一、禽脑脊髓炎病毒引起SPF雏鸡淋巴细胞和神经细胞凋亡的研究（论文文献综述）
王文彬[1]（2019）在《鸡CARD11蛋白对新城疫病毒的抑制作用》文中进行了进一步梳理新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的一种严重危害禽类健康的高度接触性传染病。NDV作为一种嗜神经病毒能够导致禽类病毒性脑炎及神经紊乱,表现为头震颤、扭颈、翅爪瘫痪的临床症状及脑部血管充血、胶质细胞聚集、血管周围淋巴细胞侵润（血管套）等病理变化,其神经致病机制至今未明。本实验室前期通过基因芯片技术对NDV感染鸡脑部的差异表达基因（DEGs）进行了初步分析。本研究以基因芯片数据为基础,筛选到宿主免疫相关基因CARD11呈现上调表达,而该基因在已有的NDV感染的禽类其他组织及细胞的转录组数据中未发现差异表达。实验发现CARD11具有脑部特异性上调表达的特性,并能有效抑制NDV复制和病毒引起的细胞病理变化（CPEs）。本研究旨在解析宿主因子CARD11抑制病毒的作用机制,为揭示NDV与宿主的相互作用及其神经致病机制提供有价值的线索。具体研究内容及结果包括以下几个方面。1.鸡原代神经元细胞中CARD11对NDV复制的影响NDV强毒株F48E9可以造成在鸡原代神经元细胞（chPNCs）严重的CPEs,如轻微合胞体形成、轴突断裂、胞体分离、细胞迅速死亡,而弱毒株LaSota不能引起明显的CPEs;强弱毒株均可以在chPNCs中复制。将本实验室前期获得的NDV感染鸡脑的基因芯片数据以变化倍数大于2（FC>2）及P<0.05为标准,统计分析出强毒株F48E9感染鸡脑后特有的14个免疫相关的DEGs,qPCR验证5个DEGs的表达变化与基因芯片结果一致;在强毒株F48E9感染鸡体的13个组织中,只有CARD11在脑组织中特异性上调表达;由于CARD11蛋白在chPNCs中表达量很低,通过免疫沉淀富集（IPE）方法检测证实强毒株F48E9感染的chPNCs中CARD11蛋白同样上调表达;利用重组腺病毒实现CARD11在chPNCs中超表达,发现可抑制NDV的复制,CARD11在chPNCs中敲低后,可增加病毒的复制。结果表明CARD11能够抑制NDV在chPNCs中的复制。2.鸡原代神经元细胞中CARD11抑制NDV复制的机制CARD11激活后招募Bcl10和MALT1分子共同形成CBM信号体,继而MALT1激活下游NF-κB、JNK、mTOR信号通路。采用MALT1及NF-κB抑制剂阻断信号通路,发现NDV的复制没有变化,表明CARD11并非通过CBM信号体抑制NDV复制。那么,CARD11与病毒蛋白是否存在直接相互作用而影响病毒的复制?我们发现CARD11与NDV的P蛋白能够免疫共沉淀,且CARD11的CC1结构域与P蛋白的X结构域相互结合;进一步研究发现P蛋白X结构域也介导病毒RNP复合体中L蛋白与P蛋白的结合,而P蛋白X结构域不能介导P与NP蛋白的结合作用,故CARD11、L蛋白与P蛋白的共同结合过程中存在竞争关系;采用微型基因组（Minigenome）系统证实,该竞争性结合作用导致病毒RNA聚合酶活性受到抑制,进而降低了病毒的复制;通过对雏鸡脑内注射超表达CARD11蛋白的重组腺病毒,强毒株F48E9攻毒后发现CARD11能够减缓脑部的病理变化及抑制病毒在脑内的复制。3.鸡胚成纤维细胞中CARD11对NDV膜融合活性的影响CARD11在鸡体各组织中均有表达,那么,CARD11在鸡成纤维细胞中是否也能够被NDV诱导表达并抑制病毒复制?本部分研究以鸡胚成纤维细胞（DF-1）为模型,NDV强弱毒株的感染对DF-1细胞中CARD11 mRNA及蛋白水平的诱导上调表达不显着;DF-1细胞中CARD11可以与病毒P蛋白共定位于细胞核周围;通过慢病毒技术建立CARD11超表达及干扰的DF-1细胞系,发现CARD11能够抑制NDV的复制及合胞体的形成,甚至可抑制HN和F蛋白共转染引起的膜融合活性。CARD11如何抑制NDV诱导的膜融合活性?CARD11抑制furin蛋白酶的表达受到,进而影响F蛋白的裂解效率;利用MALT1及NF-κB抑制剂阻断信号通路,发现病毒的膜融合活性增强,细胞内furin蛋白酶的表达增加。结果表明CARD11通过激活CBM-NF-κB信号通路来抑制病毒的细胞膜融合活性。4.其他禽嗜神经病毒诱导CARD11脑特异性的上调表达禽嗜神经病毒除NDV之外还包括禽脑脊髓炎病毒（AEV）等,是否嗜神经病毒诱导CARD11脑特异性上调表达具有普遍性?本部分以嗜神经病毒AEV毒株XY/Q?1410及非神经嗜性病毒IBV分离株H09和FAdV-4分离株SXD15进行感染实验,发现CARD11只在嗜神经病毒NDV及AEV感染的鸡大脑和小脑中上调表达,而在IBV、FAdV-4感染的各组织中均为下调,并且各组织中CARD11的表达变化与各病毒载量没有必然联系。结果初步表明CARD11可以作为潜在的禽病毒性脑炎的标记分子。综上所述,本研究首次发现宿主因子CARD11可有效地抑制NDV复制和CPEs形成,其对NDV的抑制作用可能存在两种机制:（1）在神经细胞中,主要通过CARD11与病毒L蛋白竞争性结合病毒P蛋白抑制病毒RNA聚合酶活性,进而抑制病毒的复制;（2）在成纤维细胞中,主要通过CARD11参与的CBM-NF-κB信号通路降低细胞furin蛋白酶的表达,从而降低F蛋白的裂解效率抑制病毒诱导的膜融合活性,而CARD11与病毒P蛋白的相互作用同时降低了病毒的复制。本研究进一步发现其它禽嗜神经病毒也可诱导CARD11的脑部特异性上调表达,初步预示CARD11可以作为嗜神经病毒致神经损伤的标记分子。本研究为探索嗜神经病毒与中枢神经系统之间的相互作用及潜在的抗病毒靶标提供了基础依据。
洪艳芬[2]（2018）在《传染性支气管炎弱毒活疫苗的初步培育与筛选》文中进行了进一步梳理鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）引起的一类急性、高度接触性呼吸道疾病,由于鸡传染性支气管炎病毒容易发生变异,导致新的血清型和基因型毒株不断出现,目前使用的商品化活疫苗如H120、H52、Ma5等Mass型疫苗株对我国主要流行毒株的保护效果并不是很理想,因此通过调查当地IBV流行株的进化情况,培育筛选弱毒活疫苗,对预防和控制IB的发生和流行具有重要意义。本研究自20162017年期间从广东省各地区采集的疑似病料中分离到16株IBV分离株,生物学特性研究表明经传代培养后,16株病毒株均可以引起鸡胚发生矮小化,出现“侏儒胚”等现象;对所分离毒株的S1基因进行序列测定,结果表明16株分离株的S1基因发生了较多的基因突变及氨基酸的替代和插入现象,经与国内外毒株对比分析表明,16株分离株中有1株分离株与国内流行株2992/02和J2等分离株处于同一基因群,有5株分离株与目前国内主要流行的LX4型处于同一基因群,有10株分离株形成一个独立的基因群,该基因群是国内新报道的IBV基因型。从10株新基因型的分离毒株中挑选1株具有代表性的毒株GDTS13进行全基因组测序,并对S1、M和N基因等IBV的主要结构基因进行遗传进化分析,结果表明GDTS13与国内外流行的主要参考毒株全基因组同源性为84.5%99.6%,其中与LX4型参考毒株同源性为87.6%,GDTS13 S1、M和N基因序列与LX4型参考毒株的同源性分别为68.0%、87.0%和86.5%。采用固定病毒浓度、稀释血清的方法进行鸡胚中和试验,结果显示5株疫苗株4/91、H120、M41、Holte和Conn46的血清抗体均不能中和GDTS13,说明GDTS13与5个疫苗株很可能不属于同一血清型。将GDTS13在SPF鸡胚上传代致弱,并进行不同代次毒株对SPF鸡的致病性试验,结果表明F40代毒株能引起50%的SPF鸡发病并引起相应症状和病变,F60代毒株能引起20%的SPF鸡发病并引起相应症状和病变,F80和F100代次的毒株不引起SPF雏鸡发病,无相应症状和病变;对GDTS13 F1、F20、F40、F60、F80和F100这6个代次毒株的S1基因进行核苷酸测序并分析,结果表明核苷酸序列有4个位点突变,对应氨基酸的序列则有3个残基突变;F80和F100代次病毒的核苷酸和氨基酸序列的同源性为100%,表明病毒经鸡胚多次传代后具有了较好的遗传稳定性。将GDTS13 F100代的病毒接种2日龄的SPF雏鸡并且连续传5代,通过观察临床症状、病变及测定EID50研究病毒毒力是否返强,结果表明GDTS13 F100代次的病毒在SPF鸡传5个代次,每个代次的试验鸡只均没有出现相关的IBV临床症状和病变,EID50在10-5.63-10-5.73之间变化不大,说明GDTS13 F100代次病毒遗传稳定,没有毒力返强的现象。将致弱的GDTS13 F100代次病毒采用滴鼻、点眼的方式接种2日龄的SPF雏鸡,剂量为103.5 EID50/只,14天后分别用同源强毒和异源强毒进行攻毒,攻毒的剂量为105 EID50,试验结果显示GDTS13 F100弱毒对强毒有超过90%的保护率,表明GDTS13F100代次弱毒可以作为新基因型IB的活疫苗候选毒株。本研究通过调查广东地区IBV的流行情况,了解当前IBV主要流行毒株的基因型及变化趋势,通过鸡胚传代致弱方法成功培育出新基因型IB的弱毒活疫苗候选毒株。
范莉莉[3]（2017）在《鹌鹑源禽脑脊髓炎病毒的分离鉴定及在体内分布的研究》文中进行了进一步梳理禽脑脊髓炎（Avian encephalomyelitis,AE）是由禽脑脊髓炎病毒（Avian encephalomyelitis virus,AEV）引起的一种主要侵害幼禽中枢神经系统的接触性传染病。AEV为无囊膜单股正链RNA病毒,属于小RNA病毒科,震颤病毒属。该病目前只能依靠疫苗免疫进行防控,因此,运用灵敏准确的方法测定AEV在鹌鹑体内的动态分布对于AE的致病性研究及其防治具有重要作用。本研究对鹌鹑源AEV进行分离鉴定,并运用荧光定量PCR技术和免疫组织化学试验检测AEV XY/Q-1410株口服感染1日龄鹌鹑后病毒在其体内的分布情况,结果如下:1.2014年10月采集陕西省咸阳市某鹌鹑养殖场AE疑似病料,经鸡胚传代、RT-PCR扩增、中和试验及动物回归试验对病原体进行分离鉴定。RT-PCR扩增结果显示,用AEV特异性引物成功扩增到大小为288 bp的目的片段,与参考株核苷酸序列相似性及推导的氨基酸序列相似性分别为84.9%99.3%和95.8%98.9%;遗传进化分析表明,分离株与SX株位于同一分支;中和试验结果显示,中和指数为102.32,大于50,为阳性;动物回归试验结果显示,攻毒组鹌鹑及雏鸡均出现典型的AE临床症状,攻毒组鹌鹑发病率55.1%,病死率100%,攻毒组雏鸡发病率60%,病死率58.3%,病理剖检发现患病动物的脑组织软化,脑半球轮廓变模糊,对照组未见异常。本研究成功分离到一株鹌鹑源AEV,命名为AEV XY/Q-1410株。2.标准曲线的建立。通过TIANLONG 988荧光定量PCR系统对10倍递比稀释的重组质粒标准品（102108 copies/μL）产生的循环数与扩增子对数浓度的线性回归分析得到标准曲线:曲线斜率为-3.325,相关系数（R2）为0.9978。检测限度为100拷贝。3.用荧光定量PCR技术测定AEV在鹌鹑体内的动态分布。运用荧光定量PCR技术测定AEV XY/Q-1410株接种鹌鹑后第3天17天（间隔1天）,18天25天（每天）,29天,30天,32天,36天48天（间隔1天）,49天,51天60天（每天）在鹌鹑大脑、小脑、腺胃、肠道、肝脏、胰腺、脾脏、法氏囊、肺脏、肾脏等器官中的病毒载量。结果显示,病毒在多数组织中可以持续感染长达60天。大脑和小脑中的病毒载量逐渐升高至第18天达到第一个峰值,第二个峰值分别出现在攻毒后第51天和46天。腺胃、肠道、脾脏和法氏囊中的病毒载量高于大脑和小脑。腺胃中的病毒载量从第3天至第46天呈“U”型,之后逐渐降低至第52天,之后保持稳定至第60天;肠道中的病毒载量从第3天至第46天呈“M”型,之后保持稳定至第60天;肝脏中病毒载量波动较剧烈,最大值出现在第52天;胰腺中的病毒载量通常低于100拷贝。脾脏中的病毒载量从第3天至第54天呈“W”型,之后缓慢下降至第60天;法氏囊中的病毒载量从第3天至第44天呈“U”型,然后下降至第49天,之后病毒载量小幅度波动至第60天。肺脏中的病毒载量整体呈两个“M”型相连。肾脏中的病毒载量仅在第7天出现一个峰值,从第15天至第60天保持轻微波动。4.用免疫组织化学试验检测AEV的组织分布。运用免疫组织化学试验来检测攻毒后第7天,18天,36天,54天和59天所采集的各组织器官中病毒粒子的分布并结合Image-Pro Plus软件来计算各时间点各组织器官中病毒蛋白相对表达量。结果显示,五个时间点所采集的组织器官中均有明显的棕黄色阳性染色,而阴性对照没有。将各组织器官中病毒蛋白相对表达量与病毒载量进行相关性分析,结果显示,二者呈正相关。综上所述,AEV XY/Q-1410株与SX株亲缘关系最近,而与L2Z株、YL株、1143株、Van Reokel株和Pf-CHK1/AEV株亲缘关系较远,表明AEV XY/Q-1410株与参考株相比,在遗传进化上存在一定差异。荧光定量PCR结果表明,AEV可持续感染长达60天,腺胃,肠道,脾脏和法氏囊中的病毒载量高于大脑和小脑。相关性分析结果表明,各组织器官中的病毒基因拷贝数与病毒蛋白相对表达量呈正相关。
李志军[4]（2016）在《禽脑脊髓炎病毒咸阳株的分离鉴定及其在雏鸡体内的组织分布研究》文中指出禽脑脊髓炎（avian encephalomyelitis,AE）是由禽脑脊髓炎病毒（avian encephalomyelitis virus,AEV）引起的,以幼禽头颈部快速震颤和共济失调等神经症状为主要特征的接触性传染病,成年鸡为亚临床症状,表现为一过性产蛋下降和种蛋孵化率降低。AEV是单股正链RNA病毒,属于小RNA病毒科,震颤病毒属成员。该病自1932年首次在美国发现以来,已经传播至全球多个国家和地区,给养禽业造成了巨大的经济损失。目前该病尚未有特定的治疗方法,只能依靠疫苗免疫进行预防控制。因此,研究AEV在雏鸡体内的组织分布对于AEV的致病机制研究有着重要意义。本研究对AEV咸阳株进行了分离鉴定,并运用荧光定量PCR和免疫组织化学方法测定了AEV XY13感染雏鸡后病毒在雏鸡体内的动态分布,获得以下结果:1.采集咸阳市某鸡场疑似AE感染雏鸡的脑组织进行病原的分离鉴定,经SPF鸡胚传代、免疫组织化学试验和动物回归试验,初步鉴定分离毒为禽脑脊髓炎病毒,并命名为AEV XY13。根据AEV 1143株VP1基因高度保守区设计特异性引物,经RT-PCR扩增,克隆至pMD19-T载体,转化DH 5α感受态细胞,然后进行序列测定,并与已知参考毒株进行遗传进化分析。结果表明,扩增的VP1目的片段长度为288 bp,编码96个氨基酸残基;AEV XY13与参考毒株的核苷酸同源性为74.6%99.7%,氨基酸同源性为76.0%97.9%;遗传进化分析结果表明,AEV XY13与SX株处于相同的分支;与1143、YL、L2Z株则同处于一个较大的分支上,亲缘关系较近,而与Van Roekel、NH-937和204C株则处于不同的分支上,亲缘关系较远;遗传进化距离估算结果表明,AEV XY13与1143、L2Z、SX和YL株的进化距离均小于0.011,而与NH-937、Van Roekel和204C株的进化距离则大于0.060。2.用荧光定量PCR测定AEV在雏鸡体内不同组织的病毒载量。将AEV病毒液以10倍梯度逐级递减稀释至10-7,卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚,12天后收胚,观察并记录每个稀释度的鸡胚病变情况,计算病毒EID50。55只1日龄SPF雏鸡随机分成两组,试验组33只雏鸡每只口服接种105EID50病毒液,对照组22只雏鸡每只口服接种等量的PBS,观察并记录雏鸡生长状况。在接种后第2天、第4天、第6天、第7天、第8天、第10天、第12天、第15天、第18天、第22天和第24天随机选取试验组3只雏鸡和对照组2只雏鸡处死,采集脑、肝、肠、腺胃、法氏囊、脾和肾等组织器官,运用荧光定量PCR方法测定各器官内的病毒载量。结果表明,试验组雏鸡在攻毒后第6天,5只雏鸡开始出现AE临床症状,1只在发病后第2天死亡,攻毒后10天,发病雏鸡的神经症状逐步消失并恢复正常。病毒载量检测结果显示,病毒感染第2天就能在脑、肝脏、肠道、腺胃、法氏囊、脾和肾等被检器官中检测到病毒,且脑组织中的病毒载量最低;感染后6天,脑组织中病毒载量达到峰值,此时试验组部分雏鸡开始出现AE临床症状;肠道、腺胃等消化器官中的病毒载量在整个试验阶段基本保持平稳,而肝脏在感染前期逐步下降后到后期有所回升,表明AEV对胃肠道等消化器官具有较强的组织嗜性;法氏囊和脾脏等免疫器官中的病毒载量呈波动状态;肾脏中的病毒载量逐步下降。3.免疫组织化学试验检测病毒感染雏鸡第2天、第7天和第12天,脑、肝脏、肠道、腺胃、法氏囊、脾脏和肾脏等组织中病毒抗原在各器官中的定位,估算各组织中病毒抗原相对表达量,并分析第2天、第7天和第12天各组织中病毒载量与病毒蛋白相对表达量的相关性。结果显示,在病毒感染第2天、第7天和第12天各组织器官中均有大量的棕黄色阳性着色,表明在相应的组织中均有大量病毒定殖。相关性分析结果表明,病毒感染第2天、第7天和第12天各组织中的病毒蛋白相对表达量与病毒载量呈正相关。综上所述,AEV XY13株与SX、YL、1143和L2Z株的亲缘关系最近,而与NH-937、Van Roekel和204C株的亲缘关系较远,表明AEV XY13株与参考毒株相比,在遗传进化关系上存在一定的差异。组织器官中病毒载量测定结果表明,AEV对胃肠道等消化器官的组织嗜性较强,而对神经系统、免疫系统和泌尿系统等器官的嗜性则较弱。相关性分析结果表明,各器官中病毒蛋白相对表达量与病毒载量呈正相关,病毒载量与病毒蛋白抗原表达量呈对应关系,可以准确反映病毒的组织分布,为病毒的致病机理研究提供依据。
李俊平[5]（2015）在《禽网状内皮组织增生症病毒与A亚群白血病病毒共感染的致病性分析》文中研究说明近年来,我国鸡群中禽网状内皮组织增生症病毒（REV）和A亚群禽白血病病毒（ALV-A）的感染比较普遍,且存在共感染现象。禽源活疫苗中污染REV被认为是禽网状内皮组织增生症的主要传染源。本论文从鸡马立克氏病（MD）火鸡疱疹病毒活疫苗中分离到1株REV,完成了其全基因组序列测定与分析；建立了REV与ALV-A共感染试验模型,分析了共感染对鸡的致病性；成功构建了REV的感染性克隆,初步分析了碱基突变对病毒拯救的影响；建立了检测鸡MD活疫苗中污染REV的间接免疫荧光（IFA）方法,完善了禽源活疫苗中外源病毒检验的国家标准。从鸡MD火鸡疱疹病毒冻干活疫苗中分离到1株REV,命名为MD-2。对分离毒株的全基因组序列测定与分析表明,MD-2与美国野鸡源毒株APC-566、中国台湾鹅源毒株3410/06和中国东北鸡源分离毒株HLJR0901的亲缘关系最近,同源性高达99%以上,而与我国南方分离毒株HA9901同源性为96.7%,与美国鸭源毒株SNV同源性相对最低,为93.5%。用REV、ALV-A进行了1日龄SPF鸡的单感染和共感染试验,分析了REV和ALV-A共感染的致病性。结果表明,REV和ALV-A共感染对鸡呈现出明显的协同致病作用,表现为共感染组鸡的病死率较高,体重下降,CD4+/CD8+T淋巴细胞比值、法氏囊比重和胸腺比重显着降低。在常规免疫、活疫苗或灭活疫苗免疫状态下,低日龄（1日龄）和高日龄（10日龄）感染均会引起免疫鸡的体重下降和一定的死淘率,其中共感染造成的影响更加严重。常规免疫下,共感染组会引起低日龄感染鸡胸腺比重和法氏囊比重显着下降,各种感染组对外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞比例影响均不显着,但共感染组CD4+/CD8+比值一直低于其他各组,具有一定的规律性,表现出抑制体液免疫的趋势。灭活疫苗免疫下,共感染和REV单感染引起新城疫（ND）血凝抑制（HI）抗体效价、H5亚型禽流感HI抗体效价和H9亚型禽流感HI抗体效价显着下降,其中共感染组下降幅度更大,此外,共感染和REV单感染还均引起传染性法氏囊病（IBD）抗体阳性率降低。活疫苗免疫下,ND首免后共感染和REV单感染组的HI抗体效价均显着高于ALV-A单感染组和对照组,加强免疫后又低于后两组。总体而言,REV感染对灭活疫苗免疫造成的免疫抑制作用强于对活疫苗免疫造成的抑制,ALV-A单感染引起的免疫抑制作用较弱。此外,试验还表明,REV感染未发生垂直传播,而ALV-A能够引起严重的垂直传播。ALV-A单感染与共感染组到达产蛋日龄时（131日龄）,ALV-A抗体阳性率分别为31%和48%,子代9日龄鸡胚ALV-A分离阳性率分别为57.9%（11/19）和20%（3/15）,7日龄雏鸡ALV-A分离阳性率分别为66.7%（6/9）和36.4%（4/11）。随着日龄的增大,鸡对ALV-A耐受感染迅速下降,10日龄鸡单感染或共感染ALV-A后,ALV-A抗体阳性率达80%以上。各感染组对血清中9种细胞因子浓度和外周血淋巴细胞中7种Toll样受体mRNA转录水平总体影响不明显,无明显规律性。构建了REV MD-2的感染性克隆,拯救病毒的生长特性与亲本毒一致,且遗传标记能够稳定遗传。并通过定点突变技术对env基因中5个碱基进行了分别突变,发现第1433位碱基由T突变为G,导致env前蛋白第478位氨基酸由异亮氨酸突变为精氨酸,为致死性突变。建立了鸡MD活疫苗中污染REV的IFA检测方法。该方法对Ⅰ型MD活疫苗、MD火鸡疱疹病毒活疫苗和MD二价活疫苗的最低检出量分别为每500羽份疫苗中污染5、10和15TCID50的REV。综上结果,本研究揭示了REV和ALV-A共感染对鸡的协同致病作用,为养禽生产中重视其共感染的控制提供了科学依据。
刘青天[6]（2014）在《禽脑脊髓炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用》文中认为禽脑脊髓炎（avianencephalomyelitis，AE）首次在1932年被描述为一种侵害雏鸡的一种病毒性传染病。此后，已波及世界大多数国家，该病的特征是雏鸡表现为头和颈部的快速震颤和运动共济失调；产蛋鸡被该病毒感染后表现为一过性产蛋下降，不表现出神经症状，给养禽业尤其是种禽养殖业造成了较大的经济损失。目前传统的禽脑脊髓炎病毒（avianencephalomyelitisvirus，AEV）的检测方法存在费时费力、特异性差、容易被污染等缺点。因此，建立一种针对AEV的特异、敏感、可靠的检测方法势在必行。本研究旨在建立一种基于SYBRGreenI的AEV荧光定量RT-PCR检测方法，为AE高效检测及准确定量提供一种可靠的新方法。结果如下：根据GeneBank中AEV1143株基因序列，在高度保守的VP1基因序列区域设计一对荧光定量用特异性引物，用RT-PCR的方法扩增出AEVSX株VP1基因的部分序列（288bp），用常规方法对目的片段进行克隆并进行双酶切鉴定，测定重组质粒的浓度并通过测序比对进行鉴定，重组质粒的序列与AEVSX株的VP1基因序列100%匹配，质粒浓度为126ng/μL，OD260/OD280为1.92，将质粒模板标准品按10倍梯度稀释，进行荧光定量PCR扩增，通过对反应条件优化后，建立了针对AEV的标准曲线：y=-3.5714x+36.754，扩增效率为0.913，线性相关系数为0.9977，并对建立的方法进行特异性、重复性以及敏感性验证，结果表明该方法特异性强，灵敏度高，重现性好，检测极限为10拷贝/μL，敏感性是传统RT-PCR检测方法的100倍，可对AEV进行准确定性及定量分析。用AEV1143株接种7日龄SPF鸡胚，分别在3天和5天后剖检鸡胚，收集尿囊液，研磨脑和肝脏组织。用本实验建立的方法从接种3天后的SPF鸡胚中可检测出阳性样品，而普通RT-PCR方法需要在5天后才能检测出AEV。分别用建立的荧光定量RT-PCR方法和普通RT-PCR方法对18份临床样品进行检测并设置阴性对照，普通RT-PCR只检测出5份阳性样品，阳性率为28%，而本研究建立的方法检测出18份阳性样品，阳性率为100%，将13份检测结果不一致的脑组织病料用鸡胚盲传2代后，用建立的方法和普通RT-PCR进行检测，结果仍然是阳性结果。综上所述，本研究建立了一种针对AEV的高敏感、高特异、重复性好的SYBRGreenI荧光定量RT-PCR检测方法，可为AEV的检测提供有效的手段。
李凯善[7]（2012）在《禽脑脊髓炎病毒YBF02毒株的毒力测定与种子批建立》文中认为禽脑脊髓炎（Avian Encephalomyelitis;AE）又称流行性震颤（Epidemictremor），是由禽脑脊髓炎病毒（AEV）引起的一种主要危害4周龄以下雏鸡，以侵害雏鸡中枢神经系统引起雏鸡非化脓性脑炎为主要病理特征的病毒性传染病，病雏主要表现为运动失调、头颈震颤和后趾麻痹等神经症状。具有突然出现和难以预测持续期等特点，能造成雏鸡的损失和母鸡产蛋率的下降，成为当前世界上危害养禽业发展的主要疫病之一。目前该病尚无有效的药物治疗，预防主要靠疫苗。灭活疫苗的免疫抗体产生较晚，免疫期较短，成本较高，使用不方便等，限制了该苗的推广应用。而弱毒疫苗可以用饮水的方式来免疫种鸡群，使其子代雏鸡通过母源抗体而获得被动免疫，方便高效，在很多国家得到了广泛的应用。目前国内还没有弱毒疫苗研制成功的报道。本研究用青岛易邦生物工程有限公司提供的禽脑脊髓炎病毒（AEV-YBF02株）进行毒力测定和活疫苗种子批的建立。主要研究内容及结果如下：（1）AEV-YBF02毒株毒力测定：毒力测定试验结果显示，病毒的EID50为10—5.7/0.2mL。AEV-YBF02毒株卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚，接种后第10日观察，鸡胚不产生明显的病变。脑内接种1日龄SPF雏鸡，在第10日才开始发病，而各强毒株都在第5日左右发病。表明AEV-YBF02是一株毒力较弱的毒株。（2）禽脑脊髓炎弱毒疫苗种子批的建立：将AEV-YBF02毒株在SPF雏鸡脑内连续传12代，再用SPF鸡胚卵黄囊接种连传6代。取每代病毒测EID50和病毒的特异性试验，再分别作无菌、支原体和外源病毒的检验。结果显示：传代过程中病毒比较稳定，各代次病毒的EID50没有显着的变化，病毒能被AEV阳性血清特异性中和，且各代病毒纯净。（3）安全性试验和免疫效力试验：种子批建立以后，取2、5、10、15、18代毒种通过口服、肌肉、翅膀刺种接种1日龄、8～10周龄、180日龄的鸡时，只有口服1日龄的雏鸡会有10%左右的发病率，而其它途径接种不同日龄的鸡都不会引起临床症状。说明该毒株安全，致病力弱。对2、5、10、15、18代毒种进行免疫效力试验，用该毒口服免疫8～10周龄的鸡，免后21日抗体检测为全阳性，直至免后第12周抗体仍保持较高的水平。同时免后21日，用AEV-VR脑内接种攻毒，结果表明各代次毒种的免疫原性差异不显着，10只免疫鸡均保护9只以上，说明该毒免疫原性良好，且传代对各代毒种的免疫原性无显着影响。（4）毒力返强试验： AEV-YBF02株第12代基础种子毒通过口服的方法接种2周龄的SPF雏鸡，同居感染途径连传5代，取同居感染传代后分离的病毒，分别脑内接种1日龄SPF雏鸡、口服接种28日龄SPF鸡和180日龄的产蛋鸡。观察传代后的各代次毒对1、28日龄SPF鸡及产蛋鸡的致病性。结果表明，各代次的毒力基本相同，毒力没有返强，仍为非鸡胚适应毒。根据以上结果显示，AEV-YBF02符合弱毒苗的要求，建立的种子批性稳定安全，免疫原性好，且没有毒力返强现象，可以作活疫苗的种子批。
张艳艳[8]（2005）在《禽脑脊髓炎病毒的鉴定与弱毒疫苗的研制》文中提出禽脑脊髓炎（Avian Encephalomyelitis; AE）又称流行性震颤（Epidemictremor）,是由禽脑脊髓炎病毒（AEV）引起的一种主要危害4 周龄以下雏鸡,以侵害中枢神经系统引起非化脓性脑炎为主要病理特征的病毒性传染病。具有突然出现和难以预测持续期等特点,能造成雏鸡的损失和母鸡产蛋率的下降,给养鸡业带来一定的威胁,成为当前世界上危害养禽业发展的主要疫病之一。目前该病尚无有效的药物治疗,预防主要靠疫苗。灭活苗的免疫抗体产生较晚,免疫期较短,成本较高,使用不方便等,限制了该苗的推广应用。而弱毒疫苗可以饮水的方式来免疫鸡群,使其子代雏鸡通过母源抗体而获得被动免疫,方便高效,在很多国家得到了广泛的应用。目前国内还没有弱毒疫苗研制成功的报道,所需弱毒疫苗都依靠进口。因此国内研制出自己的弱毒疫苗,不但可以有效控制禽脑脊髓炎的发生,还能为国家节省外汇开支,具有很大的经济效益。本实验在鉴定了自国内分离的禽脑脊髓炎病毒的基础上,对该毒株的毒力进行了测定,证明其为弱毒株,并试制了一批弱毒活疫苗。论文主要分为以下三个方面: 第一部分为AEV-HD 毒株的病毒鉴定:从病毒的理化性质、血凝性质和形态大小上进行了常规鉴定,结果表明AEV-HD 性质稳定,不受胰酶、乙醚、氯仿、温度（57℃、1 h）影响,无血凝性。电镜下观察病毒为不正圆形,大小基本一致,直径在2530 nm。根据发表的AEV 基因序列设计了一对引物,对AEV-HD 进行了RT-PCR 鉴定,结果扩增出了900bp 目的片段。证明AEV-HD 为AEV 毒株。第二部分为AEV-HD 的病毒特异性和毒力的检测:将AEV-HD 与AEV阳性血清混合,37 ℃作用1 h后经卵黄囊接种6 日龄SPF 鸡胚,并设AEV-HD 病毒接种组对照。结果中和组鸡胚出壳后雏鸡发病率为10%,而病毒组发病率为75%,表明AEV-HD 能被AEV 阳性血清中和,病毒特异性良好。AEV-HD 接种6 日龄SPF 鸡胚后不引起明显的鸡胚病变,鸡胚平均脑系数为4.65%,接近正常鸡胚（4.67%）,而AEV-VR 强毒接种的鸡胚病变明显,平均脑系数为3.67%;脑内接种1 日龄SPF 雏鸡在第10 日才发病,而各强毒株都在第5 天左右发病。表明AEV-HD 是一株毒力较弱的毒株。第三部分为AEV-HD 弱毒疫苗的研制:根据中华人民共和国兽用生物制品质量标准
唐波[9]（2005）在《单克隆抗体介导的禽脑脊髓炎病毒检测方法的建立及其结构蛋白VP3的初步研究》文中进行了进一步梳理禽脑脊髓炎（Avian encephalomyelitis,AE）是由禽脑脊髓炎病毒（AEV）引起的以侵害幼禽中枢神经系统为主要特征的传染病,鸡、火鸡、野鸡、鹌鹑均可感染本病,其临床疾病特征为病禽共济失调、震颤和非化脓性脑脊髓炎。该病现已遍及世界大多数国家。我国1980年以来,先后在广东、江苏、辽宁、黑龙江、河北、内蒙古、福建、上海等省市区发生。 禽脑脊髓炎病毒可以经粪口水平传播,也可以通过鸡胚垂直传播,因此用感染了禽脑脊髓炎病毒的鸡群所产的鸡胚生产疫苗,就有可能使疫苗污染该病毒。有两种经典的方法被推荐用来检测疫苗中的AEV,这两种方法涉及到将疫苗接种6日龄易感鸡胚或1日龄雏鸡,然后观察其症状和病变,因此都比较繁琐、耗时且耗财。目前多采用免疫学方法,如免疫荧光（FA）和酶联免疫吸附法（ELISA）来直接检测抗原。这些方法中,为了避免非特异性反应,使用了提纯或吸收的抗血清。单克隆抗体特异性强,被认为是鉴定病毒因子的可靠方法,已用于多种病毒感染的诊断。国外已有用AEV单克隆抗体（VR9-1株）建立免疫组化、间接免疫荧光和免疫过氧化物酶染色、抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶染色方法检测AEV抗原的成功报道,并用于AEV的定量研究,而国内相关报道较少,成功应用的更少。 为了建立特异性检测禽脑脊髓炎病毒的方法,本研究利用鸡胚扩增了禽脑脊髓炎病毒,并通过氯化铯密度梯度离心进行提纯,用纯化的病毒制备了抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体,建立了单克隆抗体介导的间接ELISA法、Dot-ELISA法、间接免疫荧光法以及免疫组织化学法等检测禽脑脊髓炎病毒的方法。 小RNA病毒科中,结构蛋白VP3被认为与病毒的持续感染、T细胞免疫以及与病毒受体的相互作用有关,近期研究还表明AEV的结构蛋白VP3能够诱导宿主细胞的凋亡。AEV虽然目前在分类上属于肠道病毒属,但研究表明AEV在小RNA病毒科中与甲肝病毒属亲缘性最近。甲型肝炎病毒的VP3及脊髓灰质炎病毒的
刘玉锋,佘锐萍,李慧姣,靳红,梁明珍,刘玉如,寸钢彪[10]（2005）在《IBDV超强毒株感染SPF鸡后法氏囊淋巴细胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白动态表达的研究》文中认为为证实传染性法氏囊炎超强毒SNJ93株感染SPF鸡后1～14 d内法氏囊淋巴细胞中Bcl-2、Bax蛋白的动态表达与淋巴细胞凋亡的关系。应用透射电镜观察、TUNEL法标记检测凋亡的淋巴细胞,用免疫组织化学方法检测Bcl-2、Bax蛋白。结果表明,感染后1～7 d可见到大量凋亡的淋巴细胞,其中感染后3～5 d最多。感染后1～9d Bcl-2蛋白显着高于同时点的对照组（P<0.01）;感染后1～5 d Bax蛋白明显高于同时点的对照组,差异极显着（P<0.01）;感染后第7天高于同时点的对照组,差异显着（P<0.05）; Bcl-2/Bax比率在感染后第1天低于同时点的对照组（P<0.05）;3～5 d明显低于同时点的对照组（P<0.01）。SNJ93感染SPF雏鸡后1～7 d内法氏囊淋巴细胞会发生大量凋亡,Bcl-2/Bax能准确反映淋巴细胞的凋亡程度。
二、禽脑脊髓炎病毒引起SPF雏鸡淋巴细胞和神经细胞凋亡的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、禽脑脊髓炎病毒引起SPF雏鸡淋巴细胞和神经细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
（1）鸡CARD11蛋白对新城疫病毒的抑制作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 新城疫病毒的研究进展 |
| 1.1.1 NDV概述 |
| 1.1.2 NDV结构及病毒的转录与复制 |
| 1.1.3 新城疫病毒致病性 |
| 1.2 CARD11 蛋白研究进展 |
| 1.2.1 CARD11 蛋白概述 |
| 1.2.2 CBM信号体通路 |
| 1.2.3 CARD11 蛋白与疾病 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 鸡原代神经元细胞中CARD11对NDV复制的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 SPF鸡胚、细胞、病毒、载体 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器及常用试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物、shRNA设计 |
| 2.2.2 RT-qPCR |
| 2.2.3 CARD11 相关表达载体的构建 |
| 2.2.4 CARD11 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.5 CARD11 免疫沉淀富集实验 |
| 2.2.6 重组腺病毒包装及纯化 |
| 2.2.7 病毒感染实验 |
| 2.2.8 细胞免疫荧光实验 |
| 2.2.9 数据统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 CARD11在NDV感染鸡脑中特异性显着上调表达 |
| 2.3.2 NDV在 chPNCs中的感染与复制 |
| 2.3.3 CARD11 真核表达载体的构建 |
| 2.3.4 CARD11 多克隆抗体的制备 |
| 2.3.5 NDV诱导chPNCs中 CARD11 的上调表达 |
| 2.3.6 chPNCs中实现外源蛋白表达的方法筛选 |
| 2.3.7 rAdVs的制备 |
| 2.3.8 rAdVs在 chPNCs中的感染效率 |
| 2.3.9 CARD11 抑制NDV的复制 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 鸡原代神经细胞中CARD11 抑制NDV复制机制的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 动物、细胞、病毒、质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器及常用试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 真核表达载体的构建 |
| 3.2.3 抑制剂处理实验 |
| 3.2.4 鸡NF-κB双萤光素报告基因检测系统的建立 |
| 3.2.5 病毒感染实验 |
| 3.2.6 免疫共沉淀实验 |
| 3.2.7 IFA实验 |
| 3.2.8 NDV微基因组检测 |
| 3.2.9 动物实验 |
| 3.2.10 数据统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 各真核表达载体的鉴定 |
| 3.3.2 CBM信号体对NDV复制的影响 |
| 3.3.3 chPNCs内源性CARD11与NDV蛋白相互作用 |
| 3.3.4 CARD11的CC1 结构域与NDV P蛋白的X结构域相互作用 |
| 3.3.5 NDV NP、L蛋白与P蛋白的相互作用 |
| 3.3.6 CARD11 蛋白与NDV L蛋白竞争性结合NDV P蛋白 |
| 3.3.7 CARD11 抑制病毒RNA聚合酶活性 |
| 3.3.8 脑内过表达CARD11对NDV在脑内复制的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 鸡胚成纤维细胞中CARD11对NDV膜融合活性的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、质粒、病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器及常用试剂配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 NDV感染实验 |
| 4.2.3 RT-qPCR |
| 4.2.4 重组慢病毒的获得 |
| 4.2.5 细胞系的建立 |
| 4.2.6 Western blot |
| 4.2.7 IFA实验 |
| 4.2.8 抑制剂处理实验 |
| 4.2.9 细胞凋亡检测 |
| 4.2.10 细胞膜融合活性的定性及定量分析 |
| 4.2.11 蚀斑实验 |
| 4.2.12 数据统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 F48E9 NP基因标准曲线的建立 |
| 4.3.2 NDV诱导DF-1中CARD11 的上调表达不显着 |
| 4.3.3 HN蛋白诱导DF-1 细胞中CARD11 的上调表达 |
| 4.3.4 DF-1 细胞中CARD11 抑制NDV的复制 |
| 4.3.5 DF-1 细胞中CARD11 蛋白可与NDV P蛋白共定位 |
| 4.3.6 CARD11 降低NDV的细胞膜融合活性 |
| 4.3.7 CARD11 抑制细胞内furin蛋白酶的表达 |
| 4.3.8 CBM-NF-κB信号通路的活化抑制了NDV膜融合活性 |
| 4.3.9 CBM-NF-κB信号通路的活化抑制胞内furin的表达 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 其他禽嗜神经病毒对CARD11 表达的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 动物、细胞、病毒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器及常用试剂配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 引物设计 |
| 5.2.2 组织总RNA提取及c DNA合成 |
| 5.2.3 绝对荧光定量CARD11 基因标准曲线的建立 |
| 5.2.4 正常鸡体中不同组织CARD11 基因的表达量测定 |
| 5.2.5 动物攻毒实验 |
| 5.2.6 病毒感染鸡体中CARD11 mRNA的相对表达变化 |
| 5.2.7 NDV滴度测定 |
| 5.2.8 NDV、AEV、IBV、FAdV-4 病毒基因组拷贝数测定 |
| 5.2.9 数据统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 CARD11 基因标准曲线的建立 |
| 5.3.2 正常鸡不同组织中CARD11 基因含量 |
| 5.3.3 NDV组织病毒载量与CARD11 mRNA表达变化的关系 |
| 5.3.4 AEV组织病毒载量与CARD11 mRNA表达变化的关系 |
| 5.3.5 IBV组织病毒载量与CARD11 mRNA表达变化的关系 |
| 5.3.6 FAdV-4 组织病毒载量与CARD11 mRNA表达变化的关系 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文总结 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）传染性支气管炎弱毒活疫苗的初步培育与筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 传染性支气管炎概述 |
| 1.2 传染性支气管炎病毒 |
| 1.2.1 IBV的形态学特点 |
| 1.2.2 IBV的结构蛋白 |
| 1.2.3 IBV的分子变异机理 |
| 1.2.4 IBV的生物学特性 |
| 1.3 传染性支气管炎的分型 |
| 1.3.1 临床分型 |
| 1.3.2 血清分型 |
| 1.3.3 基因分型 |
| 1.4 传染性支气管炎疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 灭活疫苗 |
| 1.4.2 活疫苗 |
| 1.4.3 基因工程疫苗 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料来源 |
| 2.1.2 SPF鸡与鸡胚 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的分离 |
| 2.2.3 病料的RT-PCR鉴定 |
| 2.2.4 分离株RT-PCR反应产物的连接与转化 |
| 2.2.5 分离株重组质粒的提取及S1基因序列测定 |
| 2.2.6 分离株S1基因序列分析 |
| 2.2.7 分离株生物学特性研究 |
| 2.2.8 GDTS13纯净性检验 |
| 2.2.9 分离株与疫苗株鸡胚半数感染量(EID50)的测定 |
| 2.2.10 GDTS13的血清中和试验 |
| 2.2.11 血清型与基因型分析 |
| 2.2.12 GDTS13全基因组序列测定与分析 |
| 2.2.13 GDTS13的传代致弱 |
| 2.2.14 SDTS13不同代次的EID50及S1基因序列测定 |
| 2.2.15 GDTS13不同代次的致病性检测 |
| 2.2.16 GDTS13F100的纯净性检测 |
| 2.2.17 GDTS13F100的毒力稳定性试验 |
| 2.2.18 GDTS13F100的免疫效力的初步评价 |
| 3 结果 |
| 3.1 分离株RT-PCR检测结果 |
| 3.1.1 分离株M基因的鉴定 |
| 3.1.2 分离株S1基因的鉴定 |
| 3.2 分离株S1基因序列分析结果 |
| 3.3 分离株生物学特性鉴定结果 |
| 3.3.1 红细胞凝集试验 |
| 3.3.2 致鸡胚病变特征 |
| 3.4 GDTS13的纯净性检测 |
| 3.5 分离株GDTS13和疫苗株EID50测定结果 |
| 3.6 血清中和试验 |
| 3.6.1 GDTS13和疫苗株的血清抗体检测结果 |
| 3.6.2 疫苗株对GDTS13分离株的血清中和试验结果 |
| 3.7 GDTS13的基因序列分析结果 |
| 3.7.1 GDTS13的全基因序列分析 |
| 3.7.2 GDTS13S1基因分析结果 |
| 3.7.3 GDTS13M基因分析结果 |
| 3.7.4 GDTS13N基因分析结果 |
| 3.8 GDTS13不同代次致病力鉴定结果 |
| 3.9 GDTS13 不同代次的 EID50及 S1 基因序列分析结果 |
| 3.9.1 GDTS136个不同代次的EID50测定结果 |
| 3.9.2 GDTS13不同代次S1基因序列分析 |
| 3.10 GDTS13F100的纯净性检测结果 |
| 3.11 GDTS13F100毒力稳定性评价结果 |
| 3.12 GDTS13F100免疫效力初步评价结果 |
| 3.12.1 攻毒试验 |
| 3.12.2 GDTSF100免疫保护效力评价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 分离株的生物学特性 |
| 4.2 分离毒株的分子特点 |
| 4.3 GDTS13的分子特性 |
| 4.3.1 血清中和试验 |
| 4.3.2 GDTS13的全基因序列分析 |
| 4.3.3 GDTS13的S1基因序列分析 |
| 4.3.4 GDTS13的M基因序列分析 |
| 4.3.5 GDTS13的N基因序列分析 |
| 4.4 GDTS13不同代次的EID50结果和S1基因序列分析及致病力分析 |
| 4.5 GDTS13F100的毒力返强试验结果评价 |
| 4.6 GDTS13F100的弱毒疫苗免疫效力的初步评价 |
| 5 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（3）鹌鹑源禽脑脊髓炎病毒的分离鉴定及在体内分布的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 文献综述 |
| 第一章 禽脑脊髓炎病毒研究进展 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 AEV的特征 |
| 1.1.2 AEV的基因组特征 |
| 1.1.3 AEV的复制增殖 |
| 1.1.4 AEV的检测 |
| 1.1.5 AE流行病学 |
| 1.1.6 AE的诊断 |
| 1.1.7 AE的免疫机理及防治 |
| 1.2 禽脑脊髓炎病毒在动物体内的分布研究 |
| 1.2.1 AEV的致病性研究 |
| 1.2.2 AEV的分布研究 |
| 1.2.3 荧光定量PCR技术在检测病原方面的应用 |
| 1.2.4 免疫组织化学技术在检测病毒分布方面的应用 |
| 试验研究 |
| 第二章 鹌鹑源禽脑脊髓炎病毒的分离鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料 |
| 2.1.2 鸡胚 |
| 2.1.3 试验动物 |
| 2.1.4 血清 |
| 2.1.5 试剂 |
| 2.1.6 引物 |
| 2.1.7 AEV参考毒株 |
| 2.1.8 主要试剂及培养基的配制 |
| 2.1.9 试验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸡胚传代 |
| 2.2.2 分子生物学鉴定 |
| 2.2.3 血清学鉴定（病毒中和试验） |
| 2.2.4 动物回归试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒增殖 |
| 2.3.2 分子生物学鉴定 |
| 2.3.3 序列测定及分析 |
| 2.3.4 病毒中和试验结果 |
| 2.3.5 动物回归试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 禽脑脊髓炎病毒XY/Q-1410 在鹌鹑体内的组织分布 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒 |
| 3.1.2 试验动物 |
| 3.1.3 血清 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.1.6 主要溶液配置 |
| 3.1.7 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 病毒增殖 |
| 3.2.2 攻毒试验与病料采集 |
| 3.2.3 荧光定量PCR测定AEV在鹌鹑体内的病毒载量 |
| 3.2.4 免疫组织化学试验（IHC）测定AEV在鹌鹑体内的分布 |
| 3.2.5 数据统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 临床观察 |
| 3.3.2 标准曲线 |
| 3.3.3 AEV在不同组织中的病毒载量 |
| 3.3.4 IHC分析AEV的组织分布 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）禽脑脊髓炎病毒咸阳株的分离鉴定及其在雏鸡体内的组织分布研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 文献综述 |
| 第一章 禽脑脊髓炎研究进展 |
| 1.1 禽脑脊髓炎病毒研究进展 |
| 1.1.1 AEV的生物学特征 |
| 1.1.2 AEV的增殖 |
| 1.1.3 AEV基因组 |
| 1.1.4 AEV VP1基因及其编码的蛋白 |
| 1.1.5 AEV的分类 |
| 1.1.6 AEV检测方法 |
| 1.1.7 AE流行病学 |
| 1.1.8 AE的临床诊断 |
| 1.1.9 AE与其他疾病的鉴别诊断 |
| 1.1.10 AE的预防控制 |
| 1.2 禽脑脊髓炎病毒在动物体内的分布研究 |
| 1.2.1 AEV的致病性研究 |
| 1.2.2 AEV的分布研究 |
| 1.2.3 荧光定量PCR在病原体检测中的应用 |
| 试验研究 |
| 第二章 禽脑脊髓炎病毒咸阳株的分离鉴定及遗传进化分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料采集 |
| 2.1.2 实验动物及血清 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 引物合成 |
| 2.1.5 AEV参考毒株 |
| 2.1.6 主要试剂与培养基的配制 |
| 2.1.7 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒增殖 |
| 2.2.2 免疫组织化学试验 |
| 2.2.3 动物回归试验 |
| 2.2.4 病毒基因的RT-PCR扩增 |
| 2.2.5 目的基因的克隆 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 鸡胚病理变化 |
| 2.3.2 免疫组织化学检测结果 |
| 2.3.3 动物回归试验结果 |
| 2.3.4 PCR扩增结果 |
| 2.3.5 重组质粒鉴定结果 |
| 2.3.6 AEV XY13 VP1片段的序列测定 |
| 2.3.7 AEV XY13 VP1基因的同源性分析 |
| 2.3.8 AEV XY13 VP1基因的遗传进化分析 |
| 2.3.9 遗传进化距离比较 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 禽脑脊髓炎病毒在雏鸡体内不同组织病毒载量的测定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 病毒的增殖 |
| 3.2.2 EID50的测定 |
| 3.2.3 病料采集 |
| 3.2.4 病毒RNA的提取 |
| 3.2.5 cDNA合成 |
| 3.2.6 实时荧光定量PCR |
| 3.2.7 数据统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 EID50测定结果 |
| 3.3.2 雏鸡临床观察 |
| 3.3.3 RNA纯度测定 |
| 3.3.4 AEV在雏鸡体内的病毒载量测定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 禽脑脊髓炎病毒在雏鸡体内不同组织分布研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒 |
| 4.1.2 血清 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.1.4 主要试剂 |
| 4.1.5 主要溶液配制 |
| 4.1.5 主要试验仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 病料采集 |
| 4.2.2 载玻片处理 |
| 4.2.3 石蜡切片的制作 |
| 4.2.4 免疫组织化学染色 |
| 4.2.5 病毒蛋白相对表达量的计算 |
| 4.2.6 数据统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 一抗最佳稀释度的确定 |
| 4.3.2 DAB显色时间的确定 |
| 4.3.3 免疫组织化学结果 |
| 4.3.4 病毒蛋白相对表达量计算结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）禽网状内皮组织增生症病毒与A亚群白血病病毒共感染的致病性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 插图与附表清单 |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 国内外研究现状 |
| 1.2 研究目的与意义 |
| 1.3 研究内容与技术路线 |
| 1.4 研究目标 |
| 第二章 鸡马立克氏病HVT活疫苗中污染REV的分离鉴定及基因组序列分析 |
| 摘要 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 REV与ALV-A共感染对SPF雏鸡的致病性分析 |
| 摘要 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 REV与ALV-A共感染对疫苗免疫鸡的致病性分析 |
| 摘要 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 REV分离株MD-2感染性克隆的构建及突变分析 |
| 摘要 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 鸡MD活疫苗中污染REV检测方法的建立 |
| 摘要 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论 |
| 第八章 创新点 |
| 第九章 文献综述 |
| 9.1 病原学 |
| 9.2 流行病学比较 |
| 9.3 检测与诊断 |
| 9.4 生物制品中的病毒污染 |
| 9.5 预防和控制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）禽脑脊髓炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 禽脑脊髓炎病毒研究进展 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 AEV 的形态学 |
| 1.1.2 病毒的增殖 |
| 1.2 分子生物学特性 |
| 1.2.1 AEV 基因组 |
| 1.2.2 VP1 基因及其编码的蛋白 |
| 1.2.3 AEV 与其他小 RNA 病毒的关系 |
| 1.3 AEV 的流行病学 |
| 1.3.1 传播方式 |
| 1.3.2 发病率和死亡率 |
| 1.3.3 潜伏期 |
| 1.3.4 临床症状 |
| 1.3.5 病理变化 |
| 1.3.6 发病机理 |
| 1.4 禽脑脊髓炎病毒的检测方法研究进展 |
| 1.4.1 病毒的分离 |
| 1.4.2 鸡胚易感性试验（ES） |
| 1.4.3 琼脂扩散试验（AGP） |
| 1.4.4 单克隆抗体技术（MAb） |
| 1.4.5 酶联免疫吸附试验（ELISA） |
| 1.4.6 反转录聚合酶链反应（RT-PCR） |
| 1.4.7 核酸探针技术 |
| 1.4.8 环介导等温扩增技术（LAMP） |
| 1.5 鉴别诊断 |
| 1.6 防制措施 |
| 第二章 实时荧光定量 PCR 研究进展 |
| 2.1 实时荧光定量 PCR 技术的原理 |
| 2.2 实时荧光定量方法 |
| 2.3 荧光染料与荧光探针 |
| 2.4 产物特异性分析 |
| 2.5 动检领域的应用 |
| 试验研究 |
| 第三章 禽脑脊髓病毒荧光定量检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 AEV SX 毒株 |
| 3.1.2 SPF 鸡胚 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 常用试剂及培养基的配制 |
| 3.1.6 荧光定量用引物设计 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 病毒增殖 |
| 3.2.2 RNA 的提取 |
| 3.2.3 质粒模板标准品的制备 |
| 3.2.4 实时荧光定量 PCR 方法的建立 |
| 3.2.5 荧光定量 PCR 方法的评价 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 常规 PCR 扩增结果 |
| 3.3.2 质粒标准品的鉴定结果 |
| 3.3.3 标准品质粒的拷贝数计算 |
| 3.3.4 荧光定量 PCR 反应条件的优化结果 |
| 3.3.5 扩增曲线的建立 |
| 3.3.6 标准曲线的建立 |
| 3.3.7 熔解曲线分析 |
| 3.3.8 敏感性分析 |
| 3.3.9 重复性验证 |
| 3.3.10 特异性验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 实时荧光定量 RT-PCR 的初步应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 AEV 1143 毒株 |
| 4.1.2 SPF 鸡胚 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 鸡胚毒的检测 |
| 4.2.2 临床样品检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 鸡胚病毒检测结果 |
| 4.3.2 临床样品的 Real-time PCR 与常规 RT-PCR 检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）禽脑脊髓炎病毒YBF02毒株的毒力测定与种子批建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 禽脑脊髓炎研究进展 |
| 1.1 AEV 的流行病学 |
| 1.1.1 传播方式 |
| 1.1.2 发病率和死亡率 |
| 1.1.3 潜伏期 |
| 1.1.4 流行特点 |
| 1.2. 病原学 |
| 1.2.1 AEV 的分类 |
| 1.2.2 病毒的结构和特性 |
| 1.2.3 病毒的致病性 |
| 1.2.4 病毒的培养 |
| 1.3 AEV 的临床症状及病理学变化 |
| 1.3.1 临床症状 |
| 1.3.2 病理变化 |
| 1.4. 发病机理 |
| 1.5 诊断方法 |
| 1.5.1 病毒的分离 |
| 1.5.2 病毒的鉴定 |
| 1.5.3 病毒抗原的检测 |
| 1.5.4 血清学鉴定 |
| 1.6 鉴别诊断 |
| 1.7 免疫机理 |
| 1.7.1 主动免疫 |
| 1.7.2 被动免疫 |
| 1.8 AE 的防制措施 |
| 1.9 疫苗的研究 |
| 1.9.1 灭活苗的研究 |
| 1.9.2 活疫苗的研究 |
| 第二章 病毒毒力的测定 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒 EID50的测定 |
| 2.2.2 对 SPF 鸡胚的致病性 |
| 2.2.3 对雏鸡的毒力试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒 EID50的测定 |
| 2.3.2 对鸡胚致病性的试验结果 |
| 2.3.3 对雏鸡的毒力试验 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 禽脑脊髓炎活疫苗种子批的建立及生物学特性的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 1 日龄 SPF 鸡脑内接种传代 |
| 3.2.2 6 日龄 SPF 鸡胚卵黄囊接种传代 |
| 3.2.3 病毒含量测定 |
| 3.2.4 特异性试验 |
| 3.2.5 病毒纯净试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 1 日龄 SPF 鸡脑内接种传代 |
| 3.3.2 6 日龄 SPF 鸡胚卵黄囊接种传代 |
| 3.3.3 病毒含量测定 |
| 3.3.4 特异性试验 |
| 3.3.5 病毒纯净性试验 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 安全性试验和免疫效力试验 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 安全性试验 |
| 4.2.2 免疫效力试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 安全性试验 |
| 4.3.2 免疫效力试验 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 毒力返强试验 |
| 5.1. 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 易感鸡同居感染传代对毒力影响试验 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 易感鸡同居感染传代对毒力影响试验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）禽脑脊髓炎病毒的鉴定与弱毒疫苗的研制（论文提纲范文）
| 文献综述 |
| 第一章 禽脑脊髓炎研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 病毒特性 |
| 1.2 病毒的基因组 |
| 1.3 生物学特性 |
| 1.4 病毒的实验室培养 |
| 2 流行病学 |
| 2.1 传播方式 |
| 2.2 发病率和死亡率 |
| 2.3 流行新特点 |
| 2.4 潜伏期 |
| 3 临床症状 |
| 4 发病机理 |
| 5 病理变化 |
| 5.1 大体病变 |
| 5.2 组织学病变 |
| 6 诊断方法 |
| 6.1 病毒的分离 |
| 6.2 病毒抗原的检测 |
| 7 鉴别诊断 |
| 8 免疫机理 |
| 8.1 主动免疫 |
| 8.2 被动免疫 |
| 9 防制措施 |
| 9.1 疫苗免疫 |
| 9.2 控制措施 |
| 10 AE疫苗的研究 |
| 10.1 活毒疫苗 |
| 10.2 灭活苗 |
| 试验研究 |
| 第二章 AEV的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 AEV-HD株的理化性质 |
| 2.2 病毒电镜观察 |
| 2.3 血凝性试验 |
| 2.4 RT-PCR鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 理化鉴定 |
| 3.2 RT-PCR鉴定 |
| 第三章 AEV-HD株的毒力测定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒EID50的测定 |
| 2.2 中和试验 |
| 2.3 病毒毒力的测定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 血清中和试验 |
| 3.2 病毒毒力的测定 |
| 第四章 AEV-HD株弱毒疫苗的研制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒纯净 |
| 2.2 毒种的稳定性 |
| 2.3 疫苗的试制 |
| 3 讨论 |
| 3.1 病毒纯净性检验 |
| 3.2 毒种的稳定性 |
| 3.3 疫苗的试制 |
| 结论 |
| 存在的问题 |
| 进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）单克隆抗体介导的禽脑脊髓炎病毒检测方法的建立及其结构蛋白VP3的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 综述 |
| 论文正文 |
| 研究一 禽脑脊髓炎病毒的扩增与纯化 |
| 材料与方法 |
| 结果与讨论 |
| 研究二 禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备、鉴定与初步应用 |
| 材料和方法 |
| 结果与讨论 |
| 研究三 禽脑脊髓炎病毒结构蛋白VP3基因的克隆及原核表达 |
| 材料与方法 |
| 结果与讨论 |
| 研究四 AEV结构蛋白VP3基因真核表达载体的构建及质粒免疫制备VP3抗体的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表论文目录 |
| 致谢 |
（10）IBDV超强毒株感染SPF鸡后法氏囊淋巴细胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白动态表达的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 感染后1 d, 半数左右法氏囊的淋巴滤泡髓质部淋巴细胞缺失； |
| 2.3 TUNEL法原位检测法氏囊淋巴细胞的凋亡： |
| 2.4 法氏囊淋巴细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达： |
| 3 讨论 |
四、禽脑脊髓炎病毒引起SPF雏鸡淋巴细胞和神经细胞凋亡的研究（论文参考文献）
- [1]鸡CARD11蛋白对新城疫病毒的抑制作用[D]. 王文彬. 西北农林科技大学, 2019(02)
- [2]传染性支气管炎弱毒活疫苗的初步培育与筛选[D]. 洪艳芬. 华南农业大学, 2018(08)
- [3]鹌鹑源禽脑脊髓炎病毒的分离鉴定及在体内分布的研究[D]. 范莉莉. 西北农林科技大学, 2017(02)
- [4]禽脑脊髓炎病毒咸阳株的分离鉴定及其在雏鸡体内的组织分布研究[D]. 李志军. 西北农林科技大学, 2016(11)
- [5]禽网状内皮组织增生症病毒与A亚群白血病病毒共感染的致病性分析[D]. 李俊平. 中国农业大学, 2015(07)
- [6]禽脑脊髓炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用[D]. 刘青天. 西北农林科技大学, 2014(02)
- [7]禽脑脊髓炎病毒YBF02毒株的毒力测定与种子批建立[D]. 李凯善. 西北农林科技大学, 2012(12)
- [8]禽脑脊髓炎病毒的鉴定与弱毒疫苗的研制[D]. 张艳艳. 西北农林科技大学, 2005(02)
- [9]单克隆抗体介导的禽脑脊髓炎病毒检测方法的建立及其结构蛋白VP3的初步研究[D]. 唐波. 扬州大学, 2005(05)
- [10]IBDV超强毒株感染SPF鸡后法氏囊淋巴细胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白动态表达的研究[J]. 刘玉锋,佘锐萍,李慧姣,靳红,梁明珍,刘玉如,寸钢彪. 中国农业科学, 2005(02)