的四重RT-PCR检测体系,体系组分包括：10×PCR Buffer（-Mg2+） 2.5 μL、50mM Mg2+ 3 μL、2.5mM dNTP 5μL、上下游引物（-R、-F）各1 μL、Taq酶0.5 u L、模版cDNA 2 μL, ddH2O补足至25μ L；PCR反应程序为：94℃预变性5min,94℃变性30s；57℃退火40s；72℃延伸2min；循环数为40；最后72℃C延伸10min。运用该体系检测湖南主产区43个疑似感病辣椒的病毒感染情况,结果表明43个疑似感病辣椒为单种病毒侵染或两至四种病毒复合侵染,说明该体系能有效应用于实践。2、以湖南长沙、株洲茶陵疑似感病大蒜为材料,设计特异性引物,分别建立了Allexiviruses、OYDV、LYSV、SLV的单重RT-PCR检测体系；以复合侵染样品为材料,建立了能同时检测Allexiviruses （180bp）、OYDV （265 bp）、LYSV （404 bp）和SLV （592 bp）的四重RT-PCR检测体系,体系组分包括2×PCR mix 12.5 μL模板（cDNA） 2μL、四对引物的正向引物和反向引物各1μL, ddH2O补至25μ L；PCR反应程序为92℃预变性2min后,92℃ 30s,44℃ 30s,72℃ 1min,40个循环后,72℃ 10min。并运用该体系检测湖南主产区159个疑似感病大蒜的病毒感染情况,结果表明159个疑似感病大蒜为单种病毒侵染或两至四种病毒复合侵染,说明该体系能有效应用于实践。3、克隆了大蒜Allexiviruses长沙、茶陵分离物CP蛋白基因部分序列,并进行了序列分析,结果表明大蒜Allexiviruses长沙、茶陵分离物均为GarV-D。
陈辉麟[7]（2014）在《大蒜病毒Real Time PCR定量检测方法的建立及其应用》文中认为大蒜（Allium sativum L）属百合科（Liliacea）葱属（Allium tistalosum）的一个栽培种，是一种重要的蔬菜作物。大蒜具有很高的营养价值和杀菌、抗癌、降低血脂、抗衰老等重要的药用保健价值。大蒜通常以蒜瓣（地下鳞茎）进行无性繁殖，长期的无性繁殖使大蒜体内感染的病毒逐代传递并积累，造成病毒病害逐年加重和大蒜种性退化。对大蒜病毒的检测是大蒜病毒监测防控中最为重要的环节之一。与以往常规的电镜技术、血清学技术、核酸杂交技术和常规的PCR技术相比，利用实时荧光定量PCR技术来检测鉴定植物病毒，具有较高的准确性与应用性。因此，本研究以普通大蒜为研究材料，锚定大蒜普通潜隐病毒（GCLV）、大蒜潜隐病毒（GLV）、葱潜隐病毒（SLV）、洋葱黄矮病毒（OYDV）、韭葱黄条病毒（LYSV）和葱黄条病毒（SYSV）的CP序列基因保守区域，分别建立了各自的用于定量检测大蒜病毒的实时荧光定量PCR方法。同时，应用这些方法对两个大蒜品种中这几种病毒进行了初步的定量检测研究，主要结果如下：1.根据通常感染大蒜的六种病毒GCLV、GLV、SLV、OYDV、LYSV和SYSV在GenBank中登录的基因序列，分别设计了检测这六种病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR引物。六对引物的靶标序列均位于CP序列上；通过序列对比，在CP序列保守区域设计引物，通过在GenBank中用BLAST进行比对，证实引物特异性很高。2.针对GCLV、GLV、SLV、OYDV、LYSV和SYSV的定量检测，分别建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。建立了各自的标准曲线，曲线斜率分别为-3.18、-3.40、-3.32、-3.51、-3.55和-3.35，斜率值均在-3.0～-3.6之间。扩增效率分别为106%、97%、100%、93%、91%、和99%。溶解曲线只有单一的一个峰，没有引物二聚体和非特异性扩增；曲线斜率，扩增效率和引物均符合定量要求。3. GCLV、GLV、SLV、OYDV、LYSV和SYSV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度分别为42拷贝/50μl、16拷贝/20μl、15拷贝/20μl、16拷贝/20μl、40拷贝/50μl和10拷贝/20μl，与普通PCR检测技术的灵敏度对比，该方法灵敏度是普通PCR的100倍。进行组内重复性实验，变异系数分别在0.2%～1.1%、0.8%～6.6%、0.6%～1.2%、1.8%～3.9%、1.8%～4.4%和0.6%～1.6%之间，有较好的重复性。4.应用建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测山东早苔一号和甘肃陇南成县迟蒜气生鳞茎3代（QC3）大蒜中的病毒。结果显示，山东早苔一号含有四种病毒：大蒜普通潜隐病毒、韭葱黄条病毒、洋葱黄矮病毒和葱黄条病毒。病毒拷贝数分别为103.75、105.37、101.45和105.48。甘肃陇南成县迟蒜气生鳞茎3代（QC3）含有三种病毒：大蒜普通潜隐病毒，韭葱黄条病毒和葱黄条病毒。病毒拷贝数分别为102.89、105.34和106.32。表明大蒜病毒在大蒜品种中普遍存在，且多为复合侵染。
董瑞[8]（2013）在《新疆大蒜病毒脱除及快速繁殖技术研究》文中研究指明大蒜（Allium sativum L.）为百合科葱属多年生草本植物，鳞茎、花薹和幼苗均可食用，是人类日常生活中不可缺少的调料和蔬菜之一。在生产中，由于大蒜为无性繁殖，使其易受病毒侵染，产量、品质不断下降，从而导致新疆大蒜种植面积逐年减少，严重制约了新疆大蒜产业的发展。应用热处理并结合大蒜茎尖组培是脱除大蒜病毒的常用方法。但是由于大蒜茎尖培养难度较大，且繁殖系数低，所以较高的脱毒大蒜生产成本，成为大蒜脱毒良种培育与生产应用亟待解决的问题。本研究采用热处理结合气生鳞茎和茎尖组织培养的方法脱除大蒜病毒，用大蒜鳞茎盘诱导不定芽作为快速繁殖方式。分别对不同激素对大蒜的气生鳞茎出芽、鳞茎茎尖的愈伤组织和不定芽诱导、鳞茎盘不定芽诱导及其生根的影响，并对不同茎尖大小与脱毒效果的关系以及感染病毒大蒜和健康大蒜的生理结构进行了一定的研究。取得了以下研究结果：1新疆白皮蒜和伊宁红皮蒜气生鳞茎催芽，GA3浓度为300mg·L-1时发芽率最高，发芽率表现极显着。2利用热处理和茎尖组培，建立了大蒜茎尖脱毒培养体系。结果表明，MS+0.3mg/LNAA+1.7mg/L6-BA利于新疆白皮蒜和伊宁红皮蒜的茎尖产生不定芽。剥取茎尖的大小为0.5mm时，新疆白皮蒜和伊宁红皮蒜的愈伤率分别为70%和80%，不定芽发生率分别为60%和70%。3应用二次回归正交旋转组合设计，通过DPS分析，预测得到新疆白皮蒜和伊宁红皮蒜鳞茎盘不定芽生长最佳配方分别为：MS+2mg/L NAA+7.5mg/L6-BA和MS+1.799mg/L NAA+7.5mg/L6-BA在此条件下新疆白皮蒜和伊宁红皮蒜每个鳞茎盘不定芽生长最大值为39.22株和22.92株。新疆白皮蒜和伊宁红皮蒜根诱导最佳配方为：MS+0.5mg·L-1IBA+1.0mg·L-1NAA。4感染病毒大蒜叶片同未感染病毒大蒜叶片相比，叶片向内翻卷扭曲，不能正常伸展，呈现畸形。叶肉中栅栏组织细胞排列较正常叶片疏松，且多数呈不规则状，染病较重叶片海绵组织细胞变得疏松膨胀，排列无序。5大蒜鳞茎剥取茎尖脱毒时以0.5mm大小的茎尖脱毒效果较好，脱毒率可达100%。气生鳞茎的鳞茎盘组培也有一定的脱毒效果，新疆白皮蒜与伊宁红皮蒜的鳞茎盘脱毒率分别为58-86%和54-85%。
吴明德[9]（2012）在《葡萄孢属植物病原菌真菌病毒研究》文中进行了进一步梳理葡萄孢属真菌（Botrytis spp）是一种广泛分布的植物病原真菌,可引起多种作物的灰霉病,造成严重的经济损失。本研究对源于灰葡萄孢（B. cinerea）、大蒜盲种葡萄孢（B. porri）、葱鳞葡萄孢（B.squamosa）、中国葱葡萄孢（B. sinoallii）及拟蚕豆葡萄孢（B.fabiopsis）中的5类真菌病毒进行了研究,具体包括两种线粒体病毒（Mitovirus）、一种双分病毒（Partitivirus）、一种尚未分类的病毒及一个代表新病毒科的成员。在上述5种病毒中,有两种病毒已被证实与葡萄孢的致病力衰退有密切的关系,其中包括源于灰葡萄孢菌株CanBc-1的线粒体病毒Botrytis cinerea mitovirus1（BcMV1）和源于大蒜盲种葡萄孢菌株GarlicBc-72的真菌病毒Botrytis porri RNA virus1（BpRV1）。BcMV1的全长约为2804nt,与OnuMV3b有极高的同源性,可以通过病菌的分生孢子进行垂直传染和通过菌丝的融合进行水平传染。成功传染BcMV1dsRNA的菌株均会在生长速度和致病力上出现明显的衰退。通过透射电镜对病毒感染后菌丝的超薄切片进行观察可以发现,病毒侵染后,菌丝细胞中线粒体会出现肿大、嵴退化和内部纤维化的症状,加之提纯的线粒体中也可检测到BcMV1的dsRNA,因此,BcMV1的攻击位点被认为是线粒体。BcMV1侵染线粒体后,造成线粒体的超微结构出现明显的异常,从而可能造成线粒体功能的紊乱,并最终导致灰葡萄孢致病力的严重衰退。此外,BcMV1在灰葡萄孢分生孢子形成过程中可以产生DIRNA,即BcMV1-S。BcMV1-S可以通过菌丝融合进行水平传染。虽然它可以抑制BcMV1的复制但不会影响BcMV1造成的弱毒特性。BpRVl是本研究中另一种可引起葡萄孢致病力衰退的真菌病毒。BpRVl的基因组含有两条dsRNA片段,分别命名为dsRNA-1（6125bp）和dsRNA-2（5879bp）。这两条片段在5’和3’末端分别有95%和62%的相似度,且各编码一个大的开放阅读框（ORF）,分别命名为ORFⅠ （dsRNA-1）和ORFⅡ （dsRNA-2）。ORFI所编码的蛋白在靠近N端的区域与Totiviridae、Chrysoviridae和Megabirnaviridae科病毒所编码的依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRp）有一定的同源性,且同源性约为19%-23%。ORFⅠ所编码蛋白的其他区域及ORFⅡ所编码蛋白并未在数据库中搜索到与之有明显同源性的蛋白序列。系统进化分析表明,BpRV1属于一个单独的分支,与已报道真菌病毒的亲缘关系均较远。BpRV1的病毒粒体直径约为35nm,里面包含有两条dsRNA链（dsRNA-1和dsRNA-2）和大小分别为70kDa、80kDa及85kDa的三种病毒结构蛋白。蛋白质指纹图谱分析表明80kDa及85kDa的结构蛋白由dsRNA-1编码,而70kDa的结构蛋白由dsRNA-2编码。将BpRV1的病毒粒体导入强毒菌株GarlicBc-38后,会导致其病毒感染后的衍生菌株38T致病力和生长速度的衰退。以上结果都表明,BpRV1是一种新型的真菌病毒,并可能属于一个新的病毒科。此外,在葱鳞葡萄孢菌株LeekBc-10中也检测到了一种真菌病毒,Botrytis squamosa RNA virus1（BsRV1）。BsRV1与BpRV1的两条dsRNA基因组在核酸水平上的同源性为91%-97%,而在蛋白水平上的同源性则高达97%-98%,因此BpRV1与BsRV1被认为是同一种病毒的不同毒株。剩余的3种真菌病毒对寄主的影响尚不十分明确,但病毒侵染的菌株都表现出了与正常菌株明显不同的培养形态。其中,已获得了来源于葱鳞葡萄孢菌株GarlicBc-21的Botrytis squamosa RNA virus2（BsRV2/Bc-21）和来源于拟蚕豆葡萄孢菌株BroadbeanBc-41的Botrytis fabiopsis RNA virus1（BfRV1/Bc-41）部分基因组序列。结果显示两者在蛋白水平上有91%以上的相似性,因而BsRV2/Bc-21与BfRV1/Bc-41可能也是同一种病毒。系统进化分析表明这两种病毒与FgV-DK21的亲缘关系最近,且与hypovirus有一定的亲缘关系,但具体的分类地位还尚待确定。另外在菌株BroadbeanBc-41中还发现了一种双分病毒Botrytis fabiopsis partitivirus1（BfPV1）与SsPVS有较近的亲缘关系。此外,BfPV1还与蚕豆上的一种双分病毒VfPV-1有较高的同源性。最后,在中国葱葡萄孢菌株OnionBc-59中发现了一种与SsMV1有较近的亲缘关系的线粒体病毒Botrytis sinoallii mitovirus1（BsMV1）。
许蕊[10]（2012）在《三种大蒜病毒的RT-PCR及多重RT-PCR检测研究》文中提出大蒜是全世界最有价值的蔬菜作物之一。但由于大蒜以无性繁殖为主，被称之为“植物癌症”的病毒病害，对大蒜生产及其品种造成了极大的影响与危害，培育脱毒大蒜是防治病毒病的最有效方法。在培育脱毒大蒜的过程中，则需要快速、实用的检测技术对大蒜中存在的病毒进行准确的鉴定检测，以确定脱毒的效果与质量。本研究以甘肃省陇南市成县的主栽品种“成县迟蒜”，“成县早蒜气生鳞茎”，山东“鲁蒜王2号”为材料，以大蒜潜隐病毒（GLV）、韭葱黄条病毒（LYSV）、洋葱黄矮病毒（OYDV）为研究对象，建立了三种大蒜病毒的RT-PCR检测体系，在其基础上运用正交设计方法优化多重PCR反应，从而建立了多重RT-PCR检测体系，并应用该体系对不同大蒜栽培品种进行了病毒发生情况检测。为进一步利用多重RT-PCR技术同时进行更多大蒜病毒的检测提供了技术参考。1.以甘肃“成县迟蒜”为试验材料，根据GenBank报道的GLV、LYSV、OYDV的外壳蛋白（CP）基因保守区核苷酸序列设计特异性引物，建立三种病毒RT-PCR检测体系。并筛选出含有多种病毒的大蒜样品。2.在单重RT-PCR检测技术基础上，利用正交设计L16（45）对多重RT-PCR检测反应体系中的Taq酶、Mg2+、模板DNA、引物、dNTP5个因素在4水平上进行优化试验，建立了能同时两两检测GLV、LYSV和OYDV的多重RT-PCR检测体系。该方法可以从带病大蒜样品中同时扩增出大小与试验设计相符的849bp（GLV）、276bp（LYSV）和571bp（OYDV）的特异性多重RT-PCR扩增条带。扩增产物测序结果表明：GLV与GenBank中登录的韩国分离物（GeneBankNo.DQ520093）核苷酸同源性达100%，与日本分离物（GeneBank No.AB004567）核苷酸同源性达98%；LYSV与两个日本分离物（GeneBank No.D11118、GeneBank No.AB194622）核苷酸同源性达93%；OYDV扩增片段与两个美国分离物（GeneBank No.GQ475358、GeneBankNo.GQ475360）的核苷酸同源性达98%。序列同源性分析验证了多重RT-PCR结果的可靠性。3.应用建立的两重RT-PCR检测体系检测甘肃“成县迟蒜”、“成县早蒜气生鳞茎”、山东“鲁蒜王2号”中的大蒜三种病毒GLV，LYSV，OYDV的感染情况。结果显示，所有大蒜样品均被病毒感染，其中77%的样品被两种病毒复合侵染。表明GLV、LYSV和OYDV在三种大蒜品种中普遍存在，且多为复合侵染。
二、Genome organization and phylogenetic tree analysis of Garlic virus E,a new member of genus Allexivirus（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Genome organization and phylogenetic tree analysis of Garlic virus E,a new member of genus Allexivirus（论文提纲范文）
（1）大蒜气生鳞茎水培诱导技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 大蒜的生长特性 |
| 1.2 水培的概述 |
| 1.2.1 水培的定义和优缺点 |
| 1.2.2 水培的种类 |
| 1.2.3 水培蔬菜营养液研究进展 |
| 1.2.4 杀菌剂在水培蔬菜中的应用 |
| 1.3 大蒜气生鳞茎的研究进展 |
| 1.3.1 气生鳞茎诱导技术 |
| 1.3.2 气生鳞茎休眠生理及休眠解除技术 |
| 1.3.3 气生鳞茎休眠萌发研究进展 |
| 1.4 大蒜病毒病的研究进展 |
| 1.4.1 韭葱黄条纹病毒(LYSV) |
| 1.4.2 洋葱黄矮病毒(OYDV) |
| 1.4.3 大蒜普通潜隐病毒(GCLV) |
| 1.4.4 青葱潜隐病毒(SLV) |
| 1.4.5 青葱X病毒属 |
| 1.5 大蒜病毒的检测方法 |
| 1.5.1 植物病毒检测技术研究进展 |
| 1.5.2 生物学检测法 |
| 1.5.3 血清学方法 |
| 1.5.4 电子显微镜技术 |
| 1.5.5 分子生物学方法 |
| 1.5.6 高通量测序(High-throughput sequencing)检测法 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 材料培养及处理 |
| 2.2 数据分析和处理 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 培养基的制备 |
| 2.3.2 气生鳞茎接种培养 |
| 2.3.3 营养指标的测定 |
| 2.3.4 色素含量的测定 |
| 2.3.5 酶活性和丙二醛含量的测定 |
| 2.3.6 内源激素含量的测定 |
| 2.3.7 大蒜病毒的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 大蒜气生鳞茎形成的诱导 |
| 3.1.1 不同蒜薹长度对大蒜气生鳞茎形成的影响 |
| 3.1.2 不同激素种类及浓度对大蒜气生鳞茎形成的影响 |
| 3.1.3 不同抗生素种类及浓度对大蒜气生鳞茎形成的影响 |
| 3.1.4 不同培养密度对大蒜气生鳞茎形成的影响 |
| 3.2 气生鳞茎打破休眠技术研究 |
| 3.2.1 不同GA3 处理对气生鳞茎萌发的影响 |
| 3.2.2 不同FL处理对气生鳞茎萌发的影响 |
| 3.3 外源GA3和FL解除大蒜气生鳞茎休眠的生理过程研究 |
| 3.3.1 GA3和FL处理对大蒜气生鳞茎ABA、ZR和GA含量的影响 |
| 3.3.2 GA3和FL处理对大蒜气生鳞茎可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响 |
| 3.3.3 GA3和FL处理对大蒜气生鳞茎总糖和还原糖含量的影响 |
| 3.3.4 GA3和FL处理对大蒜气生鳞茎POD和CAT含量的影响 |
| 3.3.5 GA3和FL处理对大蒜气生鳞茎Vc和MDA含量的影响 |
| 3.4 试管苗脱毒效果的检测 |
| 3.4.1 试管苗培养 |
| 3.4.2 DAS-ELISA检测试管苗洋葱黄矮病毒(OYDV)病毒含量 |
| 3.4.3 RT-PCR检测试管苗病毒 |
| 3.5 大蒜气生鳞茎组培苗与常规苗生理特性的差异 |
| 4 讨论 |
| 4.1 大蒜气生鳞茎的形成 |
| 4.2 大蒜气生鳞茎的休眠解除与萌发 |
| 4.3 大蒜气生鳞茎休眠解除的生理过程 |
| 4.4 大蒜气生鳞茎脱毒检测 |
| 4.5 大蒜气生鳞茎组培苗与常规苗生长特性差异对比 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）葡萄座腔菌病毒多样性与新型病毒分子生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 葡萄座腔菌研究进展 |
| 1.1 植物病原葡萄座腔菌的危害 |
| 1.2 由B.dothidea引起的梨树病害 |
| 1.3 B.dothidea的生物学特性及发病规律 |
| 1.4 植物病原B.dothidea的侵染过程及致病机理 |
| 1.5 由B.dothidea所导致梨病害的防治 |
| 2 真菌病毒研究进展 |
| 2.1 真菌病毒分类 |
| 2.1.1 dsRNA真菌病毒 |
| 2.1.2 +ssRNA真菌病毒 |
| 2.1.3 -ssRNA真菌病毒 |
| 2.1.4 ssDNA真菌病毒 |
| 2.1.5 ss RNA-RT真菌病毒 |
| 2.2 真菌病毒的传播途径 |
| 2.3 真菌病毒与寄主的关系 |
| 2.4 真菌病毒间的相互作用 |
| 2.5 高通量测序技术在新病毒发掘中的应用 |
| 2.6 B.dothidea菌中病毒的研究现状 |
| 3 本研究的目的及意义 |
| 第二章 葡萄座腔菌(B.dothidea)病毒的多样性研究 |
| 1 引言 |
| 2 试验材料 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 B.dothidea的分离 |
| 3.2 dsRNA提取 |
| 3.3 dsRNA的DNaseI和S1核酸酶处理 |
| 3.4 dsRNA的反转录 |
| 3.5 引物设计与合成 |
| 3.6 PCR扩增及测序 |
| 3.7 核酸电泳检测 |
| 3.8 总RNA的提取 |
| 3.9 总RNA质量测定 |
| 3.10 高通量测序及分析 |
| 3.10.1 高通量测序和cDNA文库构建 |
| 3.10.2 宏病毒组生物信息学分析 |
| 3.11 序列比对和分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 B.dothidea dsRNA病毒的多样性 |
| 4.1.1 dsRNA片段分析 |
| 4.1.2 来源于不同地区的BdCV1基因组序列高度保守 |
| 4.1.3 不同类型dsRNA片段的存在比率及分布规律 |
| 4.2 基于高通量测序技术对B.dothidea病毒的种类分析 |
| 4.2.1 菌株总RNA提取及质量检测 |
| 4.2.2 测序数据产出及转录本拼接 |
| 4.2.3 B.dothidea病毒的多样性 |
| 4.2.4 裸露核糖核酸病毒科(Narnaviridae)病毒 |
| 4.2.5 Botourmiaviridae病毒 |
| 4.2.6 Iflaviridae病毒 |
| 4.2.7 Ambiguiviridae病毒 |
| 4.2.8 建议新成立的Mycobromoviridae病毒 |
| 4.2.9 Mycovirgaviridae和 Fusariviridae病毒 |
| 4.2.10 芜菁黄花叶病毒目(Tymovirales)病毒 |
| 4.2.11 -ssRNA病毒 |
| 4.2.12 产黄青霉病毒科(Chrysoviridae)病毒 |
| 4.2.13 双分体病毒科(Partitiviridae)病毒 |
| 4.2.14 Bipartitiviridae病毒 |
| 4.2.15 整形病毒科(Totiviridae)病毒 |
| 5 讨论 |
| 第三章 B.dothidea菌株L153携带病毒种类的鉴定及BdBV1的分子生物学特性研究 |
| 1 前言 |
| 2 试验材料 |
| 2.1 供试菌株和植物 |
| 2.2 培养基、载体及引物 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 病毒基因组全长cDNA序列扩增 |
| 3.1.1 高通量测序 |
| 3.1.2 RT-PCR序列验证 |
| 3.1.3 RACE |
| 3.1.4 PCR产物的回收与纯化 |
| 3.1.5 回收片段与载体的连接和热击转化 |
| 3.1.6 菌落阳性鉴定 |
| 3.2 病毒基因组cDNA序列的拼接及分析 |
| 3.3 菌株分生孢子的诱导与病毒脱除 |
| 3.4 菌落的形态观察和生长速率测定 |
| 3.5 菌株的致病性测定 |
| 3.6 菌株L153中病毒粒子的提取 |
| 3.7 病毒粒子的负染和透射电镜观测 |
| 3.8 病毒粒子结构蛋白检测与分析 |
| 3.9 病毒粒子结构蛋白的肽指纹图谱分析(PMF) |
| 3.10 原核表达载体的构建 |
| 3.10.1 目的基因RT-PCR扩增 |
| 3.10.2 目的基因与载体的双酶切处理 |
| 3.10.3 连接、转化与鉴定 |
| 3.10.4 阳性菌液质粒提取 |
| 3.11 目标基因的原核诱导表达 |
| 3.12 表达蛋白的可溶性分析 |
| 3.13 抗重组蛋白多克隆抗体的制备 |
| 3.13.1 重组蛋白的纯化 |
| 3.13.2 免疫大耳白兔制备多克隆抗体 |
| 3.13.3 血清的处理和保存 |
| 3.14 抗血清效价的评定 |
| 3.15 免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR) |
| 3.16 Western blot分析 |
| 3.17 免疫电镜 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 菌株L153携带的病毒种类 |
| 4.2 BdBV1基因组序列分析 |
| 4.3 BdBV1系统发育分析 |
| 4.4 BdBV1对寄主生物学特性的影响 |
| 4.5 菌株L153中的病毒粒子提取 |
| 4.6 SDS-PAGE检测和PMF鉴定 |
| 4.7 Bd BV1-CP全基因的原核表达 |
| 4.8 采用融合蛋白制备的多克隆抗体及效价测定 |
| 4.9 多克隆抗体对BdBV1编码蛋白的识别 |
| 4.10 免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR)检测 |
| 4.11 病毒粒子的免疫电镜观察 |
| 5 讨论 |
| 第四章 B.dothidea菌株MSD53携带的维多利亚病毒鉴定及分子生物学特性研究 |
| 1 引言 |
| 2 试验材料 |
| 2.1 供试菌株和植物 |
| 2.2 载体及引物 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 dsRNA的提取和检测 |
| 3.2 dsRNA的DNaseI和S1核酸酶处理 |
| 3.3 dsRNA病毒全长cDNA序列的克隆 |
| 3.3.1 cDNA第一条链的合成 |
| 3.3.2 RNA的降解、cDNA的复性和补平反应 |
| 3.3.3 随机克隆PCR |
| 3.3.4 dsRNA末端cDNA序列克隆 |
| 3.4 病毒粒子的提取、纯化、检测与鉴定 |
| 3.5 病毒粒子基因组核酸检测 |
| 3.6 序列分析、拼接和系统发育分析 |
| 3.7 菌落的形态观察、生长速率和致病性测定 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 dsRNA的全长序列分析 |
| 4.2 BdVV2系统发育分析 |
| 4.3 BdVV2的病毒粒子 |
| 4.4 SDS-PAGE检测和PMF鉴定 |
| 4.5 带毒菌株菌株MSD53的生物学特性分析 |
| 5 讨论 |
| 第五章 B.dothidea菌株G91携带的灰霉欧尔密病毒鉴定与分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 供试菌株和植物 |
| 2.2 培养基、载体及引物 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 菌株的dsRNA提取 |
| 3.2 病毒基因组全长cDNA序列扩增 |
| 3.3 cDNA序列的拼接和分析 |
| 3.4 菌株的生物学特性 |
| 3.5 菌株的致病性测定 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 BdBOV1基因组序列分析 |
| 4.2 BdBOV1的系统发育分析 |
| 4.3 菌株G91的生物学特性分析 |
| 5 讨论 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 1 总结与展望 |
| 1.1 B.dothidea病毒的多样性 |
| 1.2 新型病毒的分子生物学特性 |
| 2 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1:菌株L153中病毒粒子透射电镜观察 |
| 附录2:第二章所用菌株来源及编号 |
| 附录3:pMD18-T克隆载体图谱 |
| 附录4:pGEX-KG载体图谱和多克隆位点信息 |
| 附录5:常用试剂和培养基的配方 |
| 附录6:博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（3）湖北省水稻纹枯病菌病毒多样性及三个与寄主毒力相关新病毒的分子特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 1.水稻纹枯病及其病原 |
| 1.1 水稻纹枯病的发生与危害 |
| 1.2 纹枯病病原菌生物学 |
| 1.2.1 病原菌生物学 |
| 1.2.2 茄丝核菌及其融合群分类 |
| 1.2.3 水稻纹枯病病害循环 |
| 1.2.4 水稻纹枯病菌的致病机理 |
| 1.2.5 水稻纹枯病防治策略 |
| 1.3 真菌病毒研究进展 |
| 1.3.1 真菌病毒的发现 |
| 1.3.2 真菌病毒传播特性 |
| 1.3.3 真菌病毒多样性分析 |
| 1.3.4 单股负义链RNA病毒目 |
| 1.3.5 低毒相关真菌病毒在生物防治中的应用 |
| 1.3.6 真菌病毒的进化 |
| 1.3.7 纹枯菌中病毒的多样性 |
| 1.3.8 病毒宏基因组挖掘新病毒 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 基于宏转录组测序鉴定水稻纹枯菌病毒多样性 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.2 纹枯菌菌株分离方法及总RNA提取和检测 |
| 2.3 推定病毒RT-PCR检测方法 |
| 2.4 序列比对分析及进化树构建使用软件 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 纹枯菌总RNA质量和浓度测定 |
| 3.2 宏转录组测序结果分析 |
| 3.3 部分病毒的聚类分析 |
| 3.3.1 与Geminiviridae相关病毒序列分析 |
| 3.3.2 隶属于Partitiviridae相关病毒序列分析 |
| 3.3.3 隶属于Narnaviridae相关病毒序列分析 |
| 3.3.4 隶属于Hypoviridae相关病毒序列分析 |
| 3.3.5 隶属于Endornaviridae相关病毒序列分析 |
| 3.3.6 隶属于Rhabdoviridae相关病毒序列分析 |
| 3.3.7 隶属于Aspiviridae相关病毒序列分析 |
| 4 结论与讨论 |
| 第三章 两个双分病毒的分子特性及其与寄主低毒相关性分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株 |
| 2.2 供试植物 |
| 2.3 培养基 |
| 2.4 试剂及引物 |
| 2.4.1 主要试剂 |
| 2.4.2 引物 |
| 2.5 试验方法 |
| 2.5.1 病毒dsRNA提取 |
| 2.5.2 病毒dsRNA中 DNA和单链RNA的去除 |
| 2.5.3 电泳及回收纯化 |
| 2.5.4 病毒RsPV3和RsPV4 序列的随机克隆 |
| 2.5.5 病毒RsPV3和RsPV4 末端序列克隆 |
| 2.5.6 病毒粒子提取 |
| 2.5.7 病毒粒子观察 |
| 2.5.8 病毒结构蛋白的检测 |
| 2.5.9 病毒粒子蛋白质胶条鉴定 |
| 2.5.10 PEG介导的病毒粒子转染 |
| 2.5.11 转染子的验证 |
| 2.5.12 转染子的生物学特性测定 |
| 2.5.13 序列分析和系统发育分析所用到的软件 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 纹枯菌菌株HG81 含有多条dsRNA片段 |
| 3.2 dsRNA病毒全长序列的获取 |
| 3.3 RsPV3和RsPV4 均是双分病毒 |
| 3.4 病毒粒子形态观察 |
| 3.5 RsPV3和RsPV4 是两个典型的双分病毒 |
| 3.6 病毒粒子转染验证病毒生物学特性 |
| 3.6.1 转染子dsRNA提取和RT-PCR验证 |
| 3.6.2 转染子T26和T28与190 菌株的生物学特性 |
| 4 结论与讨论 |
| 第四章 单股负义链RNA病毒RsRhV1 分子特性及生物学特性研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究菌株 |
| 2.2 引物 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 总RNA的提取 |
| 2.3.2 总RNA的反转录 |
| 2.3.3 病毒粒子的提取及核酸的裂解 |
| 2.3.4 单股负义链RNA病毒RsRhV1 的末端序列克隆 |
| 2.3.5 致病力和生长速度的测定 |
| 2.3.6 序列分析中所用到的软件 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 XY175 菌株宏基因组测序结果分析 |
| 3.2 RsRhV1 全长基因组的克隆 |
| 3.3 RsRhV1 全长基因组特性的分析 |
| 3.4 RsRhV1 基因起始和终止信号分析 |
| 3.5 RsRhV1 与弹状病毒科代表属病毒基因组结构比较 |
| 3.6 RsRhV1 病毒的系统进化分析 |
| 3.7 RsRhV1 对寄主的生物学特性研究 |
| 3.7.1 病毒RsRhV1 寄主XY175 菌株特性的研究 |
| 3.7.2 RsRhV1 具有促进寄主毒力增强的特性 |
| 3.8 RsRhV1 病毒粒子的电镜观察 |
| 4 讨论 |
| 4.1 水稻纹枯菌中RsRhV1 病毒的发现 |
| 4.2 RsRhV1 病毒的蛋白及功能分析 |
| 4.3 RsRhV1 病毒粒子的形态与已报道的弹状病毒科成员不同 |
| 4.4 RsRhV1 病毒的分类地位和系统进化分析 |
| 4.5 非单一病毒侵染的菌株中的其它病毒的影响 |
| 4.6 RsRhV1 病毒的应用潜力 |
| 第五章 结论与展望 |
| 1 全文结论与讨论 |
| 1.1 病毒宏转录组测序是发掘新病毒资源的有效方法 |
| 1.2 来自菌株HG81中RsPV3和RsPV4 病毒的研究 |
| 1.2.1 RsPV3和RsPV4 是阿尔法双分病毒属的新成员 |
| 1.2.2 RsPV3和RsPV4 导致寄主生长受阻和致病力衰退 |
| 1.3 来自XY175 菌株中RsRhV1 病毒特性的研究 |
| 1.3.1 RsRhV1 病毒是弹状病毒科的一个新成员 |
| 1.3.2 RsRhV1 病毒基因功能可能发生了较大的变异 |
| 1.3.3 RsRhV1 病毒粒子呈线形与已报道的弹状病毒不同 |
| 1.3.4 RsRhV1 病毒可以提高寄主致病力 |
| 2 论文主要创新点 |
| 3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 文中附表 |
| 致谢 |
（4）活性氧介导的大蒜试管苗玻璃化发生机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(ABBREVIATIONS) |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 大蒜及其组织培养 |
| 1.1 大蒜概述 |
| 1.2 大蒜组织培养研究进展 |
| 2 植物试管苗玻璃化研究进展 |
| 2.1 植物试管苗玻璃化 |
| 2.2 玻璃化试管苗的特征 |
| 2.3 玻璃化发生的影响因素 |
| 2.4 试管苗玻璃化的防控和恢复 |
| 2.5 试管苗玻璃化发生的可能机理 |
| 3 植物活性氧代谢研究进展 |
| 3.1 氧化伤害作用 |
| 3.2 信号分子作用 |
| 3.3 活性氧调控作用网络 |
| 4 试管苗玻璃化与活性氧代谢研究进展 |
| 4.1 试管苗内源ROS产生和积累 |
| 4.2 试管苗抗氧化系统响应 |
| 4.3 试管苗内源ROS引起的膜脂过氧化 |
| 5 主要研究内容和目的意义 |
| 5.1 研究问题的提出 |
| 5.2 研究的目的和意义 |
| 5.3 研究内容 |
| 5.4 技术路线 |
| 第二章 大蒜试管苗玻璃化发生与内源ROS代谢的关系 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验设计和处理 |
| 2.3 测定指标和方法 |
| 2.4 数据处理和统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同胁迫和缓解处理对大蒜试管苗玻璃化的影响 |
| 3.2 不同处理下大蒜试管苗玻璃化发生的动态变化 |
| 3.3 不同处理对试管苗组织含水量和叶绿素含量的影响 |
| 3.4 不同处理下大蒜试管苗内源ROS的动态变化 |
| 3.5 不同处理下大蒜试管苗抗氧化系统的响应 |
| 3.6 不同处理下大蒜试管苗MDA含量、细胞膜透性与完整性的变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 不同胁迫因素诱导大蒜试管玻璃化的方式 |
| 4.2 不同处理缓解试管苗玻璃化的方式 |
| 4.3 试管苗内源ROS的产生和积累 |
| 4.4 试管苗内源ROS的清除 |
| 4.5 玻璃化试管苗细胞膜异变和水分异常 |
| 4.6 “内源ROS”调控试管苗玻璃化发生的模型 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 低浓度H_2O_2引发处理对大蒜试管苗玻璃化的缓解效应及其机制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验设计和处理 |
| 2.3 测定指标和方法 |
| 2.4 数据处理和统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 H_2O_2引发处理后试管苗在不同胁迫处理下的玻璃化发生情况 |
| 3.2 H_2O_2引发处理后试管苗在不同胁迫处理下的内源ROS的产生和积累 |
| 3.3 H_2O_2引发处理后试管苗在不同胁迫处理下的抗氧化能力和总自由基清除率 |
| 3.4 H_2O_2引发处理后试管苗在不同胁迫处理下的细胞膜损伤情况 |
| 3.5 H_2O_2引发处理对大蒜试管苗内源ROS和抗氧化系统的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 大蒜实时荧光定量PCR内参基因的筛选和验证 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验设计和处理 |
| 2.3 总RNA的提取和cDNA第一链的合成 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 大蒜候选内参基因核心片段的扩增 |
| 3.2 候选内参基因的扩增效率和特异性分析 |
| 3.3 候选内参基因的表达谱分析 |
| 3.4 候选内参基因表达稳定性分析 |
| 3.5 最佳候选内参基因数目分析 |
| 3.6 候选内参基因表达稳定性验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 内参基因表达稳定性对qPCR结果的影响 |
| 4.2 不同分析软件的内参基因表达稳定性 |
| 4.3 内参基因数目对表达稳定性的影响 |
| 4.4 不同内参基因表达稳定性的验证 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 大蒜试管苗玻璃化发生的关键基因挖掘和鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验设计和处理 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.4 数据统计和统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 数据组装和功能注释 |
| 3.2 转录组测序结果的qPCR验证 |
| 3.3 差异基因的pathway分析 |
| 3.4 AsPIPs基因的克隆 |
| 3.5 AsPIPs的生物信息学分析 |
| 3.6 AsPIPs氨基酸序列同源性及进化树分析 |
| 3.7 AsPIPs表达差异分析 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和申请专利 |
| 致谢 |
（5）大蒜X病毒开放阅读框6编码p15蛋白的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 大蒜病毒病 |
| 1.2 植物RNA沉默与病毒编码的沉默抑制子 |
| 1.2.1 植物RNA沉默 |
| 1.2.2 病毒编码的沉默抑制子 |
| 1.3 半胱氨酸富集蛋白 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 p15的序列分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试植物 |
| 2.1.2 供试菌株及载体 |
| 2.1.3 试剂与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Trizol法提取总RNA |
| 2.2.2 反转录 |
| 2.2.3 克隆的鉴定 |
| 2.2.4 DNA片段的切胶回收 |
| 2.2.5 T载体连接 |
| 2.2.6 质粒纯化 |
| 2.2.7 大肠杆菌感受态制备与热激转化 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 p15基因的获得 |
| 2.3.2 p15基因序列分析 |
| 2.3.3 p15及其突变体的定位分析 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 p15的致病性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 光学显微镜样品制备 |
| 3.2.2 双酶切 |
| 3.2.3 酶切产物回收 |
| 3.2.4 表达载体的构建 |
| 3.2.5 农杆菌感受态制备与电击转化 |
| 3.2.6 农杆菌共浸润本氏烟 |
| 3.2.7 蛋白Western-blot杂交 |
| 3.2.8 Gateway克隆技术构建p15相关载体 |
| 3.2.9 亚细胞单独定位与共定位 |
| 3.2.10 Northernblot检测 |
| 3.2.11 重组蛋白表达及纯化 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 PVX过量表达p15后寄主症状加重,病毒积累量增加 |
| 3.3.2 p15过量表达后植株细胞排列畸形 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 p15的沉默抑制子功能研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实时荧光定量 |
| 4.2.2 蛋白Westernblot杂交 |
| 4.2.3 电激转化 |
| 4.2.4 质粒提取 |
| 4.2.5 热激转化 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 通过16c验证p15的沉默抑制子功能 |
| 4.3.2 通过运动互补验证p15的沉默抑制子功能 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 讨论 |
| 第六章 展望 |
| 6.1 p15蛋白核酸结合作用验证 |
| 6.2 关于p15在沉默抑制中对烟草基因的调节 |
| 6.3 分析与p15相关的蛋白 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 符号及缩写语说明 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（6）辣椒及大蒜病毒多重RT-PCR检测体系的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 危害辣椒的主要病毒病 |
| 1.1.1 黄瓜花叶病毒(CMV) |
| 1.1.2 烟草花叶病毒(TMV) |
| 1.1.3 蚕豆萎蔫病毒(BBWV) |
| 1.1.4 马铃薯Y病毒(PVY) |
| 1.1.5 其他病毒 |
| 1.2 危害大蒜的主要病毒 |
| 1.2.1 香石竹潜隐病毒属(Carlavirus) |
| 1.2.2 马铃薯Y病毒属(Potyvirus) |
| 1.2.3 青葱X病毒属（Allexivirus) |
| 1.3 辣椒、大蒜病毒检测技术 |
| 1.3.1 生物学方法 |
| 1.3.2 血清学检测法 |
| 1.3.3 电镜法 |
| 1.3.4 分子生物学法 |
| 1.4 辣椒病毒病的防治 |
| 1.4.1 选育抗病品种 |
| 1.4.2 农艺防治 |
| 1.4.3 化学防治 |
| 1.4.4 物理防治 |
| 1.5 大蒜病毒病的防治 |
| 1.5.1 脱毒 |
| 1.5.2 田间管理 |
| 1.5.3 化学防治 |
| 1.5.4 选育抗病品种 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 第二章 辣椒病毒四重RT-PCR体系的建立及应用 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.1.5 PCR引物序列 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 总RNA的提取 |
| 2.2.2 RNA的反转录 |
| 2.2.3 单重PCR扩增 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.5 多重RT-PCR反应体系的建立 |
| 2.2.6 单重及四重PCR退火温度的筛选 |
| 2.2.7 单重及四重PCR检测灵敏度的测定 |
| 2.2.8 四重RT-PCR检测方法的应用 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 辣椒叶片总RNA提取 |
| 2.3.2 辣椒病毒单重RT-PCR检测体系的建立 |
| 2.3.3 辣椒CMV、TMV、PVY和BBWV-2四重RT-PCR检测体系的建立 |
| 2.3.4 单重及四重RT-PCR体系退火温度的优化 |
| 2.3.5 单重及多重RT-PCR反应灵敏度的测定 |
| 2.3.6 四重RT-PCR检测体系的应用 |
| 第三章 大蒜病毒四重RT-PCR体系的建立及应用 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 供试材料 |
| 3.1.2 仪器 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 主要溶液配制 |
| 3.1.5 PCR引物序列 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 总RNA的提取 |
| 3.2.2 RNA的反转录 |
| 3.2.3 单重PCR扩增 |
| 3.2.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2.5 四重RT-PCR反应体系的建立 |
| 3.2.6 单重及四重PCR退火温度的筛选 |
| 3.2.7 单重及四重PCR检测灵敏度的测定 |
| 3.2.8 四重RT-PCR检测方法的应用 |
| 3.2.9 大蒜青葱X病毒属(Allexiviruses)病毒类型分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 大蒜叶片总RNA提取 |
| 3.3.2 大蒜病毒单重RT-PCR检测体系建立 |
| 3.3.3 大蒜Allexiviruses、OYDV、LYSV和SLV病毒四重RT-PCR检测体系建立 |
| 3.3.4 单重及四重RT-PCR体系退火温度的优化 |
| 3.3.5 单重及多重PCR反应灵敏度的测定 |
| 3.3.6 四重RT-PCR检测体系的应用 |
| 3.3.7 长沙、茶陵大蒜青葱X病毒属(Allexiviruses)病毒类型分析 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 四重RT-PCR检测体系的建立 |
| 4.2 四重RT-PCR检测体系的应用 |
| 4.3 大蒜青葱X病毒属(Allexiviruses)病毒类型分析 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）大蒜病毒Real Time PCR定量检测方法的建立及其应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 大蒜概况 |
| 1.1 大蒜的营养价值 |
| 1.2 大蒜的药用价值 |
| 2 植物病毒的检测 |
| 2.1 目测法 |
| 2.2 生物学方法 |
| 2.3 血清学方法 |
| 2.4 电子显微镜检测法 |
| 2.5 分子生物学方法 |
| 3 本研究中所涉及的几种植物病毒 |
| 3.1 香石竹潜隐病毒属 |
| 3.2 马铃薯 Y 病毒属 |
| 3.3 青葱 X 病毒属 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 六种大蒜病毒实时荧光定量 PCR 检测方法的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验所需仪器 |
| 1.2 实验药品 |
| 1.3 实验方案 |
| 1.3.1 引物的设计和合成 |
| 1.3.2 标准 DNA 模板的制备 |
| 1.3.3 实时荧光定量 PCR 扩增和溶解曲线的制作 |
| 1.3.4 普通 PCR 敏感性检测 |
| 1.3.4.1 普通 PCR 扩增 |
| 1.3.4.2 琼脂糖凝胶电泳检测普通 PCR 扩增片段 |
| 1.3.5 实时荧光定量 PCR 敏感性检测 |
| 1.3.6 实时荧光定量 PCR 重复性评价 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 大蒜病毒标准曲线的制备 |
| 2.1.1 GCLV 病毒标准曲线的制备 |
| 2.1.2 GLV 病毒标准曲线的制备 |
| 2.1.3 SLV 病毒标准曲线的制备 |
| 2.1.4 OYDV 病毒标准曲线的制备 |
| 2.1.5 LYSV 病毒标准曲线的制备 |
| 2.1.6 SYSV 病毒标准曲线的制备 |
| 2.2 溶解曲线分析 |
| 2.3 SYBR GreenⅠreal-time PCR 与常规 PCR 敏感性对比 |
| 2.3.1 GCLV 病毒 SYBR GreenⅠreal-time PCR 与常规 PCR 敏感性对比 |
| 2.3.2 GLV 病毒 SYBR GreenⅠreal-time PCR 与常规 PCR 敏感性对比 |
| 2.3.3 SLV 病毒 SYBR GreenⅠreal-time PCR 与常规 PCR 敏感性对比 |
| 2.3.4 OYDV 病毒 SYBR GreenⅠreal-time PCR 与常规 PCR 敏感性对比 |
| 2.3.5 LYSV 病毒 SYBR GreenⅠreal-time PCR 与常规 PCR 敏感性对比 |
| 2.3.6 SYSV 病毒 SYBR GreenⅠreal-time PCR 与常规 PCR 敏感性对比 |
| 2.4 组内重复性 |
| 第三章 实时荧光定量 PCR 方法检测大蒜病毒的应用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验所需主要仪器 |
| 1.3 实验药品 |
| 1.4 实验方案 |
| 1.4.1 大蒜叶片总 RNA 的提取 |
| 1.4.2 琼脂糖凝胶电泳检测大蒜叶片总 RNA 样品 |
| 1.4.3 大蒜叶片总 RNA 反转录成 cDNA |
| 1.4.4 六种大蒜病毒引物的设计和合成 |
| 1.4.5 六种大蒜病毒的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 大蒜总 RNA 的提取 |
| 2.2 应用实时荧光定量 PCR 检测不同大蒜品种 |
| 第四章 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 主要结论 |
| 4.3 有待进一步研究和完善的问题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
（8）新疆大蒜病毒脱除及快速繁殖技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 大蒜病毒病的研究进展 |
| 1.1.1 马铃薯 Y 病毒属（Potyvirus） |
| 1.1.2 麝香石竹潜隐病毒属（Carlavirus） |
| 1.1.3 马铃薯 X 病毒属（Potex virus X,PVX） |
| 1.1.4 青葱 X 病毒属（Allexivirus） |
| 1.2 脱毒及其快速繁殖技术 |
| 1.2.1 脱毒技术 |
| 1.2.2 快速繁殖技术 |
| 1.3 脱毒检测 |
| 1.3.1 指示植物法 |
| 1.3.2 电子显微镜技术 |
| 1.3.3 血清学方法 |
| 1.3.4 分子生物学技术 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第2章 新疆大蒜气生鳞茎催芽及大蒜茎尖组培的激素筛选研究 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 大蒜气生鳞茎催芽研究 |
| 2.2.2 不同激素配比对大蒜茎尖组织培养的影响 |
| 2.2.3 不同茎尖大小对大蒜茎尖组织培养的影响 |
| 第3章 新疆大蒜鳞茎盘诱导不定芽及生根激素筛选研究 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同激素配比对新疆白皮蒜鳞茎盘诱导不定芽的影响 |
| 3.2.2 不同激素配比对伊宁红皮蒜鳞茎盘诱导不定芽的影响 |
| 3.2.3 不同激素配比对新疆白皮蒜生根的影响 |
| 3.2.4 不同激素配比对伊宁红皮蒜生根的影响 |
| 第4章 新疆大蒜脱毒检测 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 未感染病毒的大蒜叶片解剖结构特征 |
| 4.2.2 感染病毒的大蒜叶片解剖结构特征 |
| 4.2.3 大蒜鳞茎茎尖组织培养脱毒效果 |
| 4.2.4 大蒜气生鳞茎鳞茎盘诱导的不定芽病毒含量 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 激素对新疆大蒜气生鳞茎催芽及茎尖组培的影响 |
| 5.2 激素对新疆大蒜鳞茎盘诱导不定芽及生根的影响 |
| 5.3 大蒜脱毒检测 |
| 5.4 大蒜脱毒快繁体系建立 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）葡萄孢属植物病原菌真菌病毒研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 葡萄孢及其引起的作物灰霉病 |
| 1.1 灰葡萄孢的经济重要性 |
| 1.2 葡萄孢属真菌的分类 |
| 1.3 灰葡萄孢菌的生物学特性 |
| 1.4 灰霉病的侵染循环 |
| 1.5 灰霉病的防治 |
| 2 真菌病毒与植物病原真菌 |
| 2.1 主要的真菌病毒类群 |
| 2.1.1 单分病毒科(Totiviridae) |
| 2.1.2 双分病毒科(Partitiviridae) |
| 2.1.3 产黄青霉病毒科(Chrysoviridae) |
| 2.1.4 呼肠孤病毒科(Reoviridae) |
| 2.1.5 减毒病毒科(Hypoviridae) |
| 2.1.6 裸露RNA病毒科(Narnaviridae) |
| 2.1.7 Alphaflexiviridae和Gammaflexiviridae |
| 2.1.8 Barnaviridae |
| 2.1.9 Pseudoviridae和Metaviridae |
| 2.1.10 Megabirnaviridae和Quadriviridae |
| 2.1.11 真菌DNA病毒 |
| 2.2 真菌病毒与植物病原真菌的分子互作 |
| 2.2.1 CHV1-EP713的全长基因组序列 |
| 2.2.2 弱毒菌株的培养特性与p29和p40蛋白 |
| 2.2.3 寄主的抗病毒作用与p29和p48蛋白 |
| 2.2.4 寄主感染CHV-EP713后致病力衰退的机制 |
| 2.2.5 结论 |
| 第二章 灰葡萄孢菌株CanBc-1的弱毒特性与dsRNA关系研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试菌株 |
| 1.2 供试植物 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 生长速度、菌核及分生孢子产量的测定 |
| 1.5 致病力测定 |
| 1.6 灰葡萄孢菌株CanBc-1单分生孢子后代的分离 |
| 1.7 灰葡萄孢菌株CanBc-1的弱毒特性及dsRNA的水平传染 |
| 1.8 灰葡萄孢菌丝中dsRNA的提取 |
| 1.9 数据的统计方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 灰葡萄孢菌株CanBc-1的弱致病性、培养特性和dsRNA的检测 |
| 2.2 菌株CanBc-1单分生孢子后代的致病力、生长速度及dsRNA的检测 |
| 2.3 菌株CanBc-1的弱毒特性及dsRNA的传递 |
| 3 讨论 |
| 第三章 灰葡萄孢菌株CanBc-1c-78中两条dsRNA片段全长cDNA克隆与序列分析 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 灰葡萄孢菌株及培养基 |
| 1.2 细菌菌株及培养基 |
| 1.3 载体和引物 |
| 1.4 酶及其它试剂材料 |
| 1.5 仪器及设备 |
| 1.6 两条dsRNA片段cDNA序列的克隆 |
| 1.6.1 dsRNA样品的去DNA处理 |
| 1.6.2 用随机引物合成cDNA |
| 1.6.3 大片段dsRNA中间部分序列的cDNA克隆 |
| 1.6.4 dsRNA末端cDNA序列的获取 |
| 1.6.5 cDNA的A-Tailing |
| 1.7 两条dsRNA片段cDNA序列的拼接及分析 |
| 1.8 Northern杂交 |
| 1.8.1 电泳、转膜及固定 |
| 1.8.2 预杂交 |
| 1.8.3 探针标记及杂交 |
| 1.8.4 洗膜及压片 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 两条dsRNA片段的全长cDNA序列 |
| 2.2 全长cDNA序列的验证及分析 |
| 2.3 系统发育树的构建 |
| 3 讨论 |
| 第四章 缺陷型病毒BcMV1-S对BcMV1复制及相关弱毒性状的影响 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 灰葡萄孢菌株及培养基 |
| 1.2 供试植物 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 酶及其它试剂材料 |
| 1.5 仪器及设备 |
| 1.6 灰葡萄孢菌株生长速度和致病力的测定 |
| 1.7 BcMV1-S的水平传染能力的测定 |
| 1.8 荧光实时定量PCR |
| 1.9 数据的统计方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BcMV1-S的水平传染 |
| 2.2 BcMV1-S对BcMV1复制的影响 |
| 3 讨论 |
| 第五章 BcMV1与灰葡萄孢线粒体的共存及病毒感染后线粒体超微结构的观察 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 灰葡萄孢菌株及培养基 |
| 1.2 试剂材料 |
| 1.3 仪器及设备 |
| 1.4 线粒体的分离纯化及dsRNA检测 |
| 1.5 菌丝超薄切片的透射电镜观察(TEM) |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BcMV1与线粒体的共分离 |
| 2.2 线粒体形态的异常 |
| 3 讨论 |
| 第六章 大蒜盲种葡萄孢菌株GarlicBc-72的弱毒特性与dsRNA关系的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试菌株 |
| 1.2 供试植物 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 生长速度及致病力的测定 |
| 1.5 大蒜盲种葡萄孢菌株GarlicBc-72单分生孢子后代的分离 |
| 1.6 大蒜盲种葡萄孢菌株GarlicBc-72的弱毒特性相关dsRNA的水平传染 |
| 1.7 葡萄孢菌丝中dsRNA的提取 |
| 1.8 数据的统计方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 菌株GarlicBc-72的弱致病性、培养特性和dsRNA的检测 |
| 2.2 菌株GarlicBc-72单分生孢子后代的致病力、生长速度及dsRNA的检测 |
| 2.3 菌株GarlicBc-72的弱毒特性相关dsRNA的水平传染 |
| 3 讨论 |
| 第七章 菌株GarlicBc-72菌丝超微结构观察、病毒粒体提取及原生质体转染 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 大蒜盲种葡萄孢菌株及培养基 |
| 1.2 酶及试剂材料 |
| 1.3 仪器及设备 |
| 1.4 病毒粒体的分离 |
| 1.5 菌丝超薄切片和病毒粒体的透射电镜观察 |
| 1.6 病毒粒体的核酸和结构蛋白的检测 |
| 1.6.1 病毒粒体核酸的检测 |
| 1.6.2 SDS-PAGE凝胶的制备及病毒粒体结构蛋白的检测 |
| 1.7 dsRNA病毒核酸体积比的计算 |
| 1.8 原生质体的制备 |
| 1.8.1 菌丝的培养 |
| 1.8.2 酶液的配制 |
| 1.8.3 原生质体的制备 |
| 1.9 病毒粒体的转染 |
| 1.10 转染菌株的筛选及相关性状的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒粒体的负染观察及核酸、结构蛋白的检测 |
| 2.2 不同dsRNA病毒粒体核酸的包装密度 |
| 2.3 菌丝超薄切片的观察 |
| 2.4 转染菌株38T致病力和生长速度衰退 |
| 3 讨论 |
| 第八章 BpRV1全长cDNA克隆、测序及序列分析 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 灰葡萄孢菌株及培养基 |
| 1.2 细菌菌株及培养基 |
| 1.3 载体和引物 |
| 1.4 酶及其它试剂材料 |
| 1.5 仪器及设备 |
| 1.6 BpRV1全长cDNA序列的克隆 |
| 1.6.1 dsRNA样品的去DNA处理及用随机引物合成cDNA |
| 1.6.2 dsRNA-1中间部分序列的cDNA克隆 |
| 1.6.3 两条dsRNA片段末端cDNA序列的获取 |
| 1.6.4 cDNA的A-Tailing |
| 1.7 dsRNA-1及dsRNA-2 cDNA序列的拼接及分析 |
| 1.8 Northern杂交 |
| 1.8.1 电泳、转膜及固定 |
| 1.8.2 DNA探针的地高辛标记 |
| 1.8.3 Northern杂交 |
| 1.8.4 杂交膜的显色 |
| 1.9 病毒粒体结构蛋白的指纹图谱分析(PMF) |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BpRV1的全长cDNA序列 |
| 2.2 BpRV1全长cDNA序列的验证及编码蛋白的分析 |
| 2.3 系统发育树的构建 |
| 3 讨论 |
| 第九章 其他葡萄孢菌株中真菌病毒的检测及序列分析 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 葡萄孢菌株及培养基 |
| 1.2 细菌菌株及培养基 |
| 1.3 载体及引物 |
| 1.4 酶及其它试剂材料 |
| 1.5 仪器及设备 |
| 1.6 菌株中dsRNA片段cDNA序列的克隆 |
| 1.7 两条dsRNA片段cDNA序列的拼接及分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 葱鳞葡萄孢菌株LeekBc-10中与BpRV1同源性极高的真菌病毒 |
| 2.1.1 葱鳞葡萄孢菌株LeekBc-10的弱毒特性与dsRNA检测 |
| 2.1.2 菌株LeekBc-10中dsRNA全长cDNA序列分析 |
| 2.1.3 菌株LeekBc-10中dsRNA病毒的系统进化树分析 |
| 2.2 培养形态异常葡萄孢菌株的dsRNA的检测 |
| 2.3 不同葡萄孢菌株中dsRNA的属性 |
| 3 讨论 |
| 第十章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 常用试剂及培养基配方 |
| 附录2 DNA片段的凝胶回收与纯化 |
| 附录3 病毒基因组cDNA片段的克隆测序 |
| 附录4 灰葡萄孢菌丝总RNA提取 |
| 附录5 博士期间已发表的论文 |
（10）三种大蒜病毒的RT-PCR及多重RT-PCR检测研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 大蒜病毒病及其研究进展 |
| 1.1.1 马铃薯Y病毒属 |
| 1.1.2 香石竹潜隐病毒属 |
| 1.1.3 青葱X病毒属 |
| 1.2 大蒜病毒的病原鉴定及检测方法 |
| 1.2.1 目测法 |
| 1.2.2 生物学测定 |
| 1.2.3 电子显微镜法 |
| 1.2.4 血清学方法 |
| 1.2.5 分子生物学技术 |
| 1.2.5.1 核酸杂交技术（Nucleic acid hybridization） |
| 1.2.5.2 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR） |
| 1.2.5.3 实时荧光定量 PCR(Real-time Fluorescent Quantitative PCR) |
| 1.3 多重PCR体系优化及正交设计在其中的应用 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验材料与试剂 |
| 2.1.2 主要试验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 特异性引物的设计 |
| 2.2.2 基本的分子生物学方法 |
| 2.2.2.1 植物总RNA的提取 |
| 2.2.2.2 PCR产物回收、纯化 |
| 2.2.2.3 DNA片段与pMD18 -TVector连接 |
| 2.2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.2.5 重组质粒的转化 |
| 2.2.2.6 质粒的提取 |
| 2.2.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.3 三种大蒜病毒多重 RT-PCR 检测体系的建立 |
| 2.2.3.1 RT-PCR |
| 2.2.3.2 病毒样品单一PCR扩增 |
| 2.2.4 GLV、LYSV 多重 RT-PCR 检测体系建立 |
| 2.2.4.1 正交设计直观分析法优化多重RT-PCR反应体系 |
| 2.2.4.2 退火温度的筛选 |
| 2.2.4.3 RT-PCR 检测灵敏度测定 |
| 2.2.5 GLV、OYDV、LYSV 两两多重 RT-PCR 检测体系的建立 |
| 2.2.6 多重RT-PCR检测不同品种大蒜植株 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 大蒜总RNA提取 |
| 3.2 GLV、OYDV、LYSV 单一RT-PCR鉴定 |
| 3.3 GLV、LYSV两重RT-PCR反应体系确立 |
| 3.3.1 正交设计直观分析法优化多重RT-PCR反应体系 |
| 3.3.2 多重RT-PCR反应体系确立 |
| 3.3.3 灵敏度测定 |
| 3.4 三种大蒜病毒两重RT-PCR检测体系建立 |
| 3.5 多重RT-PCR产物测序与分析 |
| 3.5.1 GLV序列比对结果与分析 |
| 3.5.2 LYSV序列比对结果与分析 |
| 3.5.3 OYDV序列比对结果与分析 |
| 3.6 应用多重RT-PCR检测不同大蒜品种 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 RNA的提取 |
| 4.2 GLV、LYSV、OYDV的RT-PCR检测 |
| 4.3 多重PCR体系的优化 |
| 4.4 多种病毒的复合侵染 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录：主要试剂及溶液配制 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
四、Genome organization and phylogenetic tree analysis of Garlic virus E,a new member of genus Allexivirus（论文参考文献）
- [1]大蒜气生鳞茎水培诱导技术研究[D]. 顾启玉. 山东农业大学, 2020(11)
- [2]葡萄座腔菌病毒多样性与新型病毒分子生物学特性研究[D]. 杨萌萌. 华中农业大学, 2020
- [3]湖北省水稻纹枯病菌病毒多样性及三个与寄主毒力相关新病毒的分子特性研究[D]. 吕锐玲. 华中农业大学, 2018
- [4]活性氧介导的大蒜试管苗玻璃化发生机制[D]. 刘敏. 南京农业大学, 2018(07)
- [5]大蒜X病毒开放阅读框6编码p15蛋白的功能研究[D]. 张天昊. 沈阳农业大学, 2018(11)
- [6]辣椒及大蒜病毒多重RT-PCR检测体系的建立[D]. 汪沛. 湖南农业大学, 2016(08)
- [7]大蒜病毒Real Time PCR定量检测方法的建立及其应用[D]. 陈辉麟. 甘肃农业大学, 2014(05)
- [8]新疆大蒜病毒脱除及快速繁殖技术研究[D]. 董瑞. 新疆农业大学, 2013(01)
- [9]葡萄孢属植物病原菌真菌病毒研究[D]. 吴明德. 华中农业大学, 2012(11)
- [10]三种大蒜病毒的RT-PCR及多重RT-PCR检测研究[D]. 许蕊. 甘肃农业大学, 2012(01)