一、EXPRESSION AND DELETION ANALYSIS OF EcoRII ENDONUCLEASE AND METHYLASE GENE（论文文献综述）
张佳怡[1]（2021）在《BsaI甲基化酶的表达与功能研究》文中指出
姚洁[2]（2021）在《超灵敏检测DNA羟化酶TET1荧光生物传感器的构建》文中研究表明5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,5m C）作为哺乳动物基因组中重要的表观遗传标记,其重要性已得到广泛认识。越来越多的证据表明,DNA去甲基化在各种生物学过程中起着重要的调节作用。DNA羟化酶TET1（ten-eleven translocation 1）是一种Fe（II）和α-酮戊二酸（α-KG）依赖的双加氧酶,在哺乳动物中负责DNA 5-甲基胞嘧啶（5m C）去甲基化。TET1可以诱导5m C的反复氧化,由此产生的胞嘧啶氧化衍生物可以被胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）识别和清除,产生碱性位点。随后通过碱基切除修复（BER）途径修复产生碱基位点,恢复未甲基化的胞嘧啶,从而在哺乳动物中产生活跃的胞嘧啶去甲基化。TET1表达失调与多种遗传性疾病和癌症密切相关。因此,准确、灵敏地定量TET1活性对于生物医学研究、临床诊断和疾病治疗具有重要意义。在本论文中,我们开发了两种不同的荧光生物传感器来灵敏检测TET1。本文主要包括以下内容:1.基于单量子点无抗体检测TET1荧光共振能量转移生物传感器的构建我们构建了一种基于量子点的荧光共振能量转移（FRET）传感器,这种传感器无需任何抗体即可实现TET1的灵敏检测。在TET1存在条件下,TET1可将5m C转化为5-羟甲基胞嘧啶（5hm C）,然后通过T4噬菌体β-葡萄糖基转移酶（T4-βGT）选择性糖化5hm C,形成β-葡萄糖基-5-羟甲基胞嘧啶（5ghm C）。由此得到的糖基化检测探针不能被甲基化不敏感的限制性内切酶Msp I剪切。随后,糖基化的Cy5/生物素修饰的检测探针可以组装到链霉亲和素包被的QD（605QD）上,获得605QD-DNA-Cy5纳米结构。在488 nm的激发波长下,605QD与Cy5之间发生高效的FRET,导致明显Cy5荧光发射信号。通过单分子检测,可以简单地计数Cy5信号,从而定量TET1活性。与报道的基于抗体的检测方法相比,这种单量子点的FRET生物传感器不涉及大量的TET1特异性抗体、高样本输入和耗时的分离步骤。特异性的TET1介导的羟甲基化和糖基化过程、较高效率的FRET和高信噪比的单分子检测技术使得该单量子点FRET生物传感器实现高灵敏检测TET1,检测限为1.7×10-12 M。重要的是,这种基于单量子点的FRET生物传感器可以准确测量癌细胞中TET1的活性,检测限为1个细胞,并且可以进一步应用于TET1抑制剂的筛选,为临床诊断和药物筛选提供了新的平台。2.基于引物生成滚环扩增（PG-RCA）无标记荧光检测TET1我们建立了基于引物生成滚环扩增（PG-RCA）的无标记荧光检测TET1的方法。在本实验中,靶标TET1可将5m C转化为5hm C,然后5hm C可被T4-βGT选择性糖化形成5ghm C。由此得到的糖基化底物可通过依赖于DNA修饰的核酸内切酶Aba SI进行剪切,产生新的带有游离3’-OH端的DNA片段。以SYBR Gold为荧光指示剂,通过PG-RCA反应检测扩增产物,获得增强的荧光信号。这项工作证明了基于核酸扩增策略无标记荧光检测TET1活性的方法。这种方法无需使用任何荧光团和猝灭剂标签,大大降低了检测成本。该方法在生物医学研究和临床诊断方面具有巨大的潜力。
张明[3]（2021）在《DNA甲基化和H3K4me2拮抗调节BMP4促进鸡PGCs形成的机制研究和潜在应用》文中指出原始生殖细胞（Primordial Germ Cells,PGCs）是配子的前体,精子和卵子的祖细胞,负责代与代之间传递遗传和表观遗传信息,确保物种的延续和生存,并且在发育生物学研究、物种保护以及养殖生产领域有着极其重要的意义。鸟类的PGCs因为其独特的发育特点使其成为保护濒危动物和种质资源恢复的有力工具,然而由于体内分离的PGCs数量有限,诱导体系不成熟使其难以大量获取,限制了其应用。其中的关键问题在于影响PGCs发生具体因素仍不明朗,因此科学家迫切需要剖析和阐明PGCs形成过程中的分子调控机制。近年来,研究者们已经发现了 PGCs发生过程中的众多参与调控的基因、细胞因子、信号通路和表观遗传修饰等因素,本课题组前期研究中已经确定BMP4是鸡PGCs形成中的关键基因,并且全基因组存在DNA和H3K4me2的动态变化,但是其中的具体分子调控机制尚不清楚。而随着基因组学的深入研究,人们愈发认识到基因表达模式中存在多种表观遗传现象同时相互作用从而和其他调控元件构成复杂而有序的遗传分子图谱。所以深入探索DNA和H3K4me2这两种不同表观遗传因素对鸡PGCs形成中的关键基因BMP4的影响和理清这些因素与基因的调控元件互作的模式机制有利于人们更加系统全面地认识鸡PGCs的形成机理。为此,本研究根据鸡生殖细胞上的DNA和组蛋白甲基化的动态变化推测表观遗传因素能够调控关键基因参与PGCs的形成,故首先验证DNA甲基化对PGCs形成的影响并且基于课题组前期在鸡胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells,ESCs）、和PGCs上H3K4me2的ChIP-seq以及DNA甲基化测序MBD-seq结果筛选确定PGCs形成中的关键基因—BMP4,利用dCas9系统验证DNA甲基化对BMP4的靶向调控作用,进而探索DNA甲基化、H3K4me2和转录因子如何共同调控BMP4转录参与PGCs形成的机制。该研究为阐明PGCs发生过程的表观遗传通路,完善优化PGCs诱导形成体系,推广PGCs的研究应用提供思路和依据。研究结果如下:（1）DNA甲基化调控PGCs的形成通过前期ESCs和PGCs中转录组数据分析DNA甲基化修饰酶的表达变化,确定Dnmt3A和Tet1是影响DNA甲基化的关键修饰酶;分别构建了Dnmt3A和Tet1的Dnmt3A-shRNA1、Dnmt3A-shRNA2和Dnmt3A-shRNA3,以及Tet1-shRNA1、Tet1-shRNA2 和Tet1-shRNA3 干扰载体,转染 DF1 细胞qRT-PCR分析Dnmt3A-shRNA1和Tet1-shRNA3干扰活性最佳（P<0.01）,选择作为用于后续验证实验。体内外验证DNA甲基化对PGCs形成的影响,体外实验中干扰Dnmt3A组第4d出现大量类胚体聚团,6d出现大量即将细胞破裂的类胚体,而干扰Tet1第4d和6d都未出现类胚体;Dot-blot检测发现干扰Dnmt3A组甲基化水平显着降低（P<0.05）,干扰了 Tet1后DNA甲基化水平小幅上升;qRT-PCR检测干扰Dnmt3A组6d后Cvh、C-kit、BMP4、Blimp1和Lin28a表达显着上升（P<0.05）,而干扰了Tet1后各基因组出现显着下调（P<0.05）;而流式细胞分析发现干扰Dnmt3A后PGCs形成率显着提升（P<0.05）,干扰Tet1后的PGCs形成率显着下调。体内实验中qRT-PCR检测发现干扰Dnmt3A组BMP4、Cvh和C-kit的表达都显着提高（P<0.05）,Blimp1和Lin28a的表达极显着上调（P<0.01）,干扰Tet1后Cvh、C-kit、BMP4、Blimp1和Lin28a都发生了极显着下调（P<0.01）;流式细胞仪分析发现干扰Dnmt3A后PGCs形成效率显着提升（P<0.05）,干扰Tet1后PGCs形成效率显着下调（P<0.05）。以上结果表明DNA甲基化抑制PGCs的形成,DNA去甲基化促进PGCs的形成。（2）PGCs形成中DNA甲基化和H3K4me2参与调控BMP4基因对ESCs和PGCs的ChIP-seq以及MBD-seq结果进行联合分析,筛选得到PGCs形成过程中受DNA甲基化和H3K4me2调控的TGF-β通路中关键基因BMP4并作为靶基因研究对象。成功构建pBMP4-EGFP-N1载体,验证具有启动活性;成功构建BMP4不同长度缺失片段启动子-basic载体,双荧光素酶报告系统验证pGL3-613极显着高于pGL3-508和pGL3-281（P<0.01）,说明508-613bp为BMP4的核心启动子区。生物信息学方法预测BMP4核心启动子区的CpG岛并通过重亚硫酸盐测序的方法比较在CEFs、ESCs和PGCs中DNA甲基化水平,结果发现ESCs中BMP4启动子区平均DNA甲基化水平显着高于PGCs（P<0.05）;基于组蛋白H3K4me2的ChIP-qPCR发现PGCs中BMP4启动子上H3K4me2富集水平显着高于ESCs（P<0.05）,并且主要集中于核心启动子区;进一步通过qRT-PCR检测发现PGCs中BMP4和Smad1显着高于ESCs（P<0.05）,Bmpr1、Bmpr2和C-kit则极显着高于ESCs（P<0.01）;通过Western Blot检测BMP4信号下游磷酸化p-Smad1/3/5复合蛋白在PGCs中显着高于ESCs（P<0.05）。以上结果说明PGCs形成关键基因BMP4在ESCs和PGCs表达上升伴随着启动子区DNA甲基化水平下降和H3K4me2的富集增多。（3）CRISPR-dCas9介导的TET1靶向BMP4启动子DNA去甲基化促进PGCs形成针对BMP4启动子区CpG岛分别设计三对sgRNA序列,连接至pgRNA-humanized载体重组构建成功sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3引导载体,与dCas9-TET1CD分别组合转染DF1细胞检测激活BMP4效果,经过qRT-PCR检测发现sgRNA和dCas9-TET1CD载体的组合都能极显着增强BMP4表达（P<0.01）,当sgRNA1、2和3混合与dCas9-TET1CD组合共转时BMP4表达达到最高（3.473±0.187）,说明多个sgRNA靶定同一个基因可以达到最佳激活效果。在体外ESCs诱导过程中sgRNA1-3和dCas9-TET1CD共转后通过重亚硫酸盐转化测序发现BMP4启动子区甲基化水平显着下降（P<0.05）,而通过qRT-PCR检测发现BMP4表达极显着升高（P<0.01）,下游信号基因Bmpr1、Smad1表达显着升高（P<0.05）,PGCs的标记基因Blimp1和Lin28a表达量也显着升高（P<0.05）,而Cvh和C-kit的上调更为显着（P<0.01）,而Dnmt3A和Tet1表达无明显差异;Western Blot检测BMP4下游磷酸化p-Smad1/3/5蛋白表达显着上升（P<0.05）;流式细胞仪分析检测PGCs的形成率显着提高（P<0.05）。体内0d尿囊腔注射sgRNA1-3和dCas9-TET1CD后通过qRT-PCR检测BMP4和PGCs形成中的标记基因Cvh、C-kit、Blimp1以及Lin28a表达都显着升高（P<0.05）,Western Blot检测p-Smad1/3/5蛋白显着增加（P<0.05）,流式分析检测发现注射sgRNA1-3和dCas9-TET1CD组的PGCs形成效率显着升高（P<0.05）。以上结果说明靶向BMP4启动子区DNA去甲基化可以增加BMP4表达,促进PGCs的形成。（4）DNA甲基化和组蛋白甲基化拮抗调节BMP4信号参与PGCs的形成通过生物信息学预测BMP4启动子区潜在转录因子LIN54、ZEB1和NFAT5,并通过构建缺失结合位点的核心启动片段连接Basic载体,转染DF1细胞后通过双荧光素酶报告系统检测发现只有在缺失了 ZEB1的结合位点之后启动活性极显着降低（P<0.01）,说明ZEB1是BMP4核心启动子区域的关键转录因子。构建Zeb1的过表达载体之后转染DF1细胞,qRT-PCR检测过表达Zeb1后的Zeb1和BMP4表达量显着上升（P<0.05）,并且Zeb1在体内0-6d的过程中表达逐渐升高;而oe-Zeb1与核心启动片段basic载体共转DF1细胞,双荧光素酶检测BMP4核心启动子片段的启动活性显着升高（P<0.05）,以上结果表明Zeb1作为BMP4转录因子可促进其转录表达。成功构建Dnmt3A和Tet1的过表达载体,与组蛋白去甲基化酶LSD1过表达载体一起共转染DF1细胞后,48h后双荧光素酶报告系统检测发现启动活性极显着下调（P<0.01）,接着转染Tet1和Zeb1的过表达载体96h后再次检测启动活性发生了显着上调（P<0.05）。结果说明DNA甲基化和H3K4去甲基化能够抑制BMP4转录活性,而在DNA去甲基化和转录因子Zeb1能够挽救和增强BMP4的转录活性。ChIP-qPCR检测PGCs细胞发现ZEB1和H3K4me2在BMP4启动子的核心区域都存在富集,干扰了 Dnmt3A时,H3K4me2的富集水平和ZEB1的结合都发生了显着的增加（P<0.05）,CpG岛的DNA甲基化水平显着下降（P<0.05）;而在干扰了组蛋白甲基化酶MLL2后BMP4启动子区的H3K4me2的富集水平和ZEB1的结合都发生了显着的减少（P<0.05）,DNA甲基化水平发生了显着上升（P<0.05）。结果表明DNA去甲基化可以增加BMP4的核心启动子区里H3K4me2的富集和转录因子ZEB1的结合,而H3K4me2去甲基化能够相应的减少H3K4me2和ZEB1的富集和结合,并且DNA甲基化和H3K4me2的富集水平呈拮抗关系,为下一步深入探索表观遗传通路在PGCs形成的具体机制奠定了良好基础。
戴生飞[4]（2021）在《Dmrt1和Foxl3在尼罗罗非鱼性别分化和生殖细胞命运决定中的功能研究》文中认为生殖是最基本的生命活动之一,也是物种延续的保障。生殖包括性别决定、性腺分化、配子发生、受精等一系列过程。脊椎动物的性腺主要由体细胞和生殖细胞构成,其中生殖细胞是唯一能将遗传信息传递至下一代的细胞。因此,脊椎动物性别决定可分为体细胞性别决定和生殖细胞性别决定两部分。胚胎发育过程中,性腺体细胞性别由遗传因子（性别决定基因）和环境因子（光照,温度,p H等）共同决定。传统观点认为,性腺中生殖细胞根据其所处的体细胞环境获得相应的性别。然而,青鳉（Oryzias latipes）中对foxl3的研究挑战了这一观点,缺失foxl3的XX青鳉生殖细胞在雌性体细胞环境中进行了精子发生,并产生可育的精子。由此提出生殖细胞中存在自主的性别决定机制。然而,尚未解决的重要问题是,缺失foxl3后生殖细胞中的哪些关键基因起始了雌性环境中的精子发生过程?在雌性生殖细胞中与foxl3相拮抗的雄性命运决定基因是什么?已有的研究表明,脊椎动物性腺中保守的转录因子dmrt1和foxl2相互拮抗并分别维持雌雄性别分化和性腺发育过程。尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）中结果表明,敲降dmrt1会导致雄性性腺体细胞雌性化和生殖细胞缺失。敲除foxl2或过表达其显复性突变体导致完全的由雌向雄的性逆转。foxl3是foxl2的一个古老的旁系同源基因,罗非鱼foxl3的功能研究尚未见报道。罗非鱼生殖细胞中相互拮抗的雌雄基因是什么?这个问题还有待进一步的研究。本研究通过转录组测序、蛋白免疫印记（Western blot,WB）、荧光原位杂交（FISH）等方法分析了dmrt1和foxl3在尼罗罗非鱼性腺的表达模式和细胞定位。运用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别构建了dmrt1和foxl3单基因突变体,并通过双杂合突变体进一步繁殖获得dmrt1;foxl3双纯合突变体。采用组织学染色（HE）、荧光免疫组化（IF）、荧光原位杂交、real-time PCR等方法,分析了各突变体性腺表型和基因表达情况,并尝试使用外源雌激素（17β-estradiol,E2）和芳香化酶抑制剂（Fadrozole）对突变鱼进行表型回救。最后,利用启动子分析、凝胶迁移（EMSA）和染色质免疫共沉淀（ChIP）等体外实验探究了dmrt1和foxl3之间的相互调控关系。并通过在dmrt1和foxl3突变体中敲降体细胞特异的foxl2,探究了生殖细胞基因和体细胞基因间的上下位关系。具体结果如下:1、尼罗罗非鱼foxl3细胞定位和功能研究。性腺转录组测序结果表明,foxl3在孵化后30天（days after hatching,dah）XX罗非鱼卵巢中表达最高,而不在精巢中表达。荧光原位杂交和生殖细胞标记Vasa共定位结果显示,foxl3 m RNA主要定位于卵巢卵原细胞中,精巢组织中检测不到foxl3的表达。通过CRISPR/Cas9成功突变尼罗罗非鱼foxl3并获得缺失5bp和7bp的两种纯合突变体。组织学检测发现,120 dah天foxl3突变XY鱼精巢发育正常。而foxl3突变XX鱼性腺外形仍像正常卵巢,且存在卵巢的特征结构卵巢腔;但与对照XX鱼不同,foxl3突变XX性腺中不存在卵母细胞而是含有各级生精细胞。这表明foxl3突变导致XX性腺中生殖细胞起始了精子发生。荧光原位杂交和荧光免疫组化结果显示,foxl3突变XX性腺中存在精子细胞（表达Sox30）,而不存在卵母细胞（不表达bmp15和42Sp50）。荧光免疫组化结果显示,突变性腺体细胞中表达雌激素合成的关键酶Cyp19a1a,而不表达雄激素合成酶Cyp11c1。血清激素测定结果表明,foxl3突变XX鱼血清雌激素水平与对照XX雌鱼相比显着降低,但仍然显着高于对照XY雄鱼。与对照XX雌鱼一致,foxl3突变XX鱼血清雄激素（11-ketotestosterone,11-KT）水平很低。表明foxl3突变XX性腺中生殖细胞在雌性化的体细胞环境中进行了精子发生。Real-time PCR结果证实了foxl3突变性腺中体细胞的雌性化环境和生殖细胞中进行的精子发生。值得注意的是,雄性特异基因dmrt1在foxl3突变XX性腺中有显着的升高。另一方面,foxl3的突变不影响XY鱼性腺精子发生过程和育性。2、尼罗罗非鱼dmrt1的表达模式和功能研究。90 dah时,荧光原位杂交结果显示,罗非鱼dmrt1 m RNA定位于精巢中精原细胞、初级精母细胞和支持细胞（Sertoli cell）中,卵巢中没有检测到dmrt1的表达。利用设计的高效CRISPR/Cas9g RNA靶点成功在1号外显子突变尼罗罗非鱼dmrt1,获得缺失2 bp和5 bp的两种纯合突变体。60 dah时组织学检测发现,所有dmrt1突变XY鱼发生了由雄向雌的性逆转,其性腺发育为卵巢。免疫荧光结果表明,dmrt1纯合突变XY鱼性腺中表达雌激素合成酶Cyp19a1a,不表达雄激素合成酶Cyp11c1。成年期dmrt1突变鱼卵子发生正常,性腺中存在有卵黄的卵母细胞。性别决定关键时期4 dah时,免疫荧光结果显示,罗非鱼性别决定基因amhy的表达在XY dmrt1突变性腺不受影响,而另一个重要的dmrt1下游雄性通路基因Gsdf不表达,表明dmrt1突变鱼发生了原发性逆转。孵化后15天时,dmrt1突变XY性腺中可检测到Cyp19a1a的表达。这些结果证实在雄性通路中,dmrt1位于amhy和gsdf之间,也就是说,尼罗罗非鱼雄性通路由amhy-dmrt1-gsdf构成。3、尼罗罗非鱼dmrt1;foxl3双基因突变系的建立及表型分析。利用dmrt1杂合突变XY鱼和foxl3杂合突变XX鱼繁殖获得dmrt1;foxl3双杂合突变XX和XY后代。进一步通过双杂合突变鱼繁殖获得dmrt1;foxl3双纯合突变后代。60 dah时组织学观察发现,dmrt1;foxl3双突变XX鱼性腺生殖细胞发育为卵母细胞,表明dmrt1的缺失回救了XX foxl3突变体生殖细胞性逆转的表型。另一方面,dmrt1;foxl3双突变XY鱼性腺发育为精卵巢,性腺中除卵母细胞外,还存在精母细胞,表明突变foxl3部分回救了XY dmrt1突变体生殖细胞的表型。荧光免疫组化结果显示,双突变性腺中有明显的Cyp19a1a表达。双突变XX/XY鱼血清雌激素水平和对照XX鱼接近。这些结果提示,dmrt1和foxl3在生殖细胞性别命运决定过程中存在相互拮抗的作用。4、尼罗罗非鱼Dmrt1和Foxl3相互调控影响生殖细胞可塑性。Dmrt1和Foxl3双突变鱼生殖细胞性别的相互回救促使我们进一步检测dmrt1在foxl3突变XX性腺中的表达和foxl3在dmrt1突变XY性腺中的表达。RT-PCR、real-time PCR和Western blot结果证实foxl3突变XX性腺中dmrt1在m RNA和蛋白水平显着升高。荧光原位杂交结果显示,dmrt1主要定位于foxl3突变XX性腺中生殖细胞,而不在对照XX卵巢中表达。另一方面,real-time PCR结果显示,dmrt1突变XY性腺中foxl3表达量显着升高。荧光原位杂交结果表明,30 dah时dmrt1突变XY性腺中生殖细胞表达foxl3,而对照XY性腺生殖细胞中不表达foxl3。进一步的调控实验证实,在HEK293细胞中,Dmrt1和Foxl3分别以剂量依赖的方式下调foxl3和dmrt1的启动子活性。删除或突变相应的启动子上结合位点,可以去除两者之间的抑制效果。凝胶迁移和染色质免疫共沉淀实验分析表明,Dmrt1和Foxl3可以在体外直接结合foxl3和dmrt1启动子上相应的结合位点。这些结果表明,Dmrt1和Foxl3通过直接结合对方启动子发挥转录抑制作用。利用外源雌激素处理对foxl3突变鱼进行回救。结果显示,E2处理1个月后foxl3杂合突变XY鱼性腺发育为卵巢,而foxl3突变XX鱼性腺中生殖细胞仍进行精子发生,不能诱导卵母细胞产生。表明foxl3是生殖细胞中雌激素下调dmrt1诱导卵母细胞发育所必须的关键基因。采用芳香化酶抑制剂（Fadrozole,aromatase inhibitor,AI）回救dmrt1突变鱼。结果显示,同批处理的dmrt1杂合突变XX鱼发生性逆转,而处理的dmrt1突变XX/XY鱼性腺仍发育为卵巢。Real-time PCR结果显示,AI处理后dmrt1突变性腺中foxl3表达水平与对照雌鱼接近。这些结果表明,AI诱导的由雌向雄的性逆转依赖于dmrt1的存在。突变foxl3或dmrt1后导致的性逆转不能被雌激素或芳香化酶抑制剂回救,表明生殖细胞的可塑性依赖于这两个基因的存在。不同的是,双突变dmrt1;foxl3后再使用AI处理,双突变XX/XY鱼性腺发育为精巢,性腺中不存在卵母细胞。表明突变foxl3后再抑制雌激素合成,能够回救Dmrt1缺失造成的性逆转。此外,AI处理foxl3突变XX鱼后,其性腺发育为正常精巢。前期研究结果表明,敲降或敲除foxl2会导致XX罗非鱼发生性逆转。AI处理的dmrt1突变性腺仍发育为卵巢,这可能是由于foxl2不能被有效抑制所致。在dmrt1突变鱼中敲降foxl2后,dmrt1;foxl2双突变XX/XY性腺发育为精巢,但生殖细胞数目显着减少,且不能起始精子发生。表明dmrt1对于生殖细胞的存活和精子发生的起始是必需的。综上所述,尼罗罗非鱼dmrt1和foxl3分别表达于精巢和卵巢组织中,体外实验证实二者间存在直接的转录抑制。突变dmrt1或foxl3分别导致由雄向雌和生殖细胞由雌向雄的性逆转。双突变体表型分析证实,dmrrt1和foxl3在尼罗罗非鱼生殖细胞性别命运决定过程中起着相互拮抗的作用。外源雌激素和芳香化酶抑制剂回救实验表明,罗非鱼生殖细胞的可塑性依赖于这两个基因的存在。敲降foxl2后,foxl3和dmrt1单突变性腺都发育为精巢,但缺失dmrt1导致精子发生不能正常起始。本研究解析了尼罗罗非鱼dmrt1和foxl3在雌雄性别分化和生殖细胞性别命运决定过程中的关键功能,揭示了dmrrt1和foxl3通过直接的转录抑制作用相互拮抗,决定生殖细胞性别的分子机制,丰富了我们对脊椎动物性别分化和生殖细胞性别决定的认识。
汪艳红[5]（2021）在《结直肠癌中寡肽转运体PEPT1的表观遗传调控机制及其转化应用研究》文中进行了进一步梳理结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是最常见消化道恶性肿瘤之一,在全球恶性肿瘤中发病率排名第三,死亡率排名第二。在我国,CRC的发病率也在逐年上升,且发病年龄趋向低龄化。尽管得益于诊断技术和治疗手段的进步,CRC的发病率和死亡率在全球范围内已有所下降,但晚期伴随转移的患者诊断率仍然很高,且治疗手段有限。因此亟待寻找结直肠早期病变的诊断手段和新的治疗策略以减少CRC发病率和死亡率。表观遗传修饰是指不改变DNA序列的情况下,发生的可遗传的基因表达变化,主要包括DNA甲基化,组蛋白修饰,非编码RNAs和RNA甲基化,与CRC等多种肿瘤的发生发展及转移密切相关。其中DNA甲基化和mi RNAs最有望成为CRC的早诊和预后标志物,如SEPT9基因的DNA甲基化检测试剂盒已被商品化并应用于临床上CRC的早期诊断。而组蛋白修饰作为生物标记物的研究因为其作用机制复杂,检测技术的局限和对不同肿瘤缺少特异性,还处在初期阶段。RNA甲基化在CRC中的相关研究也还不成熟。因此,阐述结直肠癌中基因的表观遗传调控机制对于了解CRC的发病机制,以及开发新的生物标记物和药物治疗靶点都有重要意义。化疗仍然是目前CRC主要的辅助治疗手段,能够提高患者的生存期,然而CRC中存在的不同耐药机制使得药物临床化疗效果不佳,因此急需开发新的CRC治疗手段。引起肿瘤耐药的主要分子机制包括药物摄取的减少和药物外排的增加,由此我们推测介导化疗药物摄取与外排的药物转运体在肿瘤中的表达水平差异是引起CRC对化疗药物耐药的关键因素之一。寡肽转运蛋白PEPT1（由SLC15A1编码）主要分布于肠道上皮细胞的刷状缘膜上,在肾小管、胆管等组织中也能检测到其表达。PEPT1转运体主要负责机体内二肽、三肽类物质的摄取,包括一些结构相似的拟肽药物,例如血管紧张素抑制剂西罗普利,-内酰胺类抗生素头孢菌素,抗肿瘤药物乌苯美司等。由此我们推测CRC中PEPT1转运体的表达水平可能与二肽类抗肿瘤药物乌苯美司对CRC的化学治疗效果相关。本课题我们通过表征配对的CRC肿瘤及其癌旁组织中PEPT1的基因表达,发现PEPT1在CRC肿瘤组织中表达丢失现象,并阐明DNA甲基化、组蛋白乙酰化对PEPT1基因的转录调控机理。我们发现在CRC肿瘤组织中异常高表达的DNMT1介导了PEPT1基因近端启动子区CGI位点的高甲基化状态;同时,远端启动子区HDAC1的富集阻遏P300催化转录激活信号H3K18/27Ac,最终导致PEPT1基因的转录抑制。最后,我们通过体外细胞实验和体内荷瘤小鼠模型评估了表观遗传药物地西他滨和PEPT1转运体底物乌苯美司联合用药方案的有效性和安全性,为CRC的治疗提供了新的指导策略,也为CRC治疗药物的开发提供了有潜力的作用靶点。
李源[6]（2020）在《RNA m6A共转录调控组蛋白H3K9me2去甲基化的作用和机制研究》文中指出m6A是mRNA和lncRNA上一种广泛存在的修饰,它从酵母到人等多个物种中都保守存在且其共有基序为RRm6ACH（R=G or A,H=A,C or U）[1-3]。m6A通过其核心甲基化转移酶复合物METTL3-METTL14共转录产生[4-6],并且被去甲基化酶FTO/ALKBH5去除[2,7]。m6A可以被含有YTH结构域的家族蛋白所识别从而调控多种转录后过程。m6A的失调会导致多个关键的生物学过程失衡[8]。越来越多的证据证明了转录这个过程能够调控染色质的动态变化[9,10]。但共转录产生的m6A对染色质的直接调节作用仍然未知。表观基因组的动态变化对于基因在发育和健康生理过程中的正确表达至关重要[11-15]。其中转录是这个过程的核心[10,16-20]。转录整合了染色质结构和修饰变化带来的细胞信号,转录复合物以及mRNA修饰,如共转录发生的m6A修饰。然而动态表观基因组有机整合这几方面信息的作用和机制尚未阐明,基于此,我们对组蛋白修饰与共转录的RNA m6A修饰进行了研究。首先,我们建立了一个筛选组蛋白修饰的报告系统,发现当转录本上发生了m6A修饰时,对应的染色质上抑制型组蛋白修饰标志物H3K9me2会被特异地去除。而其他的组蛋白修饰则变化不大。接着,我们构建了 m6A甲基化转移酶复合物METTL3、METTL14的突变和敲低细胞系,发现H3K9me2水平整体升高,表明METTL3/METTL14可以调控组蛋白修饰H3K9me2。为进一步阐明是甲基转移酶还是m6A介导的H3K9me2改变,我们建立了 METTL3酶活突变体细胞系,发现H3K9me2同样发生了整体的升高,提示m6A可以调控组蛋白修饰H3K9me2。继而,我们通过MeRIP-seq和ChIP-seq等实验发现m6A、METTL3和H3K9me2的去甲基化酶KDM3B在全基因组尺度上有很强的相关性。再进一步通过Co-IP、ChIP-seq和dPspCas13b招募实验确认了 m6A的识别蛋白YTHDC1和KDM3B有相互作用,且YTHDC1可以招募KDM3B到m6A相关的区域,从而促进对应位置上H3K9me2去甲基化和基因的表达。最后,我们通过RNA-seq和Pol Ⅱ ChIP-seq,发现m6A能够促进H3K9me2调控的基因的表达。总之,本研究首次确立了 RNAm6A修饰与动态组蛋白修饰之间的直接关系,并且提供了对RNA修饰和组蛋白修饰之间的共转录相互作用的机制性见解,从而将RNA m6A修饰、组蛋白修饰和转录调控有机整合起来,对RNA表观修饰领域有重要的推动作用。
陈荣珠[7]（2020）在《龙眼体细胞胚胎发生早期AGO基因家族的全基因组鉴定、表达与功能分析》文中进行了进一步梳理龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是我国华南地区具有较高经济价值的热带亚热带果树。龙眼果实质量和产量与其胚胎发育息息相关。植物体细胞胚胎与合子胚在发育过程基本相似,可作为研究植物胚胎发生机制的优良替代体系。植物体胚发生过程不仅受特异基因的调控,还受表观遗传调控,尤其是DNA甲基化,一定水平的DNA甲基化对植物体胚的正常发育是必须的。mi RNA能够介导DNA的甲基化,该过程与mi RNA加工合成途径中的相关蛋白有关,AGO作为mi RNA加工合成途径中的关键蛋白,参与介导DNA的甲基化,因此,AGO基因可能参与调控植物的体胚发生过程,但是具体作用机制尚不清楚,目前,关于龙眼AGO表达调控和功能特异性研究仍有大量空白。因此,本研究首先从三代测序的龙眼基因组数据库中鉴定出AGO基因家族,对Dl AGOs家族的表达模式进行了分析,利用异位表达的方法对龙眼AGO基因及启动子功能进行研究。最后,进行了龙眼胚性愈伤组织去甲基化的转录组学分析。以此来探究AGO在龙眼体胚发生早期的甲基化调控机制。主要研究结果如下:1龙眼体胚发生早期AGO家族的全基因组鉴定、生物信息学分析及Dl AGO4、Dl AGO7、Dl AGO10和Dl AGOMEL1 c DNA的克隆从龙眼基因组数据库中共鉴定出AGO家族10个成员,并根据注释到拟南芥或水稻中的成员进行命名。这些Dl AGOs基因分布于龙眼1、4、8、10、12、13、14和15号染色体,编码794-1064个氨基酸,含有AGO典型的保守结构域,且该家族的蛋白质均为亲水的碱性蛋白。系统进化树分析表明,不同物种的AGO可被分成4个分支,龙眼AGO与甜橙AGO亲缘关系最近。RT-PCR结合RACE法从龙眼EC中克隆获得了Dl AGO4、Dl AGO7、Dl AGO10和Dl AGOMEL1基因的c DNA全长序列,其长度分别为3425 bp、3418 bp、3775 bp和3289 bp。Dl AGOs基因家族成员的氨基酸序列同源性较低,可能与其功能的多样性有直接的关系。2龙眼Dl AGOs启动子的克隆与生物信息学分析克隆获得了Dl AGOs基因5’端侧翼序列长度分别为1437 bp、1809bp、1514 bp、1807 bp、1707 bp、1722 bp、1784 bp、1746 bp、1794 bp和1512 bp。生物信息学分析表明,Dl AGO1、Dl AGO4和Dl AGO5-2启动子含有Cp G岛区域;Dl AGOs启动子序列除了含有大量的核心元件TATA-box和CAAT-box外,还含有多种光响应、激素应答、环境胁迫响应等元件,说明龙眼AGO基因在激素响应、光响应及抗逆等方面可能具有调控作用。3龙眼Dl AGOs家族的表达模式分析Dl AGOs不同成员在龙眼体胚发生早期阶段及合子胚发育阶段均有表达,尤其在胚胎发生的早中期具有较高的表达,不同成员具有一定功能的分工和互补,可能参与调控龙眼胚胎发生发育过程。Dl AGOs在龙眼不同组织部位中的时空表达具有特异性,可能参与龙眼种子、花、幼果和茎的发育调控。Dl AGOs基因在激素处理、不同光质处理、高温和低温处理、盐胁迫、渗透胁迫、干旱胁迫以及ABA处理下均有响应,说明它们广泛参与了激素应答、光响应及非生物胁迫应答,但是不同成员具有不同的表达模式,这也体现了AGO基因家族成员之间功能的多样性。4龙眼Dl AGOs启动子的功能验证构建龙眼Dl AGOs启动子表达载体瞬时转化烟草叶片和龙眼胚性愈伤组织EC,利用组织化学染色、GUS基因的瞬时表达及启动子激素应答分析。结果显示,Dl AGOs启动子均具有驱动GUS基因表达的活性,其中pro AGO5-1的驱动能力最强,ABA诱导Dl AGOs启动子的转录活性,部分启动子受Me JA、SA和GA3的诱导,推测龙眼Dl AGOs启动子为激素诱导型启动子。5 Dl AGO7、Dl AGO10和Dl AGOMEL1的亚细胞定位研究构建融合表达载体,瞬时转化洋葱内表皮细胞,以GFP为报告基因,利用激光共聚焦显微镜观察表达情况,亚细胞定位结果表明,龙眼Dl AGO7主要定位于细胞核中,而Dl AGO10和Dl AGOMEL1主要定位于细胞质中。6 5-氮胞苷对龙眼体胚发生早期及Dl AGOs表达的影响2,4-D和5-azac均会影响植物体胚的发生,本研究用2,4-D（0.1、0.5、1.0 mg/L）与5-氮胞苷（5-azac:0、5、25、50、100 uM）配合处理龙眼胚性愈伤组织。显微观察发现,5 uM 5-azac与0.1 mg/L或0.5 mg/L 2,4-D配合使用,有利于球形胚产生;定量结果表明,Dl AGOs响应2,4-D和5-azac的处理,其中Dl AGO4在5 uM 5-azac处理下呈上调表达。在MS培养基中添加0、2.5、5 uM 5-azac处理龙眼EC 1、3、6、9和12 d,显微观察发现,培养第9 d,对照组未出现球形胚,而处理组中的龙眼胚性愈伤组织均发育至球形胚阶段;培养到第12 d,对照组和处理组均出现了球形胚;定量结果表明,低浓度5-azac处理9d促进Dl AGO4基因的表达。7 5-氮胞苷处理下龙眼体胚发生早期的转录组学分析用2.5 uM 5-azac处理龙眼EC 9 d,以不加5-azac为对照组,采用BGISEQ-500测序平台进行RNA高通量测序。测序结果表明,对照组与处理组相比总共有1,617个差异表达的基因,主要富集在植物病原互作、植物激素信号转导、植物MAPK信号通路、淀粉和糖代谢及丁酸盐代谢、C5-支化二元酸代谢、硫代谢、硒代化合物代谢等代谢通路。5-azac处理后,龙眼DNA甲基化水平降低,促进与龙眼体胚发生相关基因（FUS3、ABI3、FT1、GABA-T3、CAS、GLP等）和AGO4基因上调表达,从而促进龙眼早期体胚的发生。因此,5-azac处理促进龙眼Dl AGO4基因的表达,Dl AGO4与24-nt lmi RNA结合抑制DNA甲基化,促进龙眼体胚发生;5-azac抑制组蛋白乙酰化促进龙眼体胚发生;丁酸盐促进组蛋白丁酰化促进龙眼体胚发生,同时,丁酸盐代谢还参与植物抗逆。
吉忠忠[8]（2020）在《Setd2在造血干细胞干性维持和淋巴谱系分化中的作用及机制研究》文中研究说明适应性免疫系统是人类识别并抵抗外界多种抗原并得以长寿的主要保障,其主要由T、B淋巴细胞组成。T、B淋巴细胞发育早期,通过抗原受体基因中V、D、J重排产生多样化的抗原受体是免疫系统得以识别多种抗原的根本原因。V（D）J重排是由RAG1/2蛋白复合物起始的抗原受体基因的DNA重排,而在细胞中DNA缠绕由组蛋白形成核小体上进而组成染色体,因此,组蛋白特定位点氨基酸上的蛋白修饰可能会参与到V（D）J重排过程进而参与调控淋巴细胞的发育。H3K36me3是由SETD2催化产生并且在物种间高度保守的组蛋白修饰。在本论文中,我们系统的探索了小鼠Setd2以及其催化产物H3K36me3在造血系统尤其是在淋巴细胞发育中的作用。利用转基因小鼠模型我们发现在造血系统中敲除Setd2之后导致了外周血淋巴细胞比例明显地减少,并且使得骨髓中造血干细胞和淋巴祖细胞的发育异常。进一步我们发现T、B细胞在DN3和pro-B时期发生发育受阻。为了排除造血系统中其他细胞的影响我们分别在T、B细胞谱系中特异性敲除Setd2之后也发现了一致的表型。我们通过V（D）J重排分析发现Setd2缺失后导致的淋巴细胞发育异常是由于异常的V（D）J重排所导致。进一步我们利用染色质免疫共沉淀、RNA-seq、免疫印迹等实验技术探索了可能的分子机制。我们发现在Setd2缺失后导致了重组蛋白RAG1对TCRβ和Igh位点RSS的识别效率降低,并且导致了DNA损伤响应蛋白ATM的激活异常,使得重排位点DNA的双链断裂后不能被高效的修复。另外,我们分析了先天性免疫缺陷病人全外显子测序信息后发现了SETD2的突变,在体外模拟了这一类突变之后,我们发现包含病人来源突变的SETD2不能有效的催化形成H3K36me3。综上,本论文系统的阐述了Setd2在淋巴细胞V（D）J重排中的作用机制,并给临床诊断和治疗先天性免疫缺陷疾病提供了新的靶点。
范士凯[9]（2020）在《DNA去甲基化在拟南芥应答镉胁迫中的作用》文中认为作物镉积累阻控措施是实现大量中低程度的镉污染土地安全生产的有效途径之一,而植物对镉的吸收积累特性以及调控机制是研发上述措施的重要理论基础。近期的研究发现,表观遗传修饰特别是DNA甲基化可能在调控镉胁迫过程中发挥重要的作用。植物体内的DNA甲基化模式和水平主要由DNA甲基化和DNA去甲基化动态调控,但镉胁迫是如何诱导DNA甲基化变异的以及镉胁迫诱导的DNA甲基化变化对植物镉耐性的影响机制仍然不清楚。为此,本文以拟南芥为研究材料,系统研究了镉诱导的DNA甲基化变异在植物响应镉胁迫中的作用机制。主要研究结果如下:以野生型即哥伦比亚型（Col-0）拟南芥为实验材料,结合全基因组重亚硫酸盐测序技术（WGBS）技术,首先研究了镉胁迫下拟南芥DNA甲基化组的变化。镉处理（+Cd）导致植物体内DNA甲基化平均水平升高,但与CG甲基化类型相比,CHG和CHH（H代表A,C或T）甲基化类型更容易受镉影响。采用滑动窗口方法,识别到了5806个差异甲基化区域（DMRs）,均是CHG或CHH类型。进一步通过基因组注释发现大多数CHNDMRs都与转座子重叠,其分布模式与转座子在基因组本身的分布相似,这表明镉胁迫诱导了DNA甲基化水平的增加,更偏向于CHG和CHH类型和转座子。进一步采用RNA高通量测序技术（RNA-seq）和定量PCR技术,研究了镉胁迫对主要涉及表观遗传学过程基因表达的影响,发现DNA去甲基化中的三个基因ROS1（Repressor Of Silencing 1）,DML2（Demeter-like 2）和DML3的表达都被镉强烈抑制。为此,通过完全聚类分析,主成分分析和相关性系数分析对镉诱导的DMRs在Col-0和rdd突变体（ROS1,DML2和DML3功能都缺失的突变体）之间进行了对比分析。发现Col-0在+Cd下甲基化模式与rdd突变体在-Cd和+Cd下的甲基化模式均相似。上述结果表明镉诱导的DMRs与ROS1/DML2/DML3介导的DNA去甲基化的抑制有关。进而以Col-0与rdd突变体为材料,研究了镉诱导的DNA甲基化变异在植物镉耐性中的作用。在20μM或40μM的镉处理条件下,rdd突变体的生长显着优于Col-0,而加DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷（5-aza）处理后,Col-0与rdd突变体生长差异变小。这表明镉诱导的基因组超甲基化有利于改善植物的镉耐性。进一步研究了ROS1,DML2和DML3在植物镉耐性中的冗余性。在40?μM镉处理条件下,单突ros1、双突ros1/dml2、ros1/dml3和dml2/dml3的生长均优于Col-0植株,但仍劣于rdd三突;而单突dml2和dml3的生长与Col-0植株无明显差异。这些结果表明ROS1,DML2和DML3在负调控植物镉耐性中存在部分冗余性,其中ROS1的贡献最大。通过分析植物组织中的镉发现,rdd突变体根部的镉浓度明显低于Col-0;而在地上部,二者之间无明显差异。另一方面,5-aza处理却增加了Col-0植物根部的镉浓度,而对地上部的镉浓度也无明显影响。这表明增加植物体内的DNA甲基化水平有利于降低根系的镉积累。进而采用非损伤微电极系统测定了根系的镉吸收速率,发现Col-0与rdd突变体之间的净镉离子吸收速率在所检测的根系部位无显着的统计学差异。同样,5-aza处理对Col-0根系的净镉离子吸收速率也无明显影响。这两方面结果显示DNA甲基化的变异可能对于根系镉离子的吸收没有作用。因此,DNA甲基化水平提高所降低的根系镉浓度不是根系镉吸收减少所致,而可能是通过增强植物镉耐性改善植物生长所形成的稀释作用来实现的。为此,研究了ROS1,DML2和DML3负调控植物镉耐性的作用机制。通过转录组测序分析发现,镉胁迫下,细胞内应答铁饥饿过程的基因表达在Col-0与rdd突变体之间存在显着差异,其中b HLH38,b HLH100,b HLH101,PYE,MTP3,IREG1,IREG2和IRT1等8个参与铁的吸收转运和稳态平衡的基因在rdd突变体的表达显着高于在Col-0中的表达。此外,rdd突变体根部的铁含量也明显高于Col-0。这表明DNA甲基化水平提高有助于改善根系的铁营养。进一步研究发现低铁（1μM）处理使Col-0与rdd突变体的镉耐性差异消除。上述结果表明根部铁营养改善是DNA甲基化水平提高改善植物镉耐性的原因。综上,镉胁迫首先抑制DNA去甲基化酶基因ROS1,DML2和DML3的表达,进而伴随全基因组DNA甲基化程度的增加。基因组超甲基化导致参与铁吸收转运和平衡过程相关基因表达水平的升高,从而通过改善植物体内的铁营养缓解镉毒。
李胜杰[10]（2019）在《耐辐射奇球菌特异DNA甲基化修饰模式及其参与维持基因组稳定性的功能研究》文中研究说明耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）具有极强的DNA损伤修复能力,对电离辐射、紫外线、干燥以及各种DNA损伤化学试剂等引起的突变和致死效应都具有超强的抗性,被誉为世界上“最顽强的细菌”。耐辐射奇球菌作为研究生物体DNA损伤修复及基因组稳定性维持的模式生物之一,对其生存机理的研究将有助于深入认识极端环境压力下的生命活动过程和特有规律具有重大意义。本研究应用生化与分子生物学等技术方法鉴定了耐辐射奇球菌特异的DNA甲基化修饰模式及其关键DNA甲基转移酶,发现其在维持耐辐射奇球菌基因组稳定性中具有重要作用,阐明了该DNA甲基转移酶的生化特性,研究了DNA甲基化修饰对耐辐射奇球菌基因转录水平的调控作用。（1）利用第三代单分子实时测序技术（SMRT-Seq）对耐辐射奇球菌R1株（D.radiodurans R1,DraR1）基因组进行重测序及DNA甲基化修饰预测分析。通过构建甲基转移酶敲除株、超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱分析及SMRT-Seq等方法发现,DraR1基因组主要以N4-methylcytosine（4mC）修饰为主,含量约为1.3‰4mC/dC,由DNA甲基转移酶M.DraR1（Methyltransferase from DraR1）介导催化形成,修饰发生在“CCGCGG”保守motif上的第二个胞嘧啶C的N4位上;其次为N6-methyladenosine（6mA）修饰,含量约为0.4‰6mA/dA,由ORF2230P、ORF14075P和ORF15360P编码的甲基转移酶催化形成,但未鉴定到与该修饰有关的保守motifs;而5-methylcytosine（5mC）修饰的含量极其微弱,且没有发现相关甲基转移酶。因此,4mC甲基化修饰为耐辐射奇球菌的表观遗传标志。（2）通过对耐辐射奇球菌M.DraR1的生物信息学分析发现,其氨基酸序列中含有典型的DNA甲基转移酶保守结构域,从N端至C端依次为含“FxGxG”保守motif的甲基供体SAM结合域、TRD底物识别域及“SPPY”甲基转移催化域,属α型DNA甲基转移酶类;体内和体外生化功能分析结果显示,M.DraR1具有底物识别特异性,可严格地结合并甲基化修饰含“CCGCGG”保守位点的DNA底物,保护其免受同源性限制性内切酶SacII的切割,进一步证实了M.DraR1可介导催化耐辐射奇球菌基因组4mC甲基化修饰的形成。（3）通过表型分析并结合RNA-Seq测序,研究了4mC甲基化修饰对耐辐射奇球菌的生物学意义。结果显示,敲除M.DraR1基因后并不会影响耐辐射奇球菌的生长能力,但会引起该物种对高剂量的DNA损伤因子变得敏感,如UV、γ-ray辐照等;同时,还会显着提高耐辐射奇球菌的自发突变率、自然转化效率及重组率,表明4mC甲基化修饰的缺失会引起耐辐射奇球菌基因组的不稳定性。荧光显微镜和透射电镜结果显示,缺失4mC甲基化修饰后,耐辐射奇球菌中部分细胞表现出染色质DNA弥散、类核区扩大的特殊行为;转录组测序分析结果显示4mC修饰的缺失将导致DNA损伤响应和DNA修复等相关转录本的富集。这些结果暗示着4mC修饰可能通过影响耐辐射奇球菌DNA构象来调控其转录水平,进而参与维持其自身基因组的稳定性。综上所述,本研究鉴定了耐辐射奇球菌基因组特异的DNA甲基化修饰模式及其DNA甲基转移酶M.DraR1,结果表明4mC甲基化修饰具有参与维持该物种基因组稳定性的重要功能,首次揭示了4mC修饰在耐辐射奇球菌中介导的表观调控作用。研究结果加深了对DNA 4mC甲基化修饰参与维护耐辐射奇球菌基因组稳定性功能作用的新认识,而且也为深入研究细菌限制-修饰系统的表观调控分子机制奠定了理论基础。
二、EXPRESSION AND DELETION ANALYSIS OF EcoRII ENDONUCLEASE AND METHYLASE GENE（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、EXPRESSION AND DELETION ANALYSIS OF EcoRII ENDONUCLEASE AND METHYLASE GENE（论文提纲范文）
（2）超灵敏检测DNA羟化酶TET1荧光生物传感器的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 表观遗传学概述 |
| 1.2 DNA甲基化和DNA羟甲基化 |
| 1.2.1 DNA甲基化 |
| 1.2.2 DNA羟甲基化 |
| 1.3 TET蛋白 |
| 1.3.1 TET蛋白的结构与功能 |
| 1.3.2 TET蛋白介导的去甲基化过程 |
| 1.3.3 TET蛋白与疾病的关系 |
| 1.3.4 TET蛋白的检测方法 |
| 1.4 本论文的研究意义 |
| 第二章 无抗体单量子点荧光共振能量转移传感器灵敏定量TET1 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 TET1 检测 |
| 2.2.3 荧光光谱测量和凝胶电泳 |
| 2.2.4 单分子检测 |
| 2.2.5 细胞培养和细胞提取 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 TET1 活性测定原理 |
| 2.3.2 凝胶电泳分析 |
| 2.3.3 荧光光谱分析 |
| 2.3.4 荧光寿命分析 |
| 2.3.5 单分子检测分析 |
| 2.3.6 限制性内切酶Msp I用量的优化 |
| 2.3.7 检测探针与605QD比率的优化 |
| 2.3.8 灵敏度分析 |
| 2.3.9 特异性检测 |
| 2.3.10 动力学分析 |
| 2.3.11 抑制剂分析 |
| 2.3.12 实际样品分析 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 基于恒温扩增的无标记荧光法检测TET1 的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 TET1 检测 |
| 3.2.3 滚环扩增反应 |
| 3.2.4 荧光光谱测量和凝胶电泳 |
| 3.2.5 实时荧光检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 TET1 活性测定原理 |
| 3.3.2 凝胶电泳分析 |
| 3.3.3 荧光光谱分析 |
| 3.3.4 实时荧光分析 |
| 3.3.5 实验条件的优化 |
| 3.3.6 灵敏度分析 |
| 3.3.7 特异性检测 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的研究成果及获奖情况 |
| 致谢 |
（3）DNA甲基化和H3K4me2拮抗调节BMP4促进鸡PGCs形成的机制研究和潜在应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 PGCs起源和迁移 |
| 1.1.1 PGCs的起源和分子特征 |
| 1.1.2 PGCs的迁移 |
| 1.2 PGCs发生的分子调控进展 |
| 1.2.1 调控PGCs的相关细胞因子 |
| 1.2.2 调控PGCs的相关基因 |
| 1.2.3 调控PGCs的相关信号通路 |
| 1.3 PGCs形成过程中的表观遗传因素 |
| 1.3.1 DNA甲基化研究进展 |
| 1.3.2 组蛋白甲基化研究进展 |
| 1.4 CRISPR-dCas9技术应用进展 |
| 1.4.1 CRISPR-dCas9技术概述 |
| 1.4.2 CRISPR-dCas9在转录调控和表观遗传中应用 |
| 1.5 本课题组前期研究发现 |
| 1.6 本课题的研究目的意义 |
| 1.7 本研究应用与展望 |
| 1.8 参考文献 |
| 第2章 DNA甲基化调控PGCs的形成 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 细胞分离培养 |
| 2.1.5 Dnmt3A和Tet1干扰载体构建和活性检测 |
| 2.1.6 体外验证DNA甲基化在PGCs形成中的功能 |
| 2.1.7 体内验证DNA甲基化在PGCs形成中的功能 |
| 2.1.8 数据分析统计 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 DNA甲基化酶的表达分析和筛选 |
| 2.2.2 2.2 DNA甲基化和去甲基化酶干扰载体构建及活性检测 |
| 2.2.3 体外验证DNA甲基化调控PGCs的形成 |
| 2.2.4 体内验证DNA甲基化调控PGCs的形成 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 2.5 参考文献 |
| 第3章 PGCs的形成中DNA甲基化和H3 K4me2参与调控BMP4基因 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 ChIP-seq和MBD-seq联合分析筛选PGCs形成中关键基因 |
| 3.1.5 BMP4启动子核心区域分析和筛选 |
| 3.1.6 BMP4启动子区CpG岛预测和引物设计 |
| 3.1.7 BMP4启动子区甲基化检测 |
| 3.1.8 ChIP-qPCR检测BMP4启动子区H3 K4me2的富集情况 |
| 3.1.9 qRT-PCR检测BMP4信号在不同细胞中表达 |
| 3.1.10 Wersterm blot检测BMP4信号在不同细胞中表达 |
| 3.1.11 数据分析统计 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 BMP4基因受表观遗传调控 |
| 3.2.2 BMP4启动子核心区域筛选分析 |
| 3.2.3 PGCs的形成中DNA甲基化靶基因BMP4的验证 |
| 3.2.4 PGCs形成中BMP4上H3K4me2富集情况 |
| 3.2.5 BMP4和下游信号在不同细胞中表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 3.5 参考文献 |
| 第4章 CRISPR-dCas9介导的TET1靶向BMP4启动子DNA去甲基化促进PGCs形成 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 dCas9-TET1系统构建和活性验证 |
| 4.1.5 体内外验证靶向BMP4去甲基化对PGCs形成的影响 |
| 4.1.6 数据分析统计 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 dCas9-TET1去甲基化系统构建和活性验证 |
| 4.2.2 体内外验证靶向BMP4去甲基化促进PGCs形成 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 参考文献 |
| 第5章 DNA甲基化和组蛋白甲基化拮抗调节BMP4信号参与PGCs的形成 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.1.4 BMP4启动子区转录因子预测和筛选 |
| 5.1.5 DNA甲基化和H3K4me2调控BMP4转录机制的探索 |
| 5.1.6 数据分析统计 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 转录因子的预测筛选和验证 |
| 5.2.2 DNA甲基化和H3K4me2对BMP4启动活性影响 |
| 5.2.3 探索DNA甲基化和H3K4me2拮抗调控BMP4转录机制 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 5.5 参考文献 |
| 本文结论与创新 |
| 本文结论 |
| 本文创新点 |
| 论文有待进一步探究问题和计划 |
| 附录 |
| 实验室细胞分离方法 |
| 原始数据附表 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 论文发表 |
| 专利申请和主持科研项目 |
| 致谢 |
（4）Dmrt1和Foxl3在尼罗罗非鱼性别分化和生殖细胞命运决定中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1 脊椎动物性腺发育 |
| 1.1 生殖细胞的来源 |
| 1.2 生殖细胞的迁移与原始性腺的形成 |
| 2 脊椎动物性别决定 |
| 2.1 脊椎动物性别决定方式 |
| 2.2 脊椎动物生殖细胞的性别决定 |
| 3 脊椎动物性别分化 |
| 3.1 哺乳动物性别分化 |
| 3.2 鸟类性别分化 |
| 3.3 爬行类性别分化 |
| 3.4 两栖类性别分化 |
| 3.5 鱼类性别分化 |
| 4 Dmrt家族基因与性别分化 |
| 4.1 Dmrt1 |
| 4.2 Dmy/dmrt1bY |
| 4.3 Dm-w |
| 5 Fox家族基因与性别分化 |
| 5.1 Foxl2 |
| 5.2 Foxl3 |
| 6 科学问题的提出和本研究的目的意义 |
| 7 本研究的技术路线 |
| 第2章 尼罗罗非鱼foxl3 在生殖细胞性别命运决定中的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 尼罗罗非鱼foxl3 序列进化分析和性腺表达模式 |
| 3.2 尼罗罗非鱼foxl3 纯合突变系的建立 |
| 3.3 尼罗罗非鱼foxl3 纯合突变导致卵巢中出现精子发生 |
| 3.4 尼罗罗非鱼XX foxl3 纯合突体性腺体细胞维持雌性环境 |
| 4 讨论 |
| 4.1 尼罗罗非鱼foxl3 特异表达于雌性生殖细胞中 |
| 4.2 尼罗罗非鱼foxl3 决定XX个体性腺生殖细胞性别命运 |
| 第3章 尼罗罗非鱼dmrt1 在雄性性别分化中的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 尼罗罗非鱼dmrt1 在精巢中的细胞定位 |
| 3.2 尼罗罗非鱼dmrt1 纯合突变系的建立 |
| 3.3 尼罗罗非鱼dmrt1 纯合突变导致由雄向雌的性逆转 |
| 4 讨论 |
| 4.1 尼罗罗非鱼dmrt1 表达于精巢支持细胞和生殖细胞 |
| 4.2 尼罗罗非鱼dmrt1 是精巢分化所必需的 |
| 第4章 尼罗罗非鱼dmrt1和foxl3 相互拮抗研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 双突变dmrt1;foxl3 导致性腺发育为精卵巢 |
| 3.2 尼罗罗非鱼Foxl3 直接抑制dmrt1 的转录 |
| 3.3 尼罗罗非鱼Dmrt1 直接抑制foxl3 的转录 |
| 3.4 外源雌激素不能回救foxl3 突变导致的生殖细胞性逆转 |
| 3.5 阻断雌激素合成无法回救dmrt1 突变导致的性逆转 |
| 3.6 阻断雌激素合成导致foxl3 突变性腺完全雄性化 |
| 3.7 阻断雌激素合成导致dmrt1;foxl3 双突变性腺雄性化 |
| 3.8 敲降foxl2 成功回救dmrt1 突变导致的性逆转 |
| 4 讨论 |
| 4.1 尼罗罗非鱼foxl3与dmrt1 相互拮抗决定生殖细胞性别命运 |
| 4.2 尼罗罗非鱼dmrt1 拮抗foxl2/cyp19a1a决定性腺分化方向 |
| 4.3 体细胞环境对生殖细胞性别命运的影响 |
| 结论 |
| 本研究的主要创新点 |
| 本研究的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的主要论文 |
| 在读期间参加科研情况 |
（5）结直肠癌中寡肽转运体PEPT1的表观遗传调控机制及其转化应用研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 1.绪论 |
| 1.1 结直肠癌现状 |
| 1.2 结直肠癌中的表观遗传修饰异常 |
| 1.3 寡肽转运体PEPT1 |
| 1.4 本文研究内容 |
| 2.结直肠癌中PEPT1表达失调及其表观遗传调控机制 |
| 2.1 实验仪器和实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 实验小结 |
| 2.5 实验讨论 |
| 3.结直肠癌中DNA甲基化介导PEPT1基因表达沉默 |
| 3.1 实验仪器和实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 实验小结 |
| 3.5 实验讨论 |
| 4.结直肠癌中组蛋白乙酰化对PEPT1基因表达的影响 |
| 4.1 实验仪器和实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 实验小结 |
| 4.5 实验讨论 |
| 5.结直肠癌中表观遗传药物逆转PEPT1转运体表达的应用 |
| 5.1 实验仪器和实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 实验小结 |
| 5.5 实验讨论 |
| 总结和展望 |
| 综述:寡肽转运体POTS的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（6）RNA m6A共转录调控组蛋白H3K9me2去甲基化的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 发育基因的表达调控 |
| 1.2 组蛋白修饰 |
| 1.2.1 组蛋白修饰 |
| 1.2.2 常染色质和异染色质 |
| 1.2.3 组蛋白修饰H3K9me2 |
| 1.2.4 组蛋白去甲基化酶JMJC-domain家族蛋白 |
| 1.3 mRNA m~6A甲基化修饰 |
| 1.3.1 RNA表观修饰 |
| 1.3.2 代表性的RNA修饰 |
| 1.3.3 m~6A主要甲基化转移酶 |
| 1.3.4 m~6A主要去甲基化酶 |
| 1.3.5 m~6A结合蛋白 |
| 1.3.6 m~6A的主要研究方法 |
| 1.3.7 m~6A生物学功能和相关疾病 |
| 1.4 科学问题和研究目的 |
| 第二章 实验方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 载体和质粒 |
| 2.1.2 菌株和细胞系 |
| 2.1.3 试剂和耗材 |
| 2.1.4 引物序列 |
| 2.2 主要试剂和缓冲液的配制 |
| 2.2.1 细胞培养及其相关实验的试剂 |
| 2.2.2 分子克隆相关实验的试剂 |
| 2.2.3 分子和生化实验相关试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 引物设计 |
| 2.3.2 质粒构建和提取 |
| 2.3.3 细胞培养 |
| 2.3.4 慢病毒包装(shRNA) |
| 2.3.5 siRNA基因敲低 |
| 2.3.6 细胞系构建 |
| 2.3.7 总RNA提取和mRNA纯化 |
| 2.3.8 反转录-实时荧光定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.3.9 蛋白免疫印迹(Western blot) |
| 2.3.10 Me-RIP(qPCR) |
| 2.3.11 分离染色质RNA和蛋白 |
| 2.3.12 染色质RNA m~6A甲基化免疫沉淀 |
| 2.3.13 蛋白质免疫共沉淀 |
| 2.3.14 组蛋白染色质免疫共沉淀 |
| 2.3.15 KDM3B染色质免疫共沉淀 |
| 2.3.16 METT3 TAP染色质免疫共沉淀 |
| 2.3.17 H3K9me2染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq) |
| 2.3.18 高效液相色谱质谱联用(LC-MS/MS) |
| 2.3.19 二代测序 |
| 2.3.20 测序数据分析 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 系统性筛选响应m~6A修饰的组蛋白修饰 |
| 3.2 m~6A甲基化修饰调控H3K9me2组蛋白修饰 |
| 3.3 m~6A和H3K9me2去甲基化酶KDM3B在全基因组尺度上相关 |
| 3.4 m~6A共转录招募KDM3B去甲基化染色质上的H3K9me2 |
| 3.5 m~6A识别蛋白YTHDC1招募KDM3B以调节H3K9me2 |
| 3.6 m~6A促进了H3K9me2变化区域的基因表达 |
| 第四章 全文讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（7）龙眼体细胞胚胎发生早期AGO基因家族的全基因组鉴定、表达与功能分析（论文提纲范文）
| 缩写词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1 植物AGO蛋白研究进展 |
| 1.1 植物AGO蛋白的结构研究 |
| 1.2 AGO蛋白参与植物micro RNA(mi RNA)的生物合成 |
| 1.3 植物AGO蛋白的功能研究 |
| 1.3.1 AGO蛋白参与植物生长发育 |
| 1.3.2 AGO蛋白参与植物生物和非生物胁迫 |
| 1.4 AGO蛋白的分类研究 |
| 2 植物体胚发生研究进展 |
| 2.1 植物激素对体胚发育的影响 |
| 2.2 植物体胚发生过程的基因表达调控 |
| 2.3 植物体胚发生过程的转录组学研究 |
| 3 龙眼体胚发生的研究进展 |
| 3.1 龙眼体胚发生与植株再生 |
| 3.2 龙眼体胚发生过程的生理生化研究 |
| 3.3 龙眼体胚发生相关基因的克隆及表达分析 |
| 4 植物DNA甲基化的研究进展 |
| 4.1 DNA甲基化概述及DNA甲基化的维持 |
| 4.2 植物中DNA甲基化的特征及分布 |
| 4.3 RNA介导的DNA甲基化途径 |
| 4.4 植物DNA甲基化的作用 |
| 4.4.1 DNA甲基化在植物胁迫中的作用 |
| 4.4.2 DNA甲基化与植物生长发育的关系 |
| 4.4.3 DNA甲基化对植物体胚发生的影响 |
| 5 植物启动子的研究进展 |
| 5.1 植物启动子克隆技术的研究 |
| 5.2 植物启动子功能分析方法 |
| 6 本研究的意义及主要内容 |
| 6.1 研究意义 |
| 6.2 本研究的主要内容 |
| 第二章 龙眼体胚发生早期AGO家族的全基因组鉴定、生物信息学分析及DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 c DNA的克隆 |
| 第一节 龙眼体胚发生早期AGO家族的全基因组鉴定和生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 龙眼AGO家族成员的鉴定 |
| 1.2.2 龙眼AGO蛋白理化特性分析 |
| 1.2.3 龙眼AGO蛋白磷酸化位点、糖基化位点预测 |
| 1.2.4 龙眼AGO蛋白二级、三级结构预测 |
| 1.2.5 龙眼AGO基因的染色体定位、蛋白保守基序及基因结构分析 |
| 1.2.6 AGO家族氨基酸序列系统进化树的构建 |
| 1.2.7 龙眼AGO蛋白结构域分析 |
| 1.2.8 龙眼AGO蛋白互作预测分析 |
| 1.2.9 调控DlAGOs的 miRNA预测 |
| 1.2.10 DlAGOs在龙眼体胚发生早期的FPKM值分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 龙眼体胚发生早期AGO家族的全基因组鉴定 |
| 2.2 龙眼AGO蛋白特性分析 |
| 2.3 DlAGOs蛋白二级、三级结构预测分析 |
| 2.4 DlAGOs蛋白磷酸化位点、糖基化位点预测分析 |
| 2.5 龙眼AGO基因家族染色体定位及基因结构分析 |
| 2.6 龙眼AGO家族的系统进化树分析 |
| 2.7 龙眼AGO蛋白结构域分析 |
| 2.8 DlAGOs蛋白互作网络预测分析 |
| 2.9 调控DlAGOs的 mi RNA预测分析 |
| 2.10 DlAGOs在体胚发生早期的特异表达分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 利用生物信息学推测DlAGOs在龙眼体胚中的可能作用机理 |
| 3.2 AGO蛋白生物学功能多样性的研究 |
| 第二节 龙眼EC中 DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL cDNA全长的克隆 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 总RNA的提取和c DNA的合成 |
| 1.2.2 引物的设计 |
| 1.2.3 cDNA全长序列的扩增 |
| 1.2.4 目的基因PCR扩增产物的回收和测序 |
| 1.2.5 龙眼DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 龙眼EC总RNA的提取 |
| 2.2 龙眼EC中 DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 cDNA全长序列的克隆和分析 |
| 2.3 龙眼DlAGOs氨基酸序列及亲缘关系分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 龙眼胚性愈伤组织AGO基因克隆的意义 |
| 3.2 龙眼DlAGOs UTR对龙眼体胚发生过程可能起着调控作用 |
| 第三章 龙眼DlAGOs启动子的克隆和生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 DNA的提取 |
| 1.2.2 龙眼EC中 DlAGOs启动子的克隆 |
| 1.2.3 DlAGOs启动子的生物信息学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 龙眼DlAGOs启动子序列的克隆 |
| 2.2 龙眼DlAGOs启动子CpG岛的预测 |
| 2.3 龙眼DlAGOs启动子转录起始位点和核心启动子区域的预测 |
| 2.4 龙眼DlAGOs启动子功能元件分析 |
| 2.4.1 龙眼DlAGOs启动子序列含有激素响应元件 |
| 2.4.2 龙眼DlAGOs启动子序列中含有光反应元件 |
| 2.4.3 龙眼DlAGOs启动子含有逆境响应元件 |
| 2.4.4 龙眼DlAGOs启动子含有参与分生组织表达、胚乳表达和昼夜节律调控的响应元件 |
| 2.4.5 龙眼DlAGOs启动子序列含有大量功能未知的特异元件 |
| 3 讨论 |
| 3.1 龙眼DlAGOs可能参与激素信号转导 |
| 3.2 龙眼DlAGOs可能参与不同逆境及其它响应调控 |
| 3.3 龙眼DlAGOs启动子“CpG”岛的潜在功能 |
| 第四章 龙眼DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 龙眼材料 |
| 1.1.2 龙眼胚性愈伤组织EC的不同激素处理 |
| 1.1.3 龙眼胚性愈伤组织EC的不同非生物胁迫处理 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.2.2 DlAGOs家族实时荧光定量PCR引物的合成及分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 DlAGOs家族在龙眼体胚发生早期阶段的表达分析 |
| 2.2 DlAGOs家族在龙眼合子胚发育过程中的表达分析 |
| 2.3 DlAGOs家族在龙眼不同组织部位的特异性表达分析 |
| 2.4 不同激素处理下DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.4.1 不同浓度2,4-D处理下DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.4.2 不同浓度KT处理下DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.4.3 茉莉酸甲酯(Me JA)处理下龙眼DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.4.4 水杨酸(SA)处理下DlAGOs家族的表达分析 |
| 2.5 非生物胁迫处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.1 不同光质处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.2 不同温度处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.3 盐胁迫处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.4 甘露醇处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.5 聚乙二醇-4000 处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 2.5.6 脱落酸处理下DlAGOs家族的表达模式分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DlAGOs在龙眼体胚与合子胚发育可能发挥相同的作用 |
| 3.2 DlAGOs可能参与调控龙眼胚胎发生发育过程 |
| 3.3 DlAGOs可能参与龙眼种子、叶片和花器官的发育 |
| 3.4 DlAGOs可能响应多种激素的应答 |
| 3.5 DlAGOs可能参与非生物胁迫应答机制 |
| 第五章 龙眼DlAGOs启动子的功能验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要载体和试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 龙眼DlAGOs启动子表达载体的构建 |
| 1.3.2 重组质粒转化农杆菌和PCR验证 |
| 1.3.3 DlAGOs启动子瞬时转化本氏烟烟草叶片 |
| 1.3.4 DlAGOs启动子瞬时转化烟草叶片的不同激素处理 |
| 1.3.5 GUS活性检测 |
| 1.3.6 DlAGOs启动子瞬时转化龙眼EC |
| 1.3.7 总RNA的提取及c DNA的合成 |
| 1.3.8 GUS基因相对表达水平的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 DlAGOs启动子表达载体的构建 |
| 2.2 瞬时转化烟草叶片的GUS组织化学染色 |
| 2.3 DlAGOs启动子转化烟草叶片驱动GUS基因表达的定量分析 |
| 2.4 不同激素处理下转化烟草叶片的GUS活性测定 |
| 2.5 DlAGOs启动子转化龙眼EC驱动GUS基因表达的定量分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 高等植物启动子的基本结构和作用 |
| 3.2 龙眼DlAGOs可能参与激素调控 |
| 3.3 龙眼遗传转化体系的研究 |
| 第六章 DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 的亚细胞定位研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 菌种和载体 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 瞬时表达载体构建引物的设计 |
| 1.4.2 目的片段的克隆 |
| 1.4.3 亚细胞定位表达载体的构建 |
| 1.4.4 重组质粒转化农杆菌 |
| 1.4.5 农杆菌侵染转化洋葱内表皮细胞 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 龙眼AGO蛋白信号肽和亚细胞定位预测分析 |
| 2.2 DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 亚细胞定位融合表达载体的构建 |
| 2.3 DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1 的亚细胞定位 |
| 3 讨论 |
| 3.1 亚细胞定位的研究进展 |
| 3.2 AGO蛋白在植物细胞中亚细胞定位的研究进展 |
| 第七章 5-氮胞苷对龙眼体胚发生早期及DlAGOs表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 不同浓度5-azac的配置 |
| 1.2.2 材料的处理 |
| 1.2.3 龙眼体胚发生早期阶段的形态观察 |
| 1.2.4 总RNA的提取和c DNA的合成 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 5-azac与2,4-D处理对龙眼体胚发生早期和DlAGOs表达的影响 |
| 2.1.1 5-azac与2,4-D处理对龙眼体胚生长状态的影响 |
| 2.1.2 5-azac与2,4-D处理对龙眼早期体胚发生的影响 |
| 2.1.3 5-azac与2,4-D处理对DlAGOs表达的影响 |
| 2.2 低浓度5-azac对龙眼体胚发生的影响和DlAGOs的表达模式分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA甲基化水平对龙眼体胚发生的影响 |
| 3.2 2,4-D与5-azac处理对植物体胚发生的影响 |
| 3.3 龙眼AGO基因可能参与DNA甲基化机制 |
| 第八章 5-氮胞苷处理下龙眼体胚发生早期的转录组学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 总RNA的提取、cDNA文库构建与高通量测序 |
| 1.3 测序数据的生物信息学分析 |
| 1.3.1 转录组分析 |
| 1.3.2 基因聚类分析 |
| 1.3.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转录组测序数据分析 |
| 2.2 基因表达量水平的分析和差异表达基因的筛选 |
| 2.3 转录因子及植物抗病基因结构域分析 |
| 2.4 差异表达基因的功能富集分析 |
| 2.4.1 差异表达基因GO富集分析 |
| 2.4.2 差异表达基因KEGG富集途径分析 |
| 2.5 5-azac处理下丁酸盐代谢途径相关基因差异表达分析 |
| 2.6 5-azac处理下硫代谢途径相关基因差异表达分析 |
| 2.7 5-azac处理下硒代化合物代谢途径相关基因的差异表达分析 |
| 2.8 5-azac处理下龙眼体胚发生早期差异表达基因的q PCR验证 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DlAGO4基因在龙眼早期体胚发生的作用 |
| 3.2 DNA甲基化水平降低促进龙眼体胚发生相关基因的表达 |
| 3.3 丁酸盐代谢对植物体胚发育的影响 |
| 3.4 硫代谢对龙眼体胚发生早期的重要作用 |
| 第九章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（8）Setd2在造血干细胞干性维持和淋巴谱系分化中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 引言 |
| 1.1 造血干细胞 |
| 1.2 免疫系统 |
| 1.3 淋巴细胞发育 |
| 1.4 RAG蛋白与V(D)J重排 |
| 1.5 DSB非同源末端修复 |
| 1.6 组蛋白的种类以及修饰 |
| 1.7 组蛋白的甲基化及相关的酶 |
| 1.8 先天性免疫缺陷 |
| 第二章 本论文主要解决的科学问题及意义 |
| 第三章 设备耗材与实验材料 |
| 3.1 实验耗材、仪器以及试剂 |
| 3.2 实验方法与流程 |
| 3.2.1 转基因小鼠基因型鉴定 |
| 3.2.2 小鼠骨髓单细胞悬液制备 |
| 3.2.3 小鼠胸腺单细胞悬液制备 |
| 3.2.4 小鼠脾脏单细胞悬液制备 |
| 3.2.5 经眼眶下静脉丛采集小鼠外周血 |
| 3.2.6 流式细胞术及流式染色、检测和分析 |
| 3.2.7 总 RNA分离、总 RNA反转录、Real-time PCR及数据分析 |
| 3.2.8 蛋白免疫印迹检测(Western Blotting) |
| 3.2.9 免疫组织化学染色 |
| 3.2.10 小鼠竞争性骨髓移植实验 |
| 3.2.11 V(D)J重排分析 |
| 3.2.12 染色质免疫共沉淀(Ch IP) |
| 3.2.13 细胞复苏、培养、传代及冻存(以HEK293T细胞为例) |
| 3.2.14 病毒包装与细胞感染 |
| 3.2.15 SETD2 编码区定点突变分析 |
| 3.2.16 质粒抽提 |
| 3.2.17 通过逆转录病毒感染的方法制作TCR过表达的小鼠模型 |
| 第四章 实验结果 |
| 第一节 Setd2在造血系统的表达模式以及 Setd2 转基因小鼠构建策略 |
| 第二节 Setd2 缺失后导致外周淋巴细胞减少 |
| 第三节 敲除Setd2 导致造血干细胞功能受损 |
| 第四节 Setd2 缺失后造成共同淋巴祖细胞的数量积累 |
| 第五节 敲除Setd2 后导致T淋巴细胞发育阻滞在DN3期 |
| 第六节 敲除Setd2 后导致B淋巴细胞发育阻滞在pro-B期 |
| 第七节 Setd2 缺失后导致T淋巴细胞V(D)J重排异常 |
| 第八节 Setd2 缺失后导致B淋巴细胞V(D)J重排异常 |
| 第九节 过表达TCR可以恢复Setd2 缺失导致的T细胞发育阻滞 |
| 第十节 Setd2 缺失后使得Rag1对RSSs位点的识别能力减弱 |
| 第十一节 Setd2 缺失导致V(D)J重排过程中DSB修复异常 |
| 第十二节 Setd2 缺失后没有改变H3K4me3 在淋巴细胞的分布 |
| 第十二节 先天性免疫缺陷病人中有SETD2 突变 |
| 第五章 本论文的总结与讨论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学术论文和科研成果 |
| 附件 |
（9）DNA去甲基化在拟南芥应答镉胁迫中的作用（论文提纲范文）
| 基金资助 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 镉污染概述 |
| 1.2 镉的吸收转运和积累过程 |
| 1.3 植物镉吸收和积累的影响因素 |
| 1.3.1 环境因素 |
| 1.3.2 生物因素 |
| 1.3.3 农艺管理因素 |
| 1.4 镉对植物的毒害机制 |
| 1.4.1 镉对必需营养元素的影响 |
| 1.4.2 镉诱导植物氧化胁迫 |
| 1.4.3 镉对生物大分子的影响 |
| 1.4.4 镉对植物光合和呼吸作用的影响 |
| 1.4.5 镉对植物生长发育的影响 |
| 1.5 植物应对镉胁迫的解毒机制 |
| 1.5.1 拒吸收 |
| 1.5.2 外排 |
| 1.5.3 液泡区室化 |
| 1.5.4 细胞壁固定 |
| 1.5.5 螯合机制 |
| 1.6 植物镉毒害与镉耐性的调控机制 |
| 1.6.1 转录因子调节 |
| 1.6.2 激素及信号分子调节 |
| 1.6.3 表观遗传调控 |
| 1.6.3.1 非编码RNA的表观遗传调控 |
| 1.6.3.2 组蛋白修饰和DNA甲基化修饰的表观遗传调控 |
| 1.7 问题提出与解决路线 |
| 1.7.1 问题提出 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 1.7.3 拟解决问题 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 植物培养 |
| 2.3 全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)以及数据分析 |
| 2.4 DNA甲基化敏感性PCR分析(Chop-PCR) |
| 2.5 转录组测序(RNA-seq)及数据分析 |
| 2.6 基因本体论分析 |
| 2.7 实时反转录定量PCR分析 |
| 2.8 镉离子吸收速率的测量 |
| 2.9 元素含量测定 |
| 2.10 质膜完整性和细胞死亡的测定 |
| 2.11 H_2O_2和O_2~(.-)含量的测定 |
| 2.12 统计分析以及数据可视化 |
| 第三章 研究结果 |
| 3.1 镉胁迫对拟南芥全基因组DNA甲基化的影响 |
| 3.1.1 拟南芥全基因组重亚硫酸盐测序质量评估 |
| 3.1.2 镉胁迫对全基因组DNA甲基化水平及分布模式影响 |
| 3.1.3 镉胁迫对基因组特定位置甲基化的影响 |
| 3.2 镉胁迫引起DNA超甲基化的作用机制 |
| 3.2.1 镉胁迫对DNA甲基化平衡过程相关的基因表达的影响 |
| 3.2.2 ROS1、DML2和DML3 功能缺失对镉诱导的CHN-DMRs的影响 |
| 3.3 镉诱导的DNA超甲基化对植物镉耐性的影响 |
| 3.3.1 镉胁迫下DNA甲基化水平变异对植物生长的影响 |
| 3.3.2 镉胁迫下DNA甲基化状态对部分根系形态的影响 |
| 3.3.3 DNA甲基化状态对镉诱导的ROS积累的影响 |
| 3.3.4 镉胁迫下DNA甲基化状态对细胞死亡的影响 |
| 3.3.5 镉胁迫下DNA甲基化状态对质膜完整性的影响 |
| 3.3.6 三个去甲基化酶基因ROS1,DML2和DML3 在影响镉耐性中的冗余性 |
| 3.4 镉诱导的DNA超甲基化对植物镉吸收和转运的影响 |
| 3.4.1 镉诱导的DNA甲基化增加对植物镉浓度的影响 |
| 3.4.2 镉诱导的DNA甲基化增加对植物镉转运的影响 |
| 3.4.3 镉诱导的DNA甲基化变异对植物镉吸收的影响 |
| 3.5 DNA超甲基化增强植物镉耐性的作用机制 |
| 3.5.1 DNA超甲基化对液泡区室化镉过程的影响 |
| 3.5.2 DNA超甲基化对基因表达的影响 |
| 3.5.3 DNA超甲基化对铁营养的影响 |
| 3.5.4 镉胁迫下8个铁吸收、转运和平衡过程相关的DEGs的表观遗传调控 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 5.1 主要研究结论 |
| 5.2 主要创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 已发表的论文 |
（10）耐辐射奇球菌特异DNA甲基化修饰模式及其参与维持基因组稳定性的功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 细菌DNA甲基化修饰研究进展 |
| 1.1.1 细菌DNA甲基化修饰概述 |
| 1.1.2 甲基化修饰碱基的检测方法 |
| 1.1.3 细菌常见的甲基化修饰类型 |
| 1.1.4 细菌DNA甲基化修饰的表观调控机制 |
| 1.2 耐辐射奇球菌的研究进展 |
| 1.2.1 耐辐射奇球菌的基本概述 |
| 1.2.2 耐辐射奇球菌的极端抗性机制 |
| 1.2.3 耐辐射奇球菌DNA甲基化修饰研究进展 |
| 第2章 耐辐射奇球菌基因组SMRT测序及DNA甲基化分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 常用仪器 |
| 2.2.3 本章所用化学试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 试剂配制 |
| 2.3.2 菌株的活化与培养 |
| 2.3.3 总DNA的提取 |
| 2.3.4 第三代单分子实时测序(SMRT-seq) |
| 2.3.5 多序列比对分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 耐辐射奇球菌基因组DNA提取质量评估 |
| 2.4.2 耐辐射奇球菌基因组重测序数据分析 |
| 2.4.3 基因预测与功能注释 |
| 2.4.4 耐辐射奇球菌的比较基因组分析 |
| 2.4.5 耐辐射奇球菌基因组DNA甲基化分布 |
| 2.4.6 耐辐射奇球菌DNA甲基转移酶的预测 |
| 2.4.7 耐辐射奇球菌限制性内切酶的预测 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 耐辐射奇球菌基因组DNA甲基化修饰质谱鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 化学试剂 |
| 3.2.4 试剂配置 |
| 3.2.5 菌株活化与培养 |
| 3.2.6 甲基转移酶基因敲除株的构建 |
| 3.2.7 标准品N~4-甲基脱氧胞苷(4mC/m~4dC)的合成 |
| 3.2.8 合成的4mC鉴定 |
| 3.2.9 超高效液相色谱-三重四极杆液质联用分析 |
| 3.2.10 修饰碱基(6mA)的斑点杂交验证 |
| 3.2.11 基因组DNA酶切分析 |
| 3.2.12 统计分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 耐辐射奇球菌DNA甲基转移酶基因敲除株验证 |
| 3.3.2 标准品N~4-甲基脱氧胞苷的化学合成分析 |
| 3.3.3 核苷标准品UHPLC-QQQ-MS/MS分析及标准曲线制作 |
| 3.3.4 耐辐射奇球菌基因组DNA甲基化修饰分析 |
| 3.3.5 敲除株ΔM.DraR1的SMRT-Seq分析 |
| 3.3.6 耐辐射奇球菌基因组DNA限制性酶酶切分析 |
| 3.3.7 奇球菌属基因组DNA甲基化修饰质谱分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 甲基转移酶M.DraR1的分离纯化及生化分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株及质粒 |
| 4.2.2 主要仪器设备与实验材料 |
| 4.2.3 甲基转移酶M.DraR1及其同源物的Motif在线分析 |
| 4.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 4.2.5 转化及质粒提取 |
| 4.2.6 质粒pRRS-M.DraR1的构建 |
| 4.2.7 质粒pRRS-M.DraR1的酶切分析 |
| 4.2.8 可溶性M.DraR1蛋白诱导条件的优化 |
| 4.2.9 甲基转移酶M.DraR1的纯化步骤 |
| 4.2.10 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析 |
| 4.2.11 凝胶迁移实验(EMSA) |
| 4.2.12 甲基转移酶M.DraR1体外酶活反应 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 多序列比对分析 |
| 4.3.2 甲基转移酶M.DraR1体内活性分析 |
| 4.3.3 甲基转移酶M.DraR1可溶性诱导条件的优化结果 |
| 4.3.4 可溶性M.DraR1蛋白的纯化结果 |
| 4.3.5 甲基转移酶M.DraR1的质谱鉴定结果 |
| 4.3.6 甲基转移酶M.DraR1的底物结合特性 |
| 4.3.7 甲基转移酶M.DraR1的体外酶活分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 M.DraR1参与维持耐辐射奇球菌基因组稳定性作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌种与质粒 |
| 5.2.2 主要仪器设备与实验材料 |
| 5.2.3 补偿株的构建 |
| 5.2.4 生长曲线的测定 |
| 5.2.5 突变率的测定 |
| 5.2.6 表型与生存率的测定 |
| 5.2.7 转化与重组效率的测定 |
| 5.2.8 荧光显微镜分析 |
| 5.2.9 透射电子显微镜分析 |
| 5.2.10 RNA-seq及数据分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 敲除株ΔM.DraR1生长能力与突变率分析 |
| 5.3.2 敲除株表型及生存率分析 |
| 5.3.3 转化效率及重组率分析 |
| 5.3.4 敲除株ΔM.DraR1细胞显微结构分析 |
| 5.3.5 转录组测序数据分析 |
| 5.3.6 差异表达基因分析 |
| 5.3.7 差异表达基因的富集分析 |
| 5.3.8 4mC修饰参与调节DNA损伤响应 |
| 5.3.9 4mC修饰参与维持耐辐射奇球菌的内核结构 |
| 5.3.10 4mC修饰参与调控DNA修复 |
| 5.3.11 4mC修饰调控耐辐射奇球菌的自然感受态能力 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
四、EXPRESSION AND DELETION ANALYSIS OF EcoRII ENDONUCLEASE AND METHYLASE GENE（论文参考文献）
- [1]BsaI甲基化酶的表达与功能研究[D]. 张佳怡. 北京化工大学, 2021
- [2]超灵敏检测DNA羟化酶TET1荧光生物传感器的构建[D]. 姚洁. 山东师范大学, 2021(12)
- [3]DNA甲基化和H3K4me2拮抗调节BMP4促进鸡PGCs形成的机制研究和潜在应用[D]. 张明. 扬州大学, 2021
- [4]Dmrt1和Foxl3在尼罗罗非鱼性别分化和生殖细胞命运决定中的功能研究[D]. 戴生飞. 西南大学, 2021
- [5]结直肠癌中寡肽转运体PEPT1的表观遗传调控机制及其转化应用研究[D]. 汪艳红. 浙江大学, 2021(01)
- [6]RNA m6A共转录调控组蛋白H3K9me2去甲基化的作用和机制研究[D]. 李源. 南方医科大学, 2020(01)
- [7]龙眼体细胞胚胎发生早期AGO基因家族的全基因组鉴定、表达与功能分析[D]. 陈荣珠. 福建农林大学, 2020
- [8]Setd2在造血干细胞干性维持和淋巴谱系分化中的作用及机制研究[D]. 吉忠忠. 上海交通大学, 2020(01)
- [9]DNA去甲基化在拟南芥应答镉胁迫中的作用[D]. 范士凯. 浙江大学, 2020
- [10]耐辐射奇球菌特异DNA甲基化修饰模式及其参与维持基因组稳定性的功能研究[D]. 李胜杰. 浙江大学, 2019(04)