一、Influence of Stent Implantation on the Expression of PCNA and Apoptosis in Injured Vascular Smooth Muscle Cells（论文文献综述）
胡继盛[1]（2021）在《WDR1在血管平滑肌细胞中参与血管损伤后重构过程的作用研究》文中认为背景血管的损伤后重构在临床上是常见的血管病理生理学过程,然而该过程往往导致预后不良,比如动脉管腔狭窄,动脉移植后增生,介入手术后血管内膜增生等。血管损伤重构过程不能及时处理,这将间接性的导致心血管疾病以及心血管相关的他并发症的发生。常见的并发症有动脉粥样硬化,心肌梗塞,脑梗塞等。大量的低密度脂蛋白（low-density lipoproteins,LDL）逐渐积累到受损的血管内皮下空间中,被血管壁中的巨噬细胞和平滑肌细胞（Smooth muscle cells,SMCs）摄取,摄取了脂质的巨噬细胞和平滑肌细胞形成泡沫细胞并逐渐演变成动脉粥样硬化。由脂质介导的炎症诱导了平滑肌细胞的大量增殖并且迁移到血管内膜。血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）是血管壁的主要细胞组成部分,在血管受到外力、炎症等刺激后,位于血管中层的平滑肌细胞快速的发生表型转换、增殖,然后向血管内膜迁移,导致内膜增生,这就是新生内膜的形成过程,但是该过程的分子机制仍不清楚。前人的研究表明,VSMCs的增殖和迁移在血管内膜形成过程中有着至关重要的作用。肌动蛋白细胞骨架作为细胞的支撑基础,参与了众多的细胞生物学过程,比如细胞运动,表型转换,细胞的增殖和迁移等。细胞骨架的重构决定着细胞的运动,增殖等一系列的生物学过程。由于聚合的肌动蛋白相对稳定,因此需要特定的肌动蛋白调节蛋白来辅助,并促进肌动蛋白丝的分解。肌动蛋白丝解聚的生理意义不仅在于能够去除旧的肌动蛋白丝,而且解聚后形成肌动蛋白单体还可以补充用于新一轮肌动蛋白组装的肌动蛋白单体库。因此,肌动蛋白组装和解聚的平衡对于细胞骨架尤为重要。肌动蛋白解聚因子（Actin depolymerizing factor,ADF/Cofilin）通过切断肌动蛋白丝并从肌丝上解离肌动蛋白单体来促进肌动蛋白解聚。尽管ADF/Cofilin通常积聚在肌动蛋白细胞骨架动态的亚细胞区域,但是仅ADF/Cofilin单独作用,特别是高浓度时,对驱动肌动蛋白丝的快速解聚并不是十分有效。因此,当需要肌动蛋白单体快速周转时,其他的解聚因子需要与ADF/Cofilin配合来达到肌动蛋白快速解聚的效果。肌动蛋白相互作用蛋白1（Actin interacting protein 1,AIP1）,也称为WD重复结构域1（WD repeat domain 1,WDR1）,即使ADF/Cofilin被肌动蛋白丝饱和,也能强烈增强肌动蛋白丝的分解。作为ADF/Cofilin的主要辅助因子,WDR1介导的肌动蛋白动力学不仅对细胞极性的形成有着重要的调节作用,而且在细胞的增殖和迁移过程有着不可或缺的作用。前人的研究表明,VSMCs的迁移和增殖在血管形成过程中扮演着至关重要的作用,但是WDR1作为细胞骨架解聚因子的辅助因子,其在VSMCs中介导血管重构的作用机制仍不清楚。信号转导和转录激活因子3（Signal Transducer and Activator of Transcription3,STAT3）是Janus激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT）信号通路的重要因子之一,涉及到炎症以及其他各种细胞生物学过程,例如细胞分裂和细胞增殖等。前人的研究表明在血管损伤后的第七天内,磷酸化形式STAT3的水平显着升高,这表明STAT3对于血管新生内膜的形成至关重要。血管损伤后,STAT3的活化与WDR1的表达呈正相关,但是在VSMCs中,STAT3是否参与WDR1的表达调控还未可知。STAT3的激活和核转运是其发挥转录作用的前提,有研究表明STAT3的核转运是Ran和Importinβ依赖性的。细胞骨架响应于细胞微环境的改变和机械性刺激对众多的细胞生物学过程均有影响。WDR1是细胞骨架重构的重要因子之一,有报道称,在乳腺癌细胞中,Wdr1的缺失影响Importinβ的表达。综合以上几点,STAT3可能会通过促进WDR1的转录进而促进血管内膜的形成,反过来WDR1介导的肌动蛋白动力学也会影响STAT3的核贩运,WDR1-STAT3形成反馈环共同调节血管损伤后重构。目的本研究从分子、细胞、动物水平探究WDR1在血管损伤后重构中的作用机制,并阐释STAT3与WDR1之间的相互作用对血管损伤后重构过程的影响,进一步完善血管损伤后重构的分子调控网络,为临床治疗外周血管疾病提供线索。方法第二章:本研究通过颈总动脉结扎的方式构建小鼠血管损伤模型,在损伤不同天数通过颈椎脱臼法处死小鼠并按照不同实验目的取材。通过免疫组化、RT-PCR、Western blot等生物学方法检测血管损伤不同天数的血管中Wdr1的表达。同时,通过Western blot和明胶酶谱实验分别检测了增殖标志物PCNA的表达和基质金属蛋白酶9的活性。第三章:通过Cre-Loxp系统构建Wdr1条件敲除小鼠,设计引物,通过PCR鉴定小鼠基因型。腹腔注射他莫昔芬（10 mg/kg/天）诱导敲除Wdr1,利用Western blot和RT-PCR分别从蛋白质和RNA水平检测Wdr1的表达。然后通过手术损伤颈总动脉,通过HE染色检测血管内膜增厚情况。在敲降Wdr1后,利用TUNEL检测细胞的凋亡情况,同时通过免疫荧光检测p-H3和SMA的表达。通过明胶酶谱实验检测Wdr1敲除后MMP9的活性。分离小鼠原代血管平滑肌细胞,体外加入4-OH他莫昔芬诱导原代细胞中Wdr1的敲除。检测细胞敲除效率以及凋亡后,再通过CCK8和划痕实验证实WDR1对平滑肌细胞增殖和迁移的影响。第四章:过表达WDR1,通过Transwell和CCK8实验进一步证实WDR1对平滑肌细胞迁移和增殖的影响。在损伤不同天数的血管中,通过Western blot检测STAT3的激活,证实STAT3与血管损伤修复间的联系。体外通过AngⅡ和IL-6处理平滑肌细胞模拟血管损伤过程,利用划痕实验和CCK8检测AngⅡ和IL-6处理后的增殖和迁移能力。通过Western bloting和RT-PCR检测不同细胞因子处理后的Wdr1的表达。在平滑肌细胞中敲降STAT3,用AG490处理平滑肌细胞,检测WDR1的表达情况,在敲降STAT3的基础上过表达WDR1,检测细胞的增殖和迁移能力。在敲降Wdr1的基础上过表达Cofilin,免疫荧光实验、CCK8、Western blot和划痕实验证实WDR1介导的肌动蛋白动力学与平滑肌细胞增殖与迁移之间的关系。最后,通过双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀证实STAT3直接靶向Wdr1的启动子。第五章:敲降和过表达Wdr1后检测STAT3的表达与活化情况,探究WDR1能否对STAT3的表达和活化有影响。通过核质分离证实WDR1对STAT3的核转移的影响,Western blot、核质分离实验探究与STAT3核转移相关因子Ntf2、importinβ、Importinα、Ran的表达和核质分布情况。通过Transwell和CCK8实验验证Ntf2、Importinβ过表达对平滑肌细胞增殖和迁移的影响。结果第二章:HE结果证实颈总动脉结扎可以有效诱导血管内膜增厚,并且免疫组化实验、Western blot和RT-PCR结果显示在损伤不同天数,Wdr1的表达呈现时间依赖性升高,在损伤第14天达到峰值、并且增殖标志物PCNA的表达也是呈时间依赖性升高。明胶酶谱实验结果提示在动脉损伤后MMP9的活性显着性提高。第三章:基因型鉴定结果显示Wdr1f/f;ERT2Cre小鼠成功构建。Western blot和RT-PCR结果显示,他莫西芬注射后能够成功诱导小鼠动脉细胞中Wdr1的敲除。进一步的研究结果表明,Wdr1的敲除有效抑制血管损伤后血管新生内膜的形成。免疫荧光和明胶酶谱实验表明,在Wdr1敲除后,动脉中的细胞增殖和迁移能力被显着抑制了。TUNEL实验结果表明Wdr1的敲除不影响细胞的凋亡。分离小鼠原代血管平滑肌细胞,Western blot和RT-PCR结果显示4-OH他莫西芬诱导后Wdr1成功敲除。划痕和CCK8实验结果显示Wdr1的敲除抑制了原代平滑肌细胞的增殖和迁移。第四章:Transwell实验和CCK8实验表明,过表达Wdr1增强了HAVSMCs细胞的增殖和迁移能力。在诱导增殖的HAVSMCs和损伤的血管中,Western blot结果显示STAT3的磷酸化水平显着升高。HAVSMCs中敲降STAT3可显着性抑制其增殖和迁移,并且通过JAK2的特异性抑制剂处理HAVSMCs也能得到相同结果。双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀结果提示STAT3通过靶向Wdr1来促进其转录的。Western blot和免疫荧光实验结果提示,肌动蛋白动力学是WDR1介导的平滑肌细胞增殖和迁移所必需的。第五章:Western blot结果提示WDR1的缺失并不影响STAT3的表达和激活。核质分离的结果显示,WDR1缺失抑制了活化的STAT3的核转移。进一步的Western blot和核质分离结果显示WDR1的缺失抑制了Importinβ的表达和Ran的核质分布,从而抑制活化的STAT3的核转移。结论血管损伤修复是一个复杂的生物学过程,受到多种因素的影响。各种转录因子,炎症因子等共同构成一个调控网络,参与血管新生内膜的形成。本研究本研究揭示了WDR1调控血管内膜形成的分子机制,主要是STAT3调控Wdr1的表达以及WDR1缺失对STAT3核转运影响的分子机制。STAT3在血流动力学改变和炎症因子刺激的作用下大量激活并转运入核参与血管内膜形成的分子调节过程。高表达Wdr1能够显着促进VSMCs的增殖和迁移,以此来促进血管新生内膜的形成。当抑制STAT3的激活时,Wdr1的表达显着下调,同时平滑肌细胞的增殖和迁移能力显着下降、血管内膜形成也被显着抑制了。随后的荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀实验结果表明STAT3与Wdr1基因的启动子相结合并促进Wdr1的转录。反过来,WDR1的缺失抑制了核转运因子2（nuclear transport factor 2,NTF2）和Importinβ的表达,进而影响阻碍STAT3的核转运;同时,在敲降Wdr1的平滑肌细胞中,Ran的核质比显着下降,进一步说明WDR1对于STAT3的核转运至关重要。本研究以细胞骨架解聚因子WDR1为切入点,重点阐明了WDR1影响血管新生内膜形成的分子机制,为研究血管内膜增生发生发展的机制提供了新的见解,为临床上治疗术后血管内膜增生提供了线索。
路芳芳[2]（2020）在《阿苯达唑在血管再狭窄中的作用机制研究》文中认为第一部分小鼠血管内膜增生模型的的构建目的:构建小鼠血管内膜增生模型,探讨其引起内膜增生和管腔狭窄的相关机制。方法:根据文献报道的方法[1],使用硅胶管嵌套小鼠单侧股动脉以诱导血管内膜增生,对照侧实行假手术,分离股动脉后不进行套管。手术后进行体重连续监测,取血管进行组织形态分析前用小动物超声仪检测小鼠双侧股动脉内血流的变化,作为再狭窄形成的辅助诊断指标。通过对实验处股动脉切片进行苏木素-伊红染色（Hematoxylin-eosin staining,HE staining）来判断血管内新生内膜的面积和管腔狭窄的程度,分别对内膜面积,中膜面积,内膜与中膜的比例（I/M）用ImageJ软件处理后进行定量。结果:经测定,与假手术侧相比,小鼠股动脉手术侧的血流速度[（126.2334±21.43199）vs（70.97854±4.646153）,P=0.002]显着加快,差异有统计学意义,即手术侧管腔的横截面积小于对照侧。取小鼠股动脉切片后进行HE染色,可见血管内膜显着增生和管壁增厚及管腔狭窄。内膜中可见大量的血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）增生,血管周可见炎性细胞浸润。血管狭窄参数的定量结果显示,手术侧的内膜面积[（2563.67±398.31）vs（7974.67±1491.69）,P=0.004],中膜面积[（6939.67±570.507）vs（12227.67±1487.02）,P=0.005],I/M 比值[（0.37±0.04）vs.（0.66±0.13）,P=0.019]都明显高于对照侧（图3D）,差异有统计学意义。结论:成功构建了简单实用的通过血管外膜损伤诱导小鼠股动脉内膜增生的模型。第二部分体外评价阿苯达唑对平滑肌细胞生物学功能的影响目的:利用体外实验评价阿苯达唑（Albendazole,ABZ）对VSMCs生物学功能的影响并简要探讨其作用机制。方法:体外各实验均用与实验组等体积的DMSO作为对照,且DMSO在培养基中的浓度≤0.2%。MTT法检测ABZ对VSMCs和内皮细胞（endothelial cell,ECs）增殖的影响,3-D细胞迁移实验和Annexin V-PI染色分别评估ABZ对VSMCs迁移和凋亡的影响。细胞划痕实验用来评估ABZ对ECs迁移的影响。在VSMCs体外迁移的过程中,使用特异性鬼笔环肽荧光染料标记丝状肌动蛋白（F-actin）,用来反映ABZ对细胞骨架结构变化的影响。免疫印迹法（Western blotting）检测肌球蛋白磷酸酶1（MYPT1）和肌球蛋白轻链2（MLC）磷酸化水平的变化。结果:MTT实验检测结果显示,与对照组相比,ABZ以0.5μM[（0.60±0.03）vs（0.50±0.04）,P<0.001]1μM[（0.60±0.03）vs（0.33±0.03）,P<0.001]浓度作用 48h后,均能显着抑制VSMCs的增殖,最小起效浓度为0.5μM。细胞迁移实验结果显示,与对照组相比,ABZ 以 0.5μM[（118.55±3.39）vs（81.00±4.00）,P<0.001]和1μM[（118.55±3.39）vs 78.875±3.01),P<0.001]浓度作用 48h 时后对 VSMCs 迁移具有抑制作用,穿过胶原贴附到Transwell小室膜外侧的细胞数显着减少。流式细胞术检测结果表明,ABZ作用48h后,0.5μM浓度对细胞凋亡没有显着影响[（18.29±2.79）vs（20.02±2.23）,P=0.420],但在 1.0μM时可以促进细胞凋亡[（18.29±2.79）vs（25.13+1.35）,P=0.002]。本实验室之前的实验研究表明,ABZ将VSMCs的细胞周期阻滞在G2/M期。使用MTT细胞增殖试剂盒对ECs的检测结果表明,与对照组相比,ABZ处理48h,0.5μM[（0.34±0.11）vs.（0.42±0.09）,P=0.146]和 1μM[（0.34±0.11）vs.（0.40±0.10）,P=0.427]浓度对ECs的增殖作用均未见显着的抑制作用。细胞划痕实验用来体外模拟ABZ对ECs损伤愈合的影响,ImageJ软件分别对Oh和24h划痕愈合的面积进行定量。愈合面积用Oh划痕面积与24h划痕面积之差表示。相较于对照,ECs 经过 0.5μM[（85423.89±29521.03）vs（18211.33±4985.28）,P<0.01]和 1μM[（85423.89±29521.03）vs（21810.00±17750.62）,P<0.001]ABZ 处理 24h 后,创面愈合面积都具有明显差异。Western blot检测结果显示,与对照相比,0.5μM[（0.64±0.12）vs（0.37±0.12）,P=0.04]和1.0μM[（0.64±0.12）vs（0.24±0.07）,P=0.007]ABZ 分别作用24h后,MYPT1磷酸化水平显着降低。MLC磷酸化水平在0.5μM[（0.89±0.06）vs（0.56±0.13）,P=0.01]和 1μM[（0.89±0.06）vs（0.34±0.08）,P<0.001]ABZ 处理后也显着降低。结论:ABZ能够在体外抑制VSMCs增殖和迁移,对细胞凋亡影响较小,并且不会影响ECs的增殖作用。ABZ对VSMCs迁移的影响与细胞骨架中F-actin的拆解有关,能够显着抑制F-actin的拆解,其机制可能与ABZ对MLC和MYPT1磷酸化水平的调节有关。第三部分阿苯达唑对小鼠股动脉内膜增生和管壁重塑的影响目的:利用小鼠血管内膜增生模型评价ABZ在体内对小鼠股动脉损伤后再狭窄形成的影响,探讨ABZ成为血管再狭窄潜在预防药物的可能。方法:取10周龄野生型雄性C57BL/6小鼠,硅胶管嵌套小鼠单侧股动脉以诱导血管内膜增生模型,对侧实行假手术。术后将小鼠随机分为实验组和对照组,两组小鼠同时用高脂饲料喂养。期间实验组将ABZ以1.5 mg/天的剂量进行灌胃,对照组以同体积的芝麻油灌胃。4周后用小动物超声仪评价血管内膜增生的严重程度。HE染色后观察血管组织的形态学变化,ImageJ软件处理后对内膜面积,中膜面积及内膜与中膜的比例（I/M）进行定量。通过免疫组织化学染色评价平滑肌细胞表型转换分子（α-SMA）,内皮细胞标记（CD31）,巨噬细胞标记（Mac-3）,以及平滑肌细胞核增殖抗原（PCNA）表达的变化。结果:与对照组相比,实验组小鼠双侧股动脉内血流速度的差值[（40.37±2.88）vs（25.08±7.37）,P=0.008]减低,差异有统计学意义,即ABZ作用后股动脉血管腔的横截面积大于对照侧,狭窄程度得到改善。HE染色结果表明,相较于对照组小鼠,ABZ 能够显着抑制内膜[（5605.79±1246.96）vs（2988.66±365.58）,P=0.017]增生及I/M的比例[（1.12±0.20）vs（0.76±0.15）,P=0.005],对中膜的面积并无显着效应[（4114.46±970.57）vs（3913.79±528.51）,P=0.661]。免疫组化染色结果显示,α-SMA阳性细胞显着减少[（0.35±0.02）vs（0.21±0.04）,P=0.008]。CD31染色结果表明,ABZ不会影响再内皮化。PCNA染色结果显示ABZ处理后,PCNA阳性细胞数明显减少[（0.32±0.03）vs（0.20±0.04）,P=0.007]。与对照组相比,巨噬细胞阳性数也减少[（0.08±0.02）vs（0.04±0.01）,P=0.03]。结论:ABZ通过作用于VSMCs和炎症细胞,有效的改善了动脉内膜增生和血管壁重塑,对术后血管再狭窄的形成具有较好的预防作用。
陈乙菲[3]（2020）在《基于CaN/NFAT信号途径探讨血府逐瘀汤治疗血管损伤后内皮增生的作用机制研究》文中研究表明目的:基于CaN/NFAT信号通路,探讨血府逐瘀汤对人脐静脉内皮细胞损伤后的影响,探讨血府逐瘀汤对大鼠颈动脉损伤模型病理变化的影响、该信号通路标志因子和炎症因子的相关影响,明确血府逐瘀汤治疗血管内膜损伤可能的作用机制,丰富血府逐瘀汤的治疗范围和药理机制。方法:1.血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路对人脐静脉内皮细胞损伤后的影响用BEGM培养基培养人脐静脉内皮细胞。实验用药为血府逐瘀汤冻干粉用无血清培养基BEGM配制成100mg/ml含药培养基,在涡旋仪上充分混匀后,用0.22μm滤膜除菌过滤后,高压灭菌分装保存,4℃冷藏备用。MTS实验检测不同浓度血府逐瘀汤对HUVECs细胞增殖的影响,分为正常对照组（加等体积不含药培养基）、含药培养基组（浓度为6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、37.5μg/ml、50μg/ml）,培养24h和48h,分别检测OD值。细胞划痕实验检测血府逐瘀汤对HUVECs细胞迁移和修复的影响,分为对照组（无血清培养基）,血府逐瘀汤12.5μg/ml组、血府逐瘀汤25μg/ml组、血府逐瘀汤50μg/ml组。将6孔板封好,放入37℃,5%CO2培养箱,分别于0h、24h、48h镜下拍照（×10）。Real-time PCR检测HUVECs细胞物理损伤后24h和48hCaN/NFAT标志因子的表达量。2.血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路调控大鼠颈总动脉球囊损伤术后血管内膜增生的体内实验研究实验一:健康SD大鼠72只,分为6组,假手术组、模型组、他克莫司组、血府逐瘀汤高剂量组、血府逐瘀汤中剂量组、血府逐瘀汤低剂量组。假手术组只结扎颈外动脉,不做球囊扩张损伤,其余各组大鼠行球囊损伤术对大鼠颈动脉造成损伤,给药28天后取材。大鼠颈动脉做HE染色看各组病理形态变化情况,采各组大鼠血清用ELISA法检测血清MCP-1。实验二:取大鼠颈动脉组织,用免疫组化方法检测CaN含量,用Real-time PCR检测各组大鼠颈动脉中CaN、NFATc2、NFATc3、IL-2、TNF-α、COX2、S100A4 mRNA和蛋白表达水平。结果:1.血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路对人脐静脉内皮细胞损伤后的影响MTS细胞增殖实验结果示:24h、48h时血府逐瘀汤6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml浓度有促进细胞增殖的作用,到48h时血府逐瘀汤50μg/ml组表现出抑制细胞增殖的作用。细胞划痕实验结果示:24h、48h时血府逐瘀汤12.5μg/ml、25μg/ml浓度有促进细胞迁移和修复的作用,48h血府逐瘀汤50μg/ml组体现抑制细胞迁移的作用。Real-time PCR结果显示:血府逐瘀汤给药24h,12.5μg/ml、25μg/ml血府逐瘀汤组可显着上调CaN、NFATc1、NFATc2、NFATc3 mRNA的表达量（*P<0.05,#P<0.01）;到给药48h时CaN/NFAT信号通路标志因子有表达量下调的趋势,但无统计学差异。2.血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路调控大鼠颈总动脉球囊损伤术后血管内膜增生的体内实验研究实验一:颈动脉HE染色结果示:与模型组相比,血府逐瘀汤高剂量组有极少量血管新生内膜,极薄,有少量炎性细胞浸润,平滑肌细胞排列紊乱,弹力纤维板不平整比模型组要有明显改善减轻。血清MCP-1结果示:与假手术组相比各组大鼠血清MCP-1含量具有极显着差异(**P<0.01)。他克莫司组与中剂量中药组血清含量比较未见明显差异（P>0.05）,高剂量中药组与他克莫司组比较含量降低,有极显着差异(&&P<0.01)。实验二:免疫组化检测大鼠颈总动脉组织切片CaN的表达结果示:假手术组很少见棕黄色颗粒,模型组有内膜明显增厚,CaN表达呈阳性,可见数个棕黄色颗粒;他克莫司组、低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组棕黄色颗粒与模型组比较明显减少,提示药物干预后大鼠颈总动脉组织中CaN表达下降。血府逐瘀汤对大鼠颈总动脉组织中CaN/NFAT信号通路标志因子的影响:与假手术组相比,模型组CaN/NFAT信号通路标志因子CaN、NFATc2、NFATc3的基因和蛋白表达水平显着上调(**P<0.01),与模型组相比,血府逐瘀汤高剂量组能显着下调标志因子的基因和蛋白表达水平(##P<0.01)。血府逐瘀汤对球囊损伤后的大鼠颈总动脉中炎症因子的影响:与假手术组相比,模型组炎症因子IL-2、TNF-α、COX2的基因和蛋白表达水平显着上调(**P<0.01),与模型组相比,血府逐瘀汤高剂量组能显着下调三者的基因和蛋白表达水平(##P<0.01)。结论:1.血府逐瘀汤对HUVECs细胞的增殖和迁移在一定浓度剂量有促进作用,而随着浓度的升高有抑制作用,且这种抑制作用会随药物作用时间延长而体现出来。2.血府逐瘀汤对HUVECs损伤后CaN/NFAT信号通路标志因子在初期有促进作用,随药物作用时间延长会体现抑制趋势。3.血府逐瘀汤能有效改善球囊损伤后大鼠颈总动脉内膜增生的病变情况,为研究再狭窄提供基础。4.血府逐瘀汤可以降低大鼠颈总动脉组织中IL-2、TNF-α、COX2含量,能降低血清中MCP-1的含量,具拮抗炎症的作用。5.血府逐瘀汤能抑制大鼠颈总动脉组织中CaN、NFATc2、NFATc3的基因和蛋白表达量,提示血府逐瘀汤可通过CaN/NFAT信号通路抑制内膜过度增生,发挥防治再狭窄的作用。
吴玉婷[4]（2020）在《木犀草素通过转化生长因子β受体1抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移及血管内膜增生的作用研究》文中指出研究背景及目的:既往研究显示,血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cell,VSMC）由中膜迁移至内膜并异常增殖与血管再狭窄及所致相关疾病的发生、发展关系密切。相关临床及基础研究均提示补阳还五汤是防治冠状动脉粥样硬化性心脏病及血管再狭窄的有效药物,木犀草素（Luteolin）是补阳还五汤红花中所含黄酮类化合物之一,具有多种心血管保护作用,但其具体作用机制尚未完全阐明。本研究旨在通过体内外实验探索及验证木犀草素通过转化生长因子 β 受体 1（Transforming growth factor β receptor 1,TGFBR1）抑制 VSMC 增殖、迁移及血管内膜增生的作用,进一步明确补阳还五汤发挥防治血管再狭窄及相关疾病的物质基础,为中医中药防治血管再狭窄及所致相关疾病的临床应用提供科学依据。方法:体外实验:用不同浓度木犀草素（10,20,40μM）处理大鼠胸大动脉血管平滑肌细胞（A7r5）和人主动脉血管平滑肌细胞（HASMC）后,采用MTS、EdU染色、Transwell、细胞划痕实验、Western blot等实验方法检测木犀草素对VSMC增殖、迁移及TGFBR1信号通路激活的影响。并进一步通过分子对接及分子动力学模拟、表面等离子共振技术、TGFBR1体外酶活性等实验验证木犀草素与TGFBR1间的相互作用;使用过表达TGFBR1腺病毒（Ad-TGFBR1）在A7r5和HASMC中过表达TGFBR1,构建过表达TGFBR1细胞模型,进一步验证TGFBR1在木犀草素抑制VSMC增殖及迁移中的作用。体内实验:结扎小鼠左侧颈总动脉模拟损伤血管内膜增生,采用HE染色及免疫组化等实验技术检测木犀草素对损伤血管内膜增生的抑制作用及对TGFBR1的调控。并进一步通过构建过表达TGFBR1腺相关病毒载体,在血管组织中制备过表达TGFBR1基因的左侧颈总动脉结扎内膜增生模型,验证TGFBR1在木犀草素抑制损伤血管内膜增生中的作用。结果:体外实验:与对照组比,木犀草素能浓度依赖性的抑制VSMC增殖、迁移及TGFBR1信号通路的激活（P<0.05）;过表达TGFBR1后,木犀草素抑制VSMC增殖、迁移及TGFBR1信号通路激活的作用被部分抑制（P<0.05）。体内实验:与模型组比,木犀草素能抑制损伤血管内膜增生及TGFBR1信号通路的激活（P<0.05）;过表达TGFBR1后,木犀草素抑制损伤血管内膜增生及TGFBR1信号通路激活的作用被部分抑制（P<0.05）。此外,分子对接及分子动力学模拟、表面等离子共振技术、TGFBR1体外酶活性等实验亦提示:木犀草素可直接靶向作用TGFBR1,可作为潜在的TGFBR1抑制剂。结论:木犀草素可通过抑制TGFBR1信号通路的激活,抑制VSMC增殖、迁移及血管内膜增生,进而发挥防治血管再狭窄及相关疾病的作用。
杨骐[5]（2020）在《3D打印可降解外支架对移植静脉内膜增生的抑制作用及机制研究》文中指出目的 冠状动脉旁路移植术（CABG）是外科治疗冠心病的有方法,大隐静脉作为CABG中最常用的移植物,其术后内膜增生是造成移植物再狭窄、通畅率降低的重要原因之一。静脉外支架（VES）通过限制静脉管腔扩张、稳定血流动力学,具有抑制内膜增生,预防移植静脉再狭窄的作用,但其机制尚不明确。本研究拟通过3D打印技术,制作新型的生物可降解VES,并探索不同直径VES对移植静脉的抑制作用,阐述VES抑制移植静脉内膜增生的相关机制,并拓展新型VES的应用范围。方法 使用4轴-3D打印技术,制备具有生物可降解性能的聚己内酯（PCL）VES,通过调节制作参数,制作不同直径的VES;使用电子扫描显微镜观察新型VES的结构特点;力学测试表征VES的力学特点;体外细胞实验验证VES的生物相容性;通过建立大鼠自体颈静脉移植模型,分别植入不同直径的VES（1.5mm、2.0mm）,在术后2w、4w和8w对模型动物进行血管超声、组织学、免疫组化、免疫荧光等检测,分别观察移植静脉通畅率、内膜厚度变化和炎症因子表达;通过基因测序,发现有支架静脉和无支架静脉的差异基因表达,并分析差异基因功能;通过Western bolt、PCR验证移植静脉Hippo-YAP信号通路的活性改变;制作雷帕霉素（RM）涂层外支架并植入体内,在术后2w、4w和8w对模型动物进行血管超声、组织学、免疫组化检测,对比RM涂层支架与单纯VES的治疗效果,观察移植静脉内膜增生的变化,评价RM涂层支架的应用前景。结果 使用4轴-3D打印技术制作的可降解PCL-VES具有弹簧样管状结构,支架纤维粗细均匀一致;具有良好的生物相容性、径向抗扩张性、轴向弹性和可塑性。体内实验发现,与单纯静脉移植和使用2.0mm直径VES相比,使用1.5mm直径VES对移植静脉内膜增生有更强的抑制作用,可显着减少移植静脉炎性因子的表达,减少内皮细胞凋亡,提高移植静脉通畅率。此外,使用VES可改变移植静脉细胞外基质成分,调节胶原纤维比例,增加移植静脉的抗扩张性能,减少内膜巨噬细胞表达和增加内膜eNOS的表达。基因测序结果发现,与单纯移植静脉相比,使用VES可维持移植静脉Hippo-YAP信号通路的活性,减少内膜平滑肌YAP的表达,抑制新生内膜形成。RM涂层外支架可进一步抑制移植静脉内膜增生,抑制移植静脉mTOR的表达。结论 3D打印可降解VES具有优越的结构特征,良好的力学性能,可有效限制移植静脉扩张,保护内皮细胞功能;通过抑制内膜炎症因子表达、维持移植静脉Hippo-YAP信号通路活性,改善移植静脉重塑,抑制新生内膜形成,提高静脉通畅率;与单纯使用VES相比,RM-VES可更好的抑制移植静脉内膜增生。
李友乾[6]（2020）在《黄芪甲苷通过PI3K/Akt/mTOR通路抑制大鼠颈总动脉球囊损伤后血管内膜增生》文中指出目的:本研究旨在通过建立颈总动脉损伤的大鼠模型,明确不同剂量黄芪甲苷（astragalosides iv,ASIV）对血管内膜增生的抑制效果,并探讨黄芪甲苷通过磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein dinase B,Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammlian target of rapamycin,mTOR）（PI3K/Akt/mTOR）对自噬的影响机制。方法:选用SPF级健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24只,4-6周龄,约280g-300g,适应性喂养3天,随机选取6只作为假手术组。其余使用球囊损伤法建立大鼠颈总动脉球囊损血管模型,实验共分为四组,假手术组、模型组、低剂量黄芪甲苷组、高剂量黄芪甲苷组。低剂量黄芪甲苷组给于60mg·kg-1·d-1的黄芪甲苷,高剂量黄芪甲苷组给于120mg·kg-1·d-1的黄芪甲苷灌胃治疗,假手术组及模型组给予相同体积的1%羧甲基纤维素钠灌胃。4周后取大鼠损伤处颈总动脉做石蜡切片,光镜下观察血管腔形态,通过图像分析软件评估管腔面积、内膜增生程度、内膜中膜比值;免疫组化法测定血管组织中增殖指数（Ki67）、分化簇3（CD3）、分化簇68（CD68）表达,western blot检测血管组织中磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（phosphated phosphatidylinositol-3-kinase,p-PI3K）、PI3K、磷酸化蛋白激酶B（phosphated protein dinase B,p-Akt）、protein dinase B,Akt、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphated-mammlian target of rapamycin,p-mTOR）、mTOR、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen;PCNA）、α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin,α-SMA）、细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1;ICAM-1）、微管相关蛋白1轻链3B（Microtuble-associated protein 1 light chain 3B,LC3B）、P62的蛋白表达情况。明确不同剂量的ASIV对颈总动脉球囊损伤大鼠血管内膜增生的抑制效果及PI3K/Akt/mTOR信号通路磷酸化蛋白及总蛋白的表达情况。结果:1.与假手术组相比,模型组内膜增生程度明显升高（P<0.05）,血管腔面积较前减少（P<0.05）,中膜变化无统计学差异（P>0.05）;与模型组相比,ASIV组内膜增生被抑制（P<0.05）,血管腔面积增大（P<0.05）,且呈剂量依赖性,中膜面积无明显改变（P>0.05）。2.与假手术组相比,模型组CD3、CD68表达明显升高（P<0.05）,经ASIV治疗后CD3、CD68表达降低（P<0.05）,且呈剂量依赖性。3.与假手术组相比,模型组大鼠血清IL-6、TGF-β1、TGF-β2、TNF-α、IL-1β等炎症因子表达显着上调,经ASIV干预后相关炎性细胞因子表达被抑制。4.与假手术组相比,模型组PCNA、Ki67、Clo-1、β-catenin等因子明显升高（P<0.05）;与模型组相比,ASIV干预后相关因子表达被抑制（P<0.05）,且呈剂量依赖性。5.与假手术组相比,模型组大鼠颈总动脉组织中PCNA、ICAM-1蛋白表达增加,α-SMA蛋白表达减少（P<0.05）;与模型组相比,ASIV干预后PCNA、ICAM-1蛋白表达减少,α-SMA蛋白表达增加（P<0.05）。6.与假手术组相比,模型组大鼠颈总动脉组织中P-PI3K/T-PI3K、P-Akt/T-Akt、P-mTOR/T-mTOR蛋白表达降低（P<0.05）,与模型组相比,P-PI3K/T-PI3K、P-Akt/T-Akt、P-mTOR/T-mTOR蛋白表达蛋白水平升高（P<0.05）。7.与假手术组相比,模型组大鼠颈总动脉组织中P62蛋白表达降低（P<0.05）,与模型组相比,ASIV组P62水平升高（P<0.05）;与假手术组相比,模型组LC3B蛋白表达升高（P<0.05）,与模型组相比,ASIV组LC3B表达降低（P<0.05）。结论:1.ASIV可抑制大鼠颈总动脉球囊损伤术后内膜的增生,主要是通过抑制血管平滑肌细胞的增殖、迁移及表型转换。2.ASIV可通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制自噬发挥抗血管再狭窄的作用。
张润军[7]（2019）在《pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究》文中研究说明研究背景:心血管疾病（CVD）是全世界发病率和死亡率的主要原因。据估计,心血管病每年可导致1790万人死亡,约占全球死亡总数的31%。研究表明,血管炎症与多种心血管疾病的发病机制密切相关,如动脉粥样硬化、心肌梗死、再狭窄、颅内动脉瘤和主动脉瘤、卒中和外周动脉疾病。通过调节参与炎症反应的不同分子和细胞过程,已经有大量的治疗方法被研究用来预防和治疗心血管病。尽管在临床前研究方面取得了重大成果,但大多数已检测的抗炎药物的理想疗效尚未在临床实践中得到充分证明。在很大程度上,这可能与治疗分子递送到血管炎症部位的效率低下有关,这是由于它们的非特异性分布和从循环中被快速消除造成的。即使是炎症血管内局部吸收的药物,由于扩散不受控制,滞留时间也很短。近年来,基于纳米粒的靶向治疗被认为是一种很有前景的策略,可以特异性地递送不同的治疗和成像药物,用于检测或治疗血管炎症。尤其广泛的纳米粒已被设计作为靶向载体治疗动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭、缺血再灌注损伤、严重的肢体缺血、再狭窄、腹主动脉瘤和缺血性卒中。在这些例子当中,聚合脂质纳米粒、脂质体、重组高密度脂蛋白、来源于细胞的囊泡、无机纳米粒和金属纳米粒以及混合纳米粒被用于递送治疗药物,从小分子药物、多肽/蛋白质到核酸,治疗与血管炎症相关的心血管疾病。除了通过受损的内皮细胞层或EPR效应被动靶向到血管病变部位,纳米粒还可通过调节它们的物理性质（如几何结构和顺应性）,分子基团的修饰或特殊细胞膜的功能化,使血管靶向效率得到进一步提高。另一方面,可以根据血管炎症部位异常变化的生物化学信号,设计合成纳米粒的组成成份,有针对性地释放药物载荷。然而,这些血管靶向纳米治疗的转化仍然具有很大的挑战性。虽然直接调控抗原特异性亲和力可以增强纳米粒在血管的聚集,但仅用分子基团修饰后,纳米粒的靶向效率仍然非常有限。对于以细胞膜为基础的仿生策略衍生的纳米药物治疗,其相对复杂的配方流程和不明确的成分可能会妨碍其后续的大规模生产和临床研究。此外,需要进一步改进对感兴趣的血管病变部位的不可控的释放。越来越多的证据表明,双重或多重刺激响应性纳米粒能够在其作用的部位更精准地控制负载药物的释放,大大提高了药物的递送效率。在这方面,对多种生物化学信号或生物化学/物理信号敏感的纳米粒已被广泛用于肿瘤、糖尿病、炎症等多种疾病的靶向治疗。然而,基于这些响应性纳米粒治疗的临床转化并不简单,在很大程度上主要是由于更复杂的药物研发,尤其是在可重复性和质量控制方面。此外,针对目前大多数靶向血管的响应性纳米载体,体内安全性是另外一个重要的问题,尤其对于慢性疾病的治疗,因为大多数静脉注射纳米粒被单核吞噬细胞系统清除并聚集于肝脏和脾脏等器官。因此,亟待开发能够响应与血管炎症相关的生物化学信号,具有理想的靶向能力和良好的药物控释性能且更为有效和安全的纳米药物递送平台。通过对环糊精的化学功能化,最近开发了一系列在酸性和氧化应激条件下具有高度可调控水解行为的响应性材料。体外细胞培养和不同动物模型的在体实验研究结果证明,基于这些载体材料构建的纳米粒对低pH值和高ROS刺激具有较好的响应性及良好的生物安全性。鉴于血管内皮损伤后局部存在炎症微酸性环境和增高的氧化应激,通过整合优化活性氧和pH响应性的环糊精材料的比例,构建活性氧和pH双响应性纳米粒,可以作为一种新型有效和安全的纳米平台,用于血管炎症部位的药物递送。此外,结合分子靶向策略还可以进一步增强血管的靶向性和体内双响应性纳米粒治疗的有效性。本研究课题基于前期合成的pH响应性和活性氧（ROS）响应性的载体材料,以雷帕霉素为模型药物,构建了pH和ROS双响应的纳米药物递送系统,在大鼠颈动脉球囊损伤的血管炎症模型中,通过与非响应性、pH或ROS单一响应性纳米粒治疗比较,考察和评价了pH和ROS双响应性纳米粒的治疗优势以及双响应性主动靶向载药纳米粒在体防治血管再狭窄的效果。研究内容:1.基于β-CD的载体材料的合成1.1 pH响应性β-环糊精材料（ACD）的合成先将1 g β-CD 溶解在8 mL无水DMSO中,然后加入4 mL的2-甲氧基丙烯（MP）,磁力搅拌溶解并与有机试剂充分混匀,最后加入16 mg的吡啶对甲苯磺酸盐（PTS）。室温条件下反应3 h,然后加入0.3 mL三乙胺终止反应。得到的产物加超纯水沉淀,离心,洗涤3次冻干得到白色粉末。1.2 活性氧响应性β-环糊精材料（OCD）的合成将5.55 g 4-PBAP加入到36 mL无水二氯甲烷（DCM）中充分溶解,然后加入7.65 g 1,1’-羰基二咪唑（CDI）。室温条件下磁力搅拌反应0.5 h,再加入40 mL DCM,用30 mL超纯水洗涤三次。再用饱和NaCL洗涤有机相,无水Na2SO4干燥,真空浓缩得到 CDI 活化的 PBAP（CDI-PBAP）。随后,将 250 mg β-CD 和 1.52 g CDI-PBAP 加入至20 mL无水二甲基亚砜中,再加入800 mg DMAP反应过夜。最后,加入超纯水沉淀、离心收集,洗涤三次后冻干得到白色粉末。采用FT-IR和1H NMR对合成的上述两种响应性载体材料进行表征。2.不同纳米粒的制备采用纳米沉淀/自组装法制备基于不同材料的载RAP纳米粒。具体过程如下:精确称取 50 mg PLGA,ACD,OCD或ACD/OCD以不同的质量比混合（80:20、60:40、50:50、40:60、20:80）的载体材料和10 mg RAP共同溶于2 mL有机溶剂中,得到有机相。对于PLGA和ACD纳米粒,使用乙腈;OCD纳米粒,使用无水甲醇;ACD/OCD采用1:1（v/v）无水甲醇和乙腈混合溶剂制备有机相。另将0.6 mL卵磷脂无水乙醇溶液（10mg/mL）和9 mg DSPE-PEG2000溶解在10 mL的去离子水中,油浴加热至65℃ 1 h。然后,将有机相缓慢加入至上述的预热溶液中,磁力搅拌2 h。最后获得的纳米粒溶液用去离子水透析24 h,冻干后即得到不同的载RAP纳米粒（RAP/ACD NP,RAP/AOCD NP,RAP/OCD NP及RAP/PLGA NP）。空白纳米粒,Cy5或Cy7.5荧光标记的纳米粒均通过类似的方法制备获得3.不同纳米粒的表征不同NPs在水溶液中的粒径及粒径分布,Zeta电位通过马尔文粒径仪检测。取新鲜制备的纳米混悬液,滴加到载膜铜网上,室温晾干后透射电子显微镜下观察纳米粒子形态并拍照采集图像。同样将制备好的纳米粒混悬液滴加至云母片,喷金晾干后采用透射电子显微镜观察纳米粒形态并拍照采集图像。载RAP纳米粒在加入适量无水甲醇和乙腈混合溶液后离心,取上清通过高效液相色谱法（HPLC）检测RAP载药量。此外,Cy5或Cy7.5的含量通过荧光光谱仪测定。4.不同空白纳米粒体外水解实验将不同的纳米粒分别分散于pH 5、pH 6、pH 7.4以及加入1 mM H202 0.01 M的PBS缓冲液中。37℃孵育不同时间后,于设定时间点采集样品测定纳米粒溶液在500 nm波长处的透光率。最后,根据透光率计算纳米粒的水解百分比。5.载雷帕霉素纳米粒的体外药物释放实验将新鲜制备冻干的pH/ROS双响应性载RAP纳米粒5 mg分别分散在8 mL不同pH值（pH 5、pH 6、pH 7.4）以及加入 1 mM H2O2 0.01 M 的 PBS 缓冲液中,置于37℃孵箱内震荡混匀。在既定的不同时间点,将含有纳米粒的溶液以19118 g离心,取适量上清液并补充等量相同介质。HPLC检测RAP药物浓度,绘制纳米粒的药物累积释放曲线。单一响应性载药纳米粒RAP/ACD NP和RAP/OCD NP仍用相同的方法检测其不同时间点的累积药物释放量,绘制相应药物释放曲线。6.纳米粒的细胞吞噬实验将鼠主动脉血管平滑肌细胞株（MOVAS）以2×105个/孔的密度接种于12孔板中,孵育24小时后,去除培养基并加入相同浓度的Cy5荧光标记的不同纳米粒,在37℃条件下与平滑肌细胞孵育不同的时间。观察前,用溶酶体探针LysoTracker Green染色标记晚期核内体和溶酶体,DAPI染色细胞核。采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察并采集荧光图像。同样,在平滑肌细胞孵育24小时后,加入不同浓度梯度的Cy5标记基于不同载体制备的纳米粒与细胞共同孵育6小时后,考察细胞对纳米粒的剂量依赖性吞噬。另外,通过流式细胞术定量细胞对Cy5标记的不同纳米粒的吞噬,荧光活化细胞分选（FACS）测定荧光强度。考察孵育时间及纳米粒剂量对血管平滑肌细胞吞噬行为的影响。7.不同载雷帕霉素纳米粒体外抑制rVSMCs增殖和迁移的作用研究MOVAS细胞以5000个/孔的密度接种于96孔板,37℃孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB（20 ng/mL）及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP及RAP/AOCD NP）。正常对照组加入培养基,阳性对照组仅加入PDGF-BB,继续培养24h后,用CCK-8法检测细胞活性。采用8 μm孔径的Transwell小室评价载不同RAP纳米粒对PDGF-BB诱导的大鼠VSMCs迁移的影响。将MOVAS细胞以2×105个/孔的密度接种于12孔板中。37℃卵孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB（20 ng/mL）及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP 及 RAP/AOCD NP）与平滑肌细胞共同孵育。阳性对照组加入PDGF-BB,而正常对照组不加PDGF-BB和游离的雷帕霉素。6 h后,胰酶消化收集细胞,200μL培养基重悬,将不同治疗组的细胞分别加至Transwell上室,下室则加入600 μL含0.5%FBS和20 ng/mL PDGF-BB的培养基。孵箱内静置8 h后,用棉签轻轻擦去Transwell膜上方未迁移的细胞。4%多聚甲醛固定细胞,0.1%结晶紫染色。最后光学显微镜下观察拍照,随机选取5个视野计数染色细胞的数量并进行统计学分析。8.细胞周期检测MOVAS细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板,37℃孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP及RAP/AOCD NP）。正常对照组加入培养基,阳性对照组加入PDGF-BB。细胞与不同载药纳米粒共同孵育24 h后,胰酶消化并收集细胞,70%乙醇固定,4℃孵育过夜。通过洗涤后,将不同载药纳米粒干预的细胞与RNase在37℃条件下孵育30分钟,然后用碘化丙啶在4℃避光条件下进行细胞染色30分钟。最后通过流式细胞术检测平滑肌细胞在G1、S、G2/M期的比例并进行统计分析。9.免疫印迹分析将MOVAS细胞分别与不同载RAP纳米粒共同孵育24 h后,胰酶消化细胞,加入细胞裂解液,使细胞完全裂解,然后4℃条件下,12000 g离心30 min,收集上清,用BCA试剂盒测定蛋白浓度,进一步通过Western blotting检测细胞周期相关蛋白的表达水平。将含有50 μg蛋白的样本在10%十二烷基磺酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶上分离,电泳转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭,在4℃条件下,将膜与一抗体孵育过夜:（1）Cyclin D1 抗体,稀释1:200;（2）p27kip1抗体,稀释1:250;（3）β-actin抗体,稀释1:1000。然后在37℃条件下,将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗共同孵育1 h,二抗稀释倍数为1:1500。洗涤三次后,通过增强型化学发光试剂盒荧光成像显示特异性条带,同时进行半定量分析。10.不同纳米粒的细胞毒性实验研究将MOVAS细胞以10000个/孔的密度接种于96孔板,培养24 h后,加入不同浓度梯度的空白纳米粒（PLGA NP,ACD NP,OCD NP及AOCD NP）,共同孵育24 h后,CCK-8法检测细胞的活性。11.SD大鼠颈动脉球囊损伤再狭窄模型的建立雄性SD大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉起效后,颈部脱毛备皮,消毒,行颈前部正中切口,钝性分离皮下软组织及颈前肌肉组织,暴露颈动脉分叉,游离左侧颈总动脉及颈内、颈外动脉,将2F Fogarty取栓球囊导管由颈外动脉切口插入至颈总动脉近心端,PTCA压力泵以适当压力充盈球囊,旋转并回撤球囊至颈外动脉,重复三次,完全剥脱颈总动脉血管内皮。然后,尾静脉注射伊文思蓝评价血管内皮损伤情况。12.颈动脉损伤部位酸性炎症微环境和氧化应激水平的考察与评价采用细胞内pH荧光探针BCECF-AM对颈动脉损伤部位组织的pH值变化进行定性评价。在颈动脉球囊损伤模型建立后,于不同时间点取材损伤的颈动脉组织,O.C.T.包埋后,冰冻组织切片（8 pm）。然后,用10 μM ROS荧光探针DCFDA或5μM超氧阴离子荧光探针DHE分别对组织切片进行染色,检测球囊损伤局部组织ROS及超氧阴离子水平。另外,采用相应诊断试剂盒分别对损伤局部组织过氧化氢（H202）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性进行检测。ELISA试剂盒分别检测丙二醛（MDA）和髓过氧化物酶（MPO）的表达水平。同样,典型促炎细胞因子α-肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素1 β（IL-1 β）的表达水平也通过ELISA试剂盒分别检测。13.靶向Ⅳ型胶原的双响应性载RAP纳米粒的构建将靶向血管内皮下Ⅳ型胶原的多肽（KLWVLPKGGGC-Am）溶解在含有5 mmol/L EDTA的中性PBS缓冲液中,以二硫键/TCEP摩尔比1:1的比例,加入适量的TCEP断键溶液还原。然后,将多肽和DSPE-PEG-MAL以5:4的摩尔比,在4%乙醇溶液中,室温条件下磁力搅拌反应4h,合成KLWVLPKGGGC-DSPE-PEG三嵌段共聚物,未结合的游离肽通过透析去除。最后,将载体材料OCD/ACD以80:20质量比,DSPE-PEG-peptide/DSPE-PEG以1:9摩尔比混合,采用纳米沉淀自组装的方法,制备靶向IV型胶原的双响应性载RAP纳米粒。14.靶向纳米粒体外胶原结合实验的研究将Ⅳ型胶原溶解在0.25%醋酸中,配制浓度为0.5 mg/mL的胶原溶液。将100μL胶原溶液加入到96孔板中,4℃条件下孵育过夜。在胶原涂层或没有胶原涂层的孔板中先用50%血清封闭1 h后,再加入100μL用25%牛血清配制的Cy7.5荧光标记的双响应性靶向纳米粒（Cy7.5/TAOCD NP）,纳米粒浓度（0.2 mg/ml）。孵育1 h后,用包含0.05%吐温20的PBS缓冲液洗板3次。最后,通过IVIS光谱系统观察并拍摄孔板荧光图像。15.纳米粒体内靶向血管内皮损伤部位的研究大鼠颈动脉球囊损伤模型建立后,即刻经尾静脉分别注射Cy7.5荧光标记的不同纳米粒（Cy7.5/PLGA NP,Cy7.5/ACD NP,Cy7.5/OCD NP 及 Cy7.5/AOCD NP）,在体循环8 h后,取材完整的颈动脉及主要脏器,进行小动物活体荧光成像（IVIS）观察纳米粒在血管内皮损伤部位的荧光强度及组织分布情况并进行定量分析。另外,在颈动脉球囊损伤后,经尾静脉注射Cy7.5荧光标记的双响应性纳米粒（Cy7.5/AOCD NP）,在预设不同观察时间点取材损伤的颈动脉组织,离体成像观察和定量分析荧光强度,评价纳米粒的靶向和滞留时间变化情况。16.靶向纳米颗粒与损伤颈动脉的特异性结合的评价在大鼠颈动脉球囊损伤模型建立后,即刻经尾静脉注射Cy5荧光标记的靶向纳米粒（Cy5/TAOCD NP,25 μg/kg）。在体循环0.5 h后,给予安乐死,取材颈动脉组织,Tissue-Tek O.C.T.包埋,冰冻组织切片（5μm）,FITC标记的抗体染色血管内皮下IV型胶原,DAPI染核后,盖玻片封片,通过CLSM观察颈动脉组织荧光分布及靶向纳米粒与胶原共定位情况。17.不同载雷帕霉素纳米粒对SD大鼠颈动脉球囊损伤的疗效评价将30只雄性SD大鼠随机分为6组（n=5）,包括假手术组（正常组）、生理盐水治疗组（模型组）,以及RAP/PLGA纳米粒组、RAP/ACD纳米粒组、RAP/OCD纳米粒组及RAP/AOCD纳米粒组。除假手术组外,其余各组大鼠均按上述方法实施颈动脉球囊损伤。在颈动脉球囊血管成形术后,分别于术后即刻（0d）,4 d,8 d,12 d尾静脉注射RAP终浓度为1 mg/kg的不同载RAP纳米粒。在另一项单独设计的实验研究中,RAP/AOCD纳米粒或RAP/TAOCD纳米粒在大鼠颈动脉球囊损伤后即刻（0 d）,5 d,10 d分别以终浓度1 mg/kg的RAP经尾静脉注射给药。在血管成形术后第14 d,给予大鼠安乐死。原位灌注后取材损伤的颈动脉段及主要脏器,进行组织学和免疫组化研究,考察相关标志物表达水平。18.双响应性纳米粒的急性毒性和载雷帕霉素纳米药物治疗对SD大鼠的长期毒性评价实验12只雄性SD大鼠（180-250g）随机分为4组（n=3）。在AOCD纳米粒组,尾静脉注射不同剂量（250、500或1000 mg/kg）AOCD纳米粒。正常对照组给予尾静脉注射生理盐水。仔细观察各组动物的相关毒性症状和行为活动状况。在规定的时间点称量检测体重变化。在给药后第14 d,给予大鼠实施安乐死,即刻采集血样进行血液学和生化相关指标分析。收集主要脏器并称重,分析计算脏器指数（每只大鼠的器官重量与体重之比）,同时制作组织切片H&E染色观察其病理变化。健康雄性SD大鼠16只,体重（180-250 g）随机分为4组（n=4）。空白纳米粒组按11.5 mg/kg AOCD NP治疗（相当于RAP纳米粒的治疗剂量1 mg/kg）,另外两组分别按1 mg/kg RAP/AOCD NP或 3 mg/kg RAP/AOCD NP,尾静脉注射,每周 2 次,连续 12周。正常对照组大鼠则给予静脉注射生理盐水。治疗期间,每天动态观察各组动物死亡率、外貌、全身状况和行为异常等情况。每周记录食物和水的消耗以及体重变化情况。第12周,给予安乐死。采集血液样本,化验分析具有代表性的血液学和生化指标。取主要脏器包括心、肝、脾、肺、肾并称重计算脏器指数。同时制备组织学切片,H&E染色观察病理变化。另外,用抗CD3抗体和抗CD19抗体对脾脏组织切片进行免疫组化染色,评价长期载RAP纳米药物对SD鼠免疫功能的影响。19.双响应性载雷帕霉素纳米粒长期治疗后小鼠脾脏T、B淋巴细胞的定量研究实验将24只雄性C57BL/6J小鼠（18-22 g）随机分为4组（n=6）。正常对照组给予生理盐水,空白纳米粒组按11.5 mg/kg（相当于载RAP纳米粒治疗剂量1 mg/kg）剂量尾静脉注射AOCD NP。另外两组小鼠分别给予RAP/AOCD NP,1 mg/kg或3 mg/kg,尾静脉注射,每周2次,连续给药12周。在治疗期间,观察小鼠的一般身体状况的任何变化,包括外貌,摄食、饮水,行为活动及死亡率等。第12周,对小鼠实施安乐死。取脾脏并将分离的脾脏组切成小块,加入无菌PBS缓冲液,对组织进行彻底研磨,然后在淋巴细胞分离培养基中离心收集细胞。将FITC标记的抗CD3抗体及PE标记的抗CD19抗体在4℃条件下,与脾脏组织提取的淋巴细胞共同避光孵育30 min后,用流式细胞染色缓冲液洗涤细胞2次,PBS缓冲液重悬细胞。最后,采用流式细胞仪对脾脏组织中T细胞和B细胞的百分率进行定量分析,评价RAP/AOCD NP治疗对适应性免疫系统的影响。研究结果:1.pH和ROS双响应性纳米粒的制备基于β-环糊精（β-CD）,通过单步缩醛化反应合成pH响应性的载体材料（ACD）,傅里叶红外光谱和核磁共振氢谱检测证实ACD被成功合成。根据ACD 1H NMR谱计算,环缩醛与线性缩醛的摩尔比约为0.62,缩醛化度约为90%。此外,（OCD）通过在β-CD分子上将氧化敏感性苯硼酸酯单元4-PBAP以羰基键合的方式引入β-CD合成ROS响应性载体材料,1H NMR谱证实,每个β-CD分子大约有7个PBAP单元。采用改良的纳米沉淀/自组装法制备基于上述两种不同响应性的载体材料的双响应性纳米粒,将ACD和OCD以不同重量配比,构建了 pH/ROS双响应性纳米粒。基于ACD/OCD的不同纳米粒,在质量比为 100:0、80:20、60:40、50:50、40:60、20:80、0:100 时,分别命名为 ACD NP、AOCD8020 NP、AOCD6040 NP、AOCD5050 NP、AOCD4060 NP、AOCD2080 NP和OCD NP。透射电镜（TEM）观察,在不考虑组成分差异的情况下,所制备的纳米粒均为球形,形态规则,粒径均一。马尔文粒径电位检测显示所有制备的纳米粒Zeta-potential均为负值,平均流体力学粒径变化范围从121±2到186±4 nm。不同纳米粒的粒径分布相对较窄。提示ACD与OCD载体材料具有良好的混合相容性。2.不同双响应性纳米粒的体外水解特性基于载体材料ACD和OCD构建的pH/ROS双响应纳米粒的体外水解,在含有1mM H2O2及不同pH值的PBS缓冲液中进行。对于ACD NP,在pH 5或pH 6的微酸性条件下均表现出明显的快速水解,而H2O2的存在对其水解几乎无任何影响,具有良好的响应低pH的特性。相对于ACD NP,OCD NP的水解则与pH无关,在H202存在的条件下,OCD NP水解迅速。相比在不同的pH值,OCD NP在pH值为5、6或7.4时均表现出类似的水解特性。基于载体材料ACD和OCD构建的双响应性纳米粒,它们的水解行为依赖于pH和H202,通过在含有1 mM H2O2及不同pH条件的PBS缓冲液中,比较基于不同比例ACD和OCD载体材料制备的双响应性纳米粒水解试验的结果,提示基于ACD/OCD的纳米粒具有pH和ROS双重响应的能力。AOCD2080 NP和AOCD8020 NP在1 mM H2O2和pH 5、6或7.4环境中,表现出更为理想的双响应的特性。此外,在H202存在的情况下,AOCD2080 NP在不同pH值条件下表现出较好的水解行为,因此,AOCD2080纳米粒进一步被用于后续的课题研究。采用基于ACD和OCD的复合材料,成功地构建了 pH/ROS双响应性纳米药物递送平台。值得注意的是,通过改变ACD/OCD的质量比,可以很容易地调控制备得到的纳米载体的精确的水解敏感性。3.pH和ROS双响应性载药纳米粒的制备和表征通过不同响应性空白纳米粒制备响应的载RAP纳米粒。同时,利用PLGA制备了非响应性载药纳米粒作为对照。与相应的空白纳米粒相似,四种载药纳米粒Zeta-potential均为负值,平均流体力学粒径变化范围从121±2到179±6 nm。RAP/PLGA纳米粒、RAP/ACD纳米粒、RAP/OCD纳米粒、RAP/AOCD纳米粒的载药量分别为4.5±0.4%、9.4±0.2%、8.2±0.1%、8.7±0.4%。通过体外药物释放实验研究检测了不同纳米药物的响应性释放行为。对于RAP/AOCD NP,与中性（pH=7.4）PBS缓冲液相比,RAP的释放在微酸性（pH=5或pH=6）PBS缓冲液中明显加快。同时,无论在上述三种不同pH值的PBS缓冲液中,在1mM H2O2存在的条件下都显着增加了载药纳米粒的药物释放速度。因此,RAP/AOCD NP表现出理想的pH/ROS双响应的释药能力,这与相应的空白纳米粒AOCD2080 NP的双响应性水解特性相吻合。另外,单一响应性载药纳米粒RAP/ACD NP和RAP/OCD NP药物释放也同样符合相应纳米载体的水解性能。通过利用基于pH响应性和ROS响应性材料设计的纳米复合材料可以简单、成功地构建出pH/ROS双响应性载RAP纳米粒。4.体外rVSMCs对双响应纳米粒的摄取Cy5标记的双响应性纳米粒（Cy5/AOCD NP）与VSMCs孵育1 h后,VSMCs中的荧光信号随着Cy5/AOCD纳米粒的剂量的增加而明显增强,提示细胞对纳米粒的内吞呈现剂量依赖性的特点。与激光共聚焦显微镜观察结果一致,流式细胞术荧光激活细胞分选（FACS）定量进一步证实了 VSMCs对Cy5/AOCD NP的有效细胞摄取呈剂量依赖的方式。在相同剂量的Cy5/AOCD NP下,随着孵育时间的延长,Cy5荧光在VSMCs中的分布也随之增加。而且,通过溶酶体探针Lysotracker对晚期核内体和溶酶体进行染色,发现血管平滑肌中内吞Cy5/AOCD NP从核内体/溶酶体转运到细胞质中（核内体/溶酶体逃逸现象）。同样,FACS的分析表明,随着孵育时间的增加,VSMCs内吞Cy5/AOCDNP的作用增强。这些结果充分表明,大鼠VSMCs可以有效地内吞基于ACD和OCD材料构建的pH/ROS双响应性纳米粒。在酸性和氧化应激微环境的亚细胞细胞器中,与pH响应性或ROS响应性的纳米粒相比,双响应性纳米粒能够更快地释放负载的药物分子。5.双响应性载药纳米粒的体外生物学效应不同响应性纳米粒的细胞毒性均较PLGA纳米粒低。载雷帕霉素纳米粒在相对低剂量下具有较低的细胞毒性。经RAP原料药和不同的RAP纳米粒治疗24小时,可显着抑制VSMCs的迁移。值得注意的是,与游离RAP相比,所有载药纳米粒都显示出明显更强的抑制VSMCs迁移效果。此外,响应性载药纳米粒对VSMCs迁移的抑制作用比非响应性载药纳米粒（RAP/PLGA NP）更为显着。值得注意的是,双响应性纳米药物治疗（RAP/AOCD NP）的抑制血管平滑肌细胞增殖的效果最好,与单一响应性纳米粒治疗相比差异显着。而且,不同载药纳米粒治疗对细胞周期的影响的实验表明,载RAP纳米粒主要通过抑制细胞G1/S的转化从而抑制VSMCs的增殖。载RAP纳米粒使细胞周期停滞在G1期的机制研究表明,双响应性载RAP纳米粒抑制VSMCs增殖通过上调p27Kip1和下调cyclin D1表达使细胞停滞于G1期。6.双响应性载RAP纳米粒在体靶向治疗血管再狭窄以大鼠颈动脉球囊损伤为模型,建立大鼠血管炎症性疾病模型,并通过Evan’s蓝染色证实明显的内皮剥脱损伤。pH敏感性荧光探针检测颈动脉损伤局部pH值的变化显示:正常动脉显示明显的绿色荧光,而球囊损伤后第1、7、14天分离的动脉组织荧光信号明显较弱,表明损伤动脉中存在相对酸性的微环境。用DHE和DCFHDA荧光探针对大鼠颈动脉冰冻组织切片进行染色,与正常动脉相比,球囊损伤后第1天颈动脉荧光强度轻度升高。而在损伤后第7天和第14天,可以观察到明显的增强荧光。这些结果证实动脉损伤部位存在氧化应激,很大程度与炎症的进展有关。双响应性纳米粒对损伤颈动脉的靶向性研究表明,纳米粒对内皮损伤的颈动脉具有靶向性,定量分析显示,非响应性纳米粒和响应性纳米粒治疗组间差异并无统计学意义。载RAP纳米粒给血管再狭窄治疗带来不同程度的获益,颈动脉管腔面积显着增加,而内膜面积和增殖指数明显减少,中膜面积无明显变化。在各组载RAP纳米粒的治疗中,双响应性载药纳米粒疗效最佳。在不同的载RAP纳米粒治疗后,免疫组织化显示:总α-SMA阳性细胞数量明显减少。此外,所有纳米药物治疗组的PCNA均显着降低,但以RAP/AOCD NP组的效果最好。MMP-2结果与PCNA相似。而且,在给予响应性载药纳米粒治疗的大鼠动脉中的8-OHdG表达显着降低。定量分析显示,在双响应性载药纳米粒治疗后,动脉组织中典型的氧化应激相关标志物,包括H202、MDA和MPO的水平显着降低。另一方面,损伤颈动脉SOD活性明显降低,经RAP/AOCD NP治疗后,SOD活性得到有效恢复。同时,与模型组相比,组织损伤部位的促炎细胞因子包括肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素（IL）1 β的表达水平在RAP/AOCD NP治疗后也发生了显着降低。7.pH和ROS双响应性靶向Ⅳ型胶原的载药纳米粒的制备与表征通过巯基-马来酰亚胺键合,将多肽KLWVLPKGGGC与DSPE-PEG结合。通过类似改良的纳米沉淀法/自组装法成功构建了靶向Ⅳ型胶原、p H-/RO S-双响应性纳米粒（TAOCDNP）。经TEM和SEM检测,TAOCDNP呈球形,具有较窄的粒径分布。平均流体力学直径131 nm,Zeta电位-27.2±0.3 mV。雷帕霉素可以包载到TAOCD NP中,形成一种靶向、双响应性载药纳米粒（RAP/TAOCD NP）,球形结构、粒径分布窄,能够有效负载雷帕霉素。8.TAOCD NP的体内外靶向能力评价与非靶向NPs（AOCD NP）相似。共聚焦显微镜观察和流式细胞术定量分析均显示VSMCs对Cy5/TAOCD NP的吞噬呈剂量依赖性和时间依赖性方式。这些结果证实了靶向肽的加入对AOCD NP的细胞摄取行为没有显着影响。Cy7.5/TAOCD NP在体外对ⅣV型胶原的粘附表明,引入到TAOCD NP上的靶向肽维持了其对ⅣV型胶原的特异性结合能力。TAOCD NP在体靶向能力表明,Cy7.5/TAOCD NP组在血管内皮损伤部位的荧光强度明显高于Cy7.5/AOCD NP组。动脉组织切片的显微镜观察也显示Cy5/TAOCD NP有相对较强的荧光。大鼠颈动脉冰冻组织切片Ⅳ型胶原抗体免疫荧光染色显示损伤动脉中Ⅳ型胶原（绿色荧光）与红色Cy5荧光共定位,而正常动脉中未见Cy5荧光。总之,这些结果证明,经靶向Ⅳ型胶原多肽修饰可显着增强pH和ROS双响应性纳米载体对损伤颈动脉的被动靶向聚集。9.双响应性载RAP靶向纳米粒靶向治疗血管再狭窄颈动脉H&E染色显示,RAP/AOCD NP或RAP/TAOCD NP治疗均能明显抑制血管新生内膜增生。与RAP/AOCD NP治疗组相比,RAP/TAOCD NP组在增加管腔面积、减少内膜面积及降低增殖指数方面均有显着差异。同样,免疫组化分析显示,与RAP/AOCD NP相比,RAP/TAOCD NP能更有效抑制VSMCs在血管内膜的增殖,显着降低了 MMP-2和8-OHdG的表达。这些结果表明,pH-/ROS-双响应性纳米药物治疗的体内防治血管再狭窄效果可以通过靶向单元修饰进一步增强。10.安全性评价将不同浓度的AOCD NP与红细胞孵育2 h,即使在浓度为2 mg/mL时,直接观察和定量分析均未见溶血。体内急性毒性试验显示,所有AOCD NP组均正常摄食和饮水,无异常行为。所有AOCD NP治疗大鼠的脏器指数（主要脏器）均与生理盐水组相当。此外,AOCD NP组血常规及肝功能,生化等相关指标与生理盐水组比较,各组间差异无统计学意义此外,对主要脏器的病理组织切片H&E染色表明,AOCD NP治疗的大鼠没有明显的病理改变。另外,对双重响应性载药纳米粒（RAP/AOCD NP）也进行了体内安全性研究。生理盐水组与空白纳米粒（AOCDNP）组及RAP/AOCDNP组脏器指数无显着差异。同样,经AOCD NP或RAP/AOCD NP治疗的大鼠在血常规及肝肾功能相关的生物标志物方面与生理盐水组比较,各组间差异无统计学意义。主要脏器的H&E染色切片显示几乎没有损伤。此外,鉴于RAP的免疫抑制活性,长期应用双响应载RAP纳米粒对大鼠脾脏T、B淋巴细胞数量无明显影响。而且,对C57BL6J小鼠进行类似的纳米粒长期给药治疗后,流式细胞术检测小鼠脾脏中T细胞和B细胞的数量,结果显示在RAP/AOCD NP作用下,小鼠脾脏中T细胞和B细胞的数量并没有显着变化。这些结果提示,相对低剂量的RAP/AOCD NP治疗对适应性免疫系统没有显着的负面影响。总体而言,AOCDNP和RAP/AOCD NP均具有出良好的生物安全性。研究结论:1.通过联合基于β环糊精合成的pH响应性和ROS响应性材料,同时设计了一种简单和有效的方法成功构建了 pH和ROS双响应的纳米载体。2.通过优化pH响应性材料（ACD）和ROS响应性材料（OCD）的投料质量比,制备了最佳的pH和ROS响应能力的纳米粒。3.双响应性纳米粒AOCD NP能够有效地负载RAP,在低pH值或ROS较高的环境下,触发RAP/AOCD NP释放负载的RAP。RAP/AOCD NP可以通过被rVSMCs有效内吞并在亚细胞细胞器的敏感释放,增强药物分子在细胞内的递送。相比于游离RAP,非响应性和单响应性载RAP纳米粒,RAP/AOCD NP显着的抑制了血管平滑肌细胞的增殖和迁移。4.AOCD NP能够靶向聚集在大鼠颈动脉球囊损伤的部位,通过在动脉损伤部位被动靶向和触发释放RAP,与其他载药纳米粒比较,RAP/AOCD NP在大鼠中表现出更理想的抗再狭窄作用。5.通过靶向ⅣV型胶原多肽的修饰,进一步提高了AOCD NP的靶向能力,成功制备了 pH/ROS双响应的靶向纳米递送平台TAOCD NP。负载RAP的TAOCD NP比相比RAP/AOCD NP,更有效地抑制了大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的形成。6.AOCD NP和RAP/AOCD NP均具有良好的生物安全性。本课题研究设计的pH/ROS双响应纳米载体和构建的纳米药物递送系统有望进一步用于治疗血管再狭窄和其他与血管炎症相关的心血管疾病。
阎卉芳[8]（2019）在《黄芪当归配伍对大鼠血管内膜增生VSMC增殖的影响及PI3K/Akt信号途径机制的研究》文中研究说明目的通过探讨黄芪和当归不同比例配伍对血管内膜增生的影响,确立黄芪和当归抗血管内膜增生的有效配伍,并在黄芪和当归抗血管内膜增生的有效配伍基础上以血管平滑肌细胞为靶点,探讨其对增生内膜中血管平滑肌细胞（VSMC）表型转化、细胞增殖周期和细胞增殖相关PI3K/Akt信号通路的影响。方法雄性大鼠制备胸腹主动脉球囊导管损伤血管内皮模型,采用基线等比设计方法设计黄芪和当归单用及不同比例配伍,对内皮损伤模型大鼠灌胃给药,干预14天后取腹主动脉行Masson染色,采用形态计量学方法分析血管新生内膜病理形态变化,以免疫组化法检测腹主动脉内膜SMа-actin、PCNA表达,以Western blot法测定细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin E,及细胞增殖相关信号通路PI3K、Akt蛋白表达。结果球囊导管损伤主动脉内皮后,主动脉的内膜面积（IA）、内膜厚度（IT）、内膜面积增生率（HRIA）和内膜厚度增生率（HRIT）均显着增加（P<0.01）。与模型组比较,单用当归组、芪归1:2组、芪归1:5组、芪归1:1组、芪归5:1组的IA、IT、HRIA、HRIT均显着降低（P<0.05）,且以芪归1:1配伍作用最强。单用黄芪组、芪归2:1组与模型组比较内膜增生各项指标均无显着性差异（P>0.05）。免疫组化法检测表明,当归、黄芪、黄芪-当归1:1配伍、黄芪-当归5:1配伍可增强增生血管内膜中SMа-actin的表达,抑制增生内膜中PCNA蛋白表达。WB检测表明,当归、黄芪、黄芪-当归1:1配伍、黄芪-当归5:1配伍可抑制受损血管cyclinD1、cyclinE蛋白表达的增高,抑制增生内膜中p-PI3K和p-Akt蛋白表达的升高。结论黄芪当归配伍对血管内皮受损后内膜增生具有抑制作用,以黄芪当归1:1配伍的效应最强。其作用与抑制血管内皮受损后VSMCs表型转化和VSMCs增殖有关。黄芪当归配伍抑制VSMCs表型转化和增殖的机制可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路活化,从而抑制VSMCs增殖介导的。
杜若林[9]（2019）在《生物可吸收PLLA血管内支架对内膜修复和血管重构的影响及其机理研究》文中研究指明经皮冠状动脉介入治疗是心血管疾病治疗的重要手段,生物可吸收支架可短期支撑血管,有效防止支架植入后血管急性闭塞和降低再狭窄发生率。生物可吸收支架植入后逐渐被血管吸收分解,力学刺激逐渐消失,这一复杂过程可能造成血管发生不同于传统金属药物支架的反应,影响局部细胞的表型和功能,对该支架的评价应区别于传统的药物洗脱金属支架。目前鲜有研究结合生物可吸收支架的特点提出植入后功能性健康内皮的修复和促进血管重构等的相关评价指标,包括生物可吸收支架的在体降解及其对细胞的影响、胞外基质变化等,这些问题也是有效解决生物可吸收支架临床应用中支架再狭窄、血栓及局部炎症的关键。因此,本文重点关注支架植入后的内膜修复和血管重构过程,并探讨其机理,旨在为生物可吸收支架的综合评价提供新的可参考依据。以大鼠腹主动脉为动物模型,分析了左旋聚乳酸（Poly-L-lactic acid,PLLA）支架植入后内皮功能、血管的重建、支架降解与血管细胞的反应,并探究了降解产物乳酸对平滑肌细胞表型的影响,获得的主要研究结果如下:（1）PLLA血管内支架植入后的再内皮化与内皮功能恢复。PLLA支架植入后4周再内皮化基本完成,随后CD31在管腔层细胞逐渐形成稳定表达,新生内膜具有更好的内皮屏障功能。支架植入早期新生内膜发生了CD31hiEMCNhi内皮亚型变化,随后这种内皮亚型的表达逐渐减弱。血管的炎症水平先升高后降低。总之,PLLA支架植入后内膜修复是一个变化的过程,能够获得具有低炎症、内皮化良好且屏障功能较优的新生内膜。（2）PLLA血管内支架植入后时间依赖的内膜增生与血管修复重建。PLLA支架植入后管腔直径先减小后增加,内膜增生程度先增加后减少,同时伴随增生内膜中细胞表型的变化。PLLA支架植入后胶原纤维先增加后减少而弹性纤维先减少后增加,均在24周出现变化的转折,植入后24周开始血管经历正向重建过程,48周更接近正常血管。综上,PLLA支架植入后新生内膜增生程度先增加后降低,血管在24周开始正向重构,48周后血管逐步趋向于恢复正常。（3）PLLA血管内支架在体降解过程与伴随的血管细胞表型变化。PLLA支架植入后24周出现显着降解,支架丝轮廓变小,出现降解碎片。力学响应因子MGF与BMP2伴随支架降解先增加后减少。血管细胞发生表型转化,RUNX2表达先增多且入核发挥转录因子功能,随后随时间增加表达减少。总之,PLLA支架植入后24周出现显着降解,血管细胞经历了从正常到成骨转化随后转化程度降低的变化过程。（4）PLLA降解产物乳酸促进血管平滑肌细胞发生成骨表型转化。PLLA降解产物乳酸增加细胞对环境力学变化的响应,增加细胞力学响应因子MGF的表达和对基底硬度的响应。乳酸可促进细胞由平滑肌表型向成骨表型转化,促进靠近内膜和外膜区域的血管中膜平滑肌细胞中RUNX2的表达和入核。乳酸可以通过单羧酸转运蛋白1进入血管细胞并升高细胞内乳酸脱氢酶B的水平,促进细胞的溶酶体数量升高。但在血管损伤同时存在时,血管优先对损伤进行反应,支架植入后血管反应复杂,乳酸并不一定占主要地位。总之,PLLA降解产物乳酸能够促进血管平滑肌细胞的成骨表型转化。综上所述,PLLA支架植入后血管修复重建匹配支架的降解进程,PLLA支架植入1周主要为炎症反应,4周内膜增生严重,12周内皮化完全,在这一过程中获得具有内皮化良好且屏障功能较优的新生内膜。而PLLA支架植入后血管增生程度先增加后降低,PLLA支架在24周出现显着降解,开始正向重建,48周血管已经发生了正向的修复,在整个修复过程血管细胞发生了表型转化。PLLA降解产物乳酸能刺激细胞发生成骨表型转化,支架植入极晚期存在血管钙化的风险。本研究从动物模型入手详细评估了PLLA支架植入后的血管内膜修复和血管重建过程,为生物可吸收支架的临床评价提供更多可参考依据,同时也为支架的药物涂层设计提供更多理论基础。
樊天斐[10]（2019）在《薯蓣皂苷抑制血管平滑肌细胞增殖迁移及内膜新生的实验研究及机制》文中研究指明目的:探讨薯蓣皂苷对血管平滑肌细胞的增殖迁移以及内膜新生的作用及其潜在的机制。方法:1.薯蓣皂苷对大鼠颈动脉损伤后平滑肌细胞增殖以及内膜新生的作用研究:采用大鼠颈动脉球囊损伤方法建立内膜增生模型,通过HE染色观察血管的形态,分析并计算血管的管腔面积、内膜面积、中膜面积和内膜/中膜面积比,并用免疫荧光染色检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和CD31的表达水平并分别计算阳性率和荧光面积。2.薯蓣皂苷对体外培养的大鼠平滑肌细胞增殖迁移及表型转换的作用研究:体外培养原代大鼠主动脉血管平滑肌细胞,用MTT法检测薯蓣皂苷对平滑肌细胞增殖的影响,用western blot方法检测PCNA的蛋白表达进一步确认药物对细胞增殖的作用,用划痕实验检测薯蓣皂苷对平滑肌细胞迁移的影响,并用western blot法和RT-q PCR实验法检测薯蓣皂苷对细胞表型转换的影响。同时检测薯蓣皂苷对内皮细胞增殖和迁移的影响。3.薯蓣皂苷抑制血管平滑肌细胞增殖迁移的作用机制研究:用western blot实验检测磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）的活性和叉头盒转录基因M1（Fox M1）的表达,用RT-q PCR法检测Fox M1及其下游靶基因的表达水平。过表达和敲减Fox M1后,采用MTT法和划痕实验检测Fox M1在血管平滑肌细胞增殖和迁移中的作用。结果:1.薯蓣皂苷抑制大鼠颈动脉损伤后平滑肌细胞增殖以及内膜新生:大鼠颈动脉损伤后管腔面积明显减少,内膜面积和内膜/中膜面积显着增加,表明成功的建立了颈动脉损伤后内膜增生模型。与模型组比较,薯蓣皂苷高剂量组的管腔面积显着增加,内膜面积和内膜/中膜面积显着下降,差异具有统计学意义（P<0.01）。损伤动脉内膜PCNA和α-SMA表达显着增加,与模型组比较,薯蓣皂苷高剂量组显着降低了PCNA阳性率和α-SMA荧光面积（P<0.01）。薯蓣皂苷低剂量组有降低新生内膜面积和平滑肌增殖的趋势,但和模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。CD31的免疫荧光结果显示,薯蓣皂苷不影响血管损伤后再内皮化（P>0.05）。2.薯蓣皂苷抑制体外培养的大鼠平滑肌细胞增殖、迁移和表型转换:MTT实验结果显示,薯蓣皂苷能抑制10%FBS所诱导的细胞增殖,并且作用强度呈剂量依赖性,western blot检测发现薯蓣皂苷能显着降低PCNA的蛋白表达水平。划痕实验结果显示,薯蓣皂苷可以抑制20ng/ml PDGF所诱导的平滑肌细胞的迁移。此外,薯蓣皂苷还可以使平滑肌细胞收缩表型标志物α-SMA、SM22α表达增多,合成表型标志物OPN表达减少。而相同剂量的薯蓣皂苷对内皮细胞的增殖和迁移没有影响。3.薯蓣皂苷通过抑制ERK1/2-Fox M1通路抑制平滑肌细胞的增殖迁移:Western blot和RT-q PCR实验结果显示,薯蓣皂苷可以降低ERK1/2磷酸化活性,并降低Fox M1及其下游靶基因的表达。MTT法和划痕实验结果显示,过表达Fox M1能促进平滑肌细胞的增殖和迁移,但敲减Fox M1则抑制平滑肌细胞的增殖和迁移。结论:1.薯蓣皂苷可以抑制大鼠颈动脉损伤后的内膜增生,这与其抑制血管平滑肌细胞的增殖作用有关,提示薯蓣皂苷可能对PCI术后血管再狭窄有积极的防治作用。2.薯蓣皂苷可以抑制由FBS或者PDGF诱导的体外培养的原代大鼠血管平滑肌细胞的增殖、迁移和表型转换。3.薯蓣皂苷是通过抑制ERK1/2-Fox M1通路抑制血管平滑肌细胞增殖迁移的。
二、Influence of Stent Implantation on the Expression of PCNA and Apoptosis in Injured Vascular Smooth Muscle Cells（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Influence of Stent Implantation on the Expression of PCNA and Apoptosis in Injured Vascular Smooth Muscle Cells（论文提纲范文）
（1）WDR1在血管平滑肌细胞中参与血管损伤后重构过程的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肌动蛋白概述 |
| 1.2 WDR1的结构和actin切割 |
| 1.3 WDR1的生物学功能 |
| 1.3.1 WDR1与癌症 |
| 1.3.2 WDR1与内皮发育 |
| 1.3.3 WDR1与肌节组装 |
| 1.3.4 WDR1与血液疾病 |
| 1.4 本课题研究内容 |
| 1.4.1 血管损伤模型构建 |
| 1.4.2 探究血管损伤与WDR1的相关性 |
| 1.4.3 体外证实WDR1对平滑肌细胞的影响 |
| 1.4.4 STAT3与WDR1相互调控的分子机制 |
| 1.5 研究意义 |
| 第二章 WDR1在血管损伤模型中的表达分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 成功构建颈动脉损伤的小鼠模型 |
| 2.3.2 颈动脉结扎后Wdr1表达水平呈时间依赖性增高 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 Wdr1的缺失抑制血管新生内膜的形成 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 成功构建Wdr1条件性敲除小鼠 |
| 3.3.2 Wdr1条件性敲除抑制了血管内膜的增厚 |
| 3.3.3 敲除Wdr1抑制平滑肌细胞的增殖和迁移 |
| 3.3.4 原代血管平滑肌细胞敲降Wdr1抑制细胞的增殖和迁移 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 STAT3直接调控Wdr1的转录来促进平滑肌细胞的增殖和迁移 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 WDR1促进平滑肌细胞的增殖和迁移 |
| 4.3.2 活化的STAT3参与动脉损伤修复过程 |
| 4.3.3 STAT3 的激活是WDR1介导的平滑肌细胞的增殖和迁移所必需 |
| 4.3.4 WDR1促进平滑肌细胞的增殖和迁移需要ADF/Cofilin介导的肌动蛋白动力学的参与 |
| 4.3.5 STAT3直接结合Wdr1的启动子调节其转录活性 |
| 4.3.6 体内抑制JAK2/STAT3途径可降低Wdr1的表达和新内膜形成 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 Wdr1的缺失抑制STAT3的核转移 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 HAVSMCs中Wdr1的缺失不影响STAT3 的表达和活化 |
| 5.3.2 WDR1介导pSTAT3的核转移 |
| 5.3.3 WDR1通过调控Importinβ的表达和Ran的核质分布来影响p STAT3 的核 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 研究结论 |
| 6.2 研究内容的创新与应用 |
| 6.3 本研究中的不足以及下一步的工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 附录2 攻读博士学位期间参加的科研项目 |
| 致谢 |
（2）阿苯达唑在血管再狭窄中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 血管再狭窄模型的构建 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 4. 统计学处理 |
| 结果 |
| 1. 建立小鼠股动脉狭窄模型 |
| 2. 小鼠体重变化 |
| 3. 血管周套囊性狭窄小鼠模型中血流改变和管壁重塑 |
| 讨论 |
| 第二部分 阿苯达唑对VSMCs体外生物学功能的影响及其作用机制 |
| 材料与方法 |
| 1. 细胞 |
| 2. 材料 |
| 3. 方法 |
| 结果 |
| 1. 体外用药浓度确定 |
| 2. ABZ抑制VSMCs的增殖和迁移 |
| 3. ABZ对ECs增殖和迁移的作用 |
| 4. ABZ通过调节MLC和MYPT磷酸化抑制F-actin分解,从而抑制细胞迁移. |
| 讨论 |
| 第三部分 阿苯达唑对小鼠血管再狭窄的影响 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 结果 |
| 1. ABZ治疗后股动脉血流的变化 |
| 2. ABZ在再狭窄小鼠模型中抑制新生内膜的增生 |
| 3. ABZ在对组织抗原表达的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 预防动脉支架内再狭窄药物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文及基金参与情况 |
| 致谢 |
（3）基于CaN/NFAT信号途径探讨血府逐瘀汤治疗血管损伤后内皮增生的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 一、中医学对冠心病介入术后再狭窄的认识 |
| 二、现代医学对冠心病介入术后再狭窄的认识 |
| 三、血府逐瘀汤治疗心血管疾病药理机制的研究进展 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路对人脐静脉内皮细胞损伤后的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 血府逐瘀汤通过CaN/NFAT信号通路调控大鼠颈总动脉球囊损伤术后血管内膜增生的体内实验研究 |
| 实验一 血府逐瘀汤对球囊损伤大鼠颈总动脉病理形态及MCP-1 的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 实验二 血府逐瘀汤对球囊损伤大鼠颈总动脉CaN/NFAT信号通路干预作用的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 不足和展望 |
| 参考文献 |
（4）木犀草素通过转化生长因子β受体1抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移及血管内膜增生的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 木犀草素对血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响及作用机制研究 |
| 1.1 木犀草素对血管平滑肌细胞增殖及迁移的影响 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.3 结果 |
| 1.1.4 讨论 |
| 1.2 木犀草素对血管平滑肌细胞中TGFBR1信号通路激活的影响 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.2.3 结果 |
| 1.2.4 讨论 |
| 第二章 木犀草素与TGFBR1间的相互作用 |
| 2.1 分子对接及分子动力学模拟研究 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.2 表面等离子共振技术及TGFBR1体外酶活性研究 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 第三章 过表达TGFBR1,验证TGFBR1信号通路在木犀草素抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移中的作用 |
| 3.1 过表达TGFBR1后,木犀草素对TGFBR1信号通路激活的影响 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 结果 |
| 3.1.4 讨论 |
| 3.2 过表达TGFBR1后,木犀草素对血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 结果 |
| 3.2.4 讨论 |
| 第四章 木犀草素对血管内膜增生的影响及机制研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 过表达TGFBR1,验证TGFBR1在木犀草素抑制血管内膜增生中的作用 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 缩写词表 |
| 成果 |
| 致谢 |
（5）3D打印可降解外支架对移植静脉内膜增生的抑制作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语索引 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 3D打印可降解静脉外支架的制备及材料表征 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 不同直径外支架对移植静脉内膜增生的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 静脉外支架抑制内膜增生的机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 3D打印PCL外支架的拓展应用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 已发表学术论文 |
（6）黄芪甲苷通过PI3K/Akt/mTOR通路抑制大鼠颈总动脉球囊损伤后血管内膜增生（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（7）pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 第一章 pH和 ROS双响应性纳米粒的构建及其表征 |
| 1.1 pH响应性和ROS响应性β-环糊精载体材料的合成及其理化性质表征 |
| 1.2 pH和 ROS双响应性纳米粒的构建及其表征 |
| 1.3 pH和 ROS双响应性纳米药物的体外水解及药物释放 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 本章小结 |
| 第二章 pH和 ROS双响应性纳米药物的体外生物学功能评价 |
| 2.1 SD大鼠主动脉VSMCs对纳米粒的吞噬作用研究 |
| 2.2 双响应性载RAP纳米粒对SD大鼠VSMCs增殖和迁移的影响 |
| 2.3 双响应性载RAP纳米粒对PDGF-BB诱导大鼠的VSMCs相关蛋白表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 pH和 ROS双响应性纳米药物在SD大鼠颈动脉球囊损伤部位的靶向能力及抑制血管新生内膜增生的疗效评价 |
| 3.1 SD大鼠颈动脉球囊损伤模型的建立 |
| 3.2 p H和 ROS双响应性纳米粒对大鼠颈动脉内皮损伤部位的靶向能力评价 |
| 3.3 pH和 ROS双响应性载RAP纳米粒对SD大鼠颈动脉球囊损伤部位炎症及氧化应激水平的影响 |
| 3.4 pH和 ROS双响应性载RAP纳米药物在SD大鼠颈动脉球囊损伤模型中抑制血管新生内膜增生的疗效观察 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 pH和 ROS双响应性靶向纳米药物的构建、靶向性及其防治PTA术后再狭窄的疗效 |
| 4.1 pH和 ROS双响应性靶向纳米药物的构建及表征 |
| 4.2 pH和 ROS双响应性靶向纳米粒对SD大鼠颈动脉内皮损伤部位的靶向研究 |
| 4.3 pH和 ROS双响应性靶向纳米药物在SD大鼠颈动脉PTA术后血管再狭窄防治中的疗效评价 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 pH和 ROS双响应性载RAP纳米药物的初步安全性评价 |
| 5.1 pH和 ROS双响应性空白纳米粒的急性毒性评价 |
| 5.2 pH和 ROS双响应性纳米药物的长期毒性评价 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 纳米药物递送系统在血管再狭窄防治中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）黄芪当归配伍对大鼠血管内膜增生VSMC增殖的影响及PI3K/Akt信号途径机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文索引 |
| 前言 |
| 第一部分 黄芪-当归不同配伍比例对大鼠血管内膜增生影响的形态学研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要药物 |
| 1.4 试剂 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 药物制备 |
| 2.2 分组及造模 |
| 2.3 血管内膜增生指标测定 |
| 3.统计学分析 |
| 4.结果 |
| 5.讨论 |
| 6.结论 |
| 第二部分 黄芪-当归配伍对大鼠增生血管内膜VSMC增殖影响机制的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 药物制备 |
| 2.2 分组及造模 |
| 2.3 VSMCs表型转化和增殖活性测定 |
| 2.4 以western blot测定受损血管局部细胞周期相关蛋白cyclinD1、cyclinE表达 |
| 2.5 以western blot测定受损血管局部细胞增殖相关信号通路蛋白Akt、p-Akt、PI3k、p-PI3K的表达 |
| 2.6 用SPSS17.0 软件进行统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 黄芪-当归不同剂量配伍对血管增生内膜SMα -actin表达的影响 |
| 3.2 黄芪-当归不同剂量配伍对血管增生内膜中PCNA表达的影响 |
| 3.3 黄芪-当归不同剂量配伍对血管细胞周期相关蛋白cyclinD1、cyclinE表达的影响 |
| 3.4 黄芪-当归不同剂量配伍对受损血管Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（9）生物可吸收PLLA血管内支架对内膜修复和血管重构的影响及其机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景与研究意义 |
| 1.2 生物可吸收PLLA支架的研究现状与问题 |
| 1.2.1 PLLA血管内支架发展如日中天 |
| 1.2.2 PLLA血管内支架仍是未来的发展趋势 |
| 1.2.3 PLLA血管内支架的降解与血管修复 |
| 1.2.4 PLLA血管内支架植入后的力学变化 |
| 1.3 血管内支架植入后血管细胞表型转化及钙化 |
| 1.3.1 血管内支架植入对血管细胞表型的影响 |
| 1.3.2 血管内支架植入后的胞外基质变化 |
| 1.3.3 支架植入与血管钙化 |
| 1.4 本文的研究内容、研究意义和创新点 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 1.4.3 研究意义 |
| 1.4.4 研究创新点 |
| 2 PLLA血管内支架植入后的再内皮化与内皮功能恢复 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料、试剂与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 大鼠腹主动脉支架植入 |
| 2.3.2 实验样品处理 |
| 2.3.3 Evans Blue染色观察新生内膜通透性与完整性 |
| 2.3.4 En face免疫荧光观察新生内膜连接与完整性 |
| 2.3.5 扫描电镜观察新生内膜修复情况 |
| 2.3.6 石蜡切片的免疫荧光染色 |
| 2.3.7 石蜡切片的CD31 免疫组化染色 |
| 2.3.8 石蜡切片的CD68/CD11b免疫荧光染色 |
| 2.3.9 统计学分析 |
| 2.4 结果分析 |
| 2.4.1 植入一般情况 |
| 2.4.2 PLLA支架植入后的再内皮化 |
| 2.4.3 PLLA支架植入后内皮屏障功能的修复 |
| 2.4.4 PLLA支架植入后新生内膜有H型趋势 |
| 2.4.5 PLLA支架植入后的血管炎症反应 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 3 PLLA血管内支架植入后时间依赖的内膜增生与血管修复重建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料、试剂与仪器 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 OCT观察植入段血管直径和内膜增生 |
| 3.3.2 石蜡切片的HE染色、MASSON染色、EVG染色和天狼星红染色 |
| 3.3.3 石蜡切片的α-SMA免疫组化染色 |
| 3.3.4 图像分析 |
| 3.3.5 统计学分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 PLLA支架植入后血管直径变化与内膜增生的OCT分析 |
| 3.4.2 PLLA植入内膜增生和再狭窄率随时间变化先增加后减少 |
| 3.4.3 PLLA支架植入的血管修复过程胶原纤维与弹性纤维变化 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 4 PLLA血管内支架在体降解过程与伴随的血管细胞表型变化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料、试剂与仪器 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 PLLA支架植入后支架丝的OCT观察 |
| 4.3.2 PLLA支架植入后支架丝降解的HE染色观察 |
| 4.3.3 PLLA支架植入48 周分段切片与染色 |
| 4.3.4 PLLA支架植入后的MGF/BMP2 免疫荧光染色 |
| 4.3.5 PLLA支架植入后的SM-MHC/vimentin免疫荧光染色 |
| 4.3.6 PLLA支架植入后的CD31/RUNX2 免疫荧光染色 |
| 4.3.7 PLLA支架植入后的α-SMA/RUNX2 免疫荧光染色 |
| 4.3.8 血管vonkossa染色 |
| 4.3.9 图像分析 |
| 4.4 结果分析 |
| 4.4.1 PLLA支架的植入后在体降解 |
| 4.4.2 支架植入晚期的不均匀降解导致血管修复的差异 |
| 4.4.3 PLLA支架降解过程的血管力学响应 |
| 4.4.4 PLLA支架降解过程的血管细胞表型变化 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 5 PLLA降解产物乳酸促进血管平滑肌细胞发生成骨表型转化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料、试剂与仪器 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验仪器 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 SD大鼠胸主动脉原代平滑肌细胞的提取 |
| 5.3.2 RASMCs的纯化、鉴定、传代培养: |
| 5.3.3 不同浓度乳酸处理RASMCs后细胞活力的测定 |
| 5.3.4 β-甘油磷酸诱导RASMCs成骨转化 |
| 5.3.5 细胞总蛋白的提取及SM22α免疫印迹 |
| 5.3.6 细胞茜素红S染色 |
| 5.3.7 细胞碱性磷酸酶染色与测定 |
| 5.3.8 细胞凋亡检测 |
| 5.3.9 不同硬度PDMS胶制备并联合LA培养细胞 |
| 5.3.10 LA处理细胞后的免疫荧光染色 |
| 5.3.11 LA处理细胞后的溶酶体、线粒体活细胞染色 |
| 5.3.12 验证LA对细胞表型影响的在体动物实验 |
| 5.3.13 统计学分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 一定浓度LA对RASMCs生长的影响 |
| 5.4.2 乳酸促进RASMCs对力学的响应 |
| 5.4.3 乳酸促进细胞成骨转化 |
| 5.4.4 乳酸促进细胞成骨表型转化的可能机制 |
| 5.5 小结与讨论 |
| 6 主要结论及后续工作建议 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 后续工作建议 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A 作者在攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| B 作者在攻读博士学位期间参与的科研课题 |
| C 学位论文数据集 |
| 致谢 |
（10）薯蓣皂苷抑制血管平滑肌细胞增殖迁移及内膜新生的实验研究及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状和成果 |
| 研究目的和方法 |
| 仪器设备 |
| 试剂与耗材 |
| 一、薯蓣皂苷对大鼠颈动脉损伤后平滑肌细胞增殖以及内膜新生的作用研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 试剂配制 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.4 数据处理及统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 薯蓣皂苷对大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生的作用 |
| 1.2.2 薯蓣皂苷对体内血管平滑肌细胞增殖的作用 |
| 1.2.3 薯蓣皂苷对体内再内皮化的作用 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、薯蓣皂苷对体外培养的大鼠平滑肌细胞增殖迁移及表型转换的作用研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 试剂配制 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 数据处理及统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 原代大鼠血管平滑肌细胞培养 |
| 2.2.2 薯蓣皂苷对大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用 |
| 2.2.3 薯蓣皂苷对大鼠血管平滑肌细胞迁移的作用 |
| 2.2.4 薯蓣皂苷对大鼠血管平滑肌细胞表型转换的作用 |
| 2.2.5 薯蓣皂苷对体外内皮细胞增殖迁移的作用 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、薯蓣皂苷抑制血管平滑肌细胞增殖迁移的作用机制研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 试剂配制 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 数据处理及统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 薯蓣皂苷对大鼠血管平滑肌细胞中ERK1/2 活化的作用 |
| 3.2.2 FoxM1 在血管平滑肌细胞增殖迁移中的作用 |
| 3.2.3 薯蓣皂苷对大鼠血管平滑肌细胞中FoxM1 表达的作用 |
| 3.2.4 薯蓣皂苷对FoxM1 下游靶基因表达的作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 PCI术后再狭窄的发生机制及薯蓣皂苷对其防治作用的药理学基础 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、Influence of Stent Implantation on the Expression of PCNA and Apoptosis in Injured Vascular Smooth Muscle Cells（论文参考文献）
- [1]WDR1在血管平滑肌细胞中参与血管损伤后重构过程的作用研究[D]. 胡继盛. 武汉科技大学, 2021(12)
- [2]阿苯达唑在血管再狭窄中的作用机制研究[D]. 路芳芳. 苏州大学, 2020(02)
- [3]基于CaN/NFAT信号途径探讨血府逐瘀汤治疗血管损伤后内皮增生的作用机制研究[D]. 陈乙菲. 长春中医药大学, 2020(08)
- [4]木犀草素通过转化生长因子β受体1抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移及血管内膜增生的作用研究[D]. 吴玉婷. 南方医科大学, 2020(01)
- [5]3D打印可降解外支架对移植静脉内膜增生的抑制作用及机制研究[D]. 杨骐. 上海交通大学, 2020(01)
- [6]黄芪甲苷通过PI3K/Akt/mTOR通路抑制大鼠颈总动脉球囊损伤后血管内膜增生[D]. 李友乾. 济宁医学院, 2020(01)
- [7]pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究[D]. 张润军. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [8]黄芪当归配伍对大鼠血管内膜增生VSMC增殖的影响及PI3K/Akt信号途径机制的研究[D]. 阎卉芳. 湖南中医药大学, 2019(02)
- [9]生物可吸收PLLA血管内支架对内膜修复和血管重构的影响及其机理研究[D]. 杜若林. 重庆大学, 2019(01)
- [10]薯蓣皂苷抑制血管平滑肌细胞增殖迁移及内膜新生的实验研究及机制[D]. 樊天斐. 天津医科大学, 2019(02)