一、肾移植受者外周血白细胞淋巴细胞功能相关抗原-1表达的意义（论文文献综述）
邓磊[1]（2020）在《造血干细胞微嵌合及工程化树突状细胞促进受者T细胞活化的机制研究》文中认为背景:微嵌合是指个体内一小部分细胞或DNA来自于另一个体的现象。微嵌合与移植耐受、慢性GVHD、自身免疫病等免疫过程有关,研究造血干细胞微嵌合形成的过程及其对受者T细胞免疫功能的影响具有重要意义。树突状细胞（DCs）是最重要的抗原提呈细胞之一,是T细胞活化的桥梁。修饰后的工程化树突状细胞能够增强对T细胞的调节作用,Mo S2纳米薄片（MSNs）由于优异的物理和化学性质,已应用于生物成像探针、生物传感器、光热治疗剂、药物载体和组织工程支架等方面。利用其作为佐剂来修饰树突状细胞是一个非常吸引人的研究课题。机体内的抗肿瘤免疫反应主要通过激活T细胞来杀死肿瘤细胞。原发性皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）是最常见的皮肤淋巴瘤,晚期皮肤T细胞淋巴瘤的5年生存率仍不到25%。早期阻止皮肤T细胞淋巴瘤的进展,将避免疾病晚期的高死亡率。方法:1. 为了研究造血干细胞输注产生的微嵌合过程及其对受者免疫功能的影响,我们将G-CSF动员后的C57脾细胞输注给不接受预处理的CB6F1可形成微嵌合。通过多色流式技术标记小鼠不同细胞亚群及供受细胞H-2抗原的不同,我们可以比较不同细胞亚群微嵌合形成的异同。通过小动物活体成像系统及C57BL/6-Tg（Fluc+/-）小鼠我们可以在活体内完整观察供者细胞在受者体内分布及扩增形成微嵌合的过程。多色流式技术使我们进一步可以检测微嵌合形成过程中供受者T细胞活化的状态及骨髓干祖细胞扩增的情况。通过流式分选细胞然后进行RNA-Seq,我们可以掌握微嵌合前后受者T细胞RNA的表达情况。2.我们使用了分别为100-250纳米（S-MSNs）和400-500纳米（L-MSNs）的少层状Mo S2薄片（MSNs）来修饰DCs。骨髓培养的DCs暴露在不同剂量（0、8、16、32、64、128μg/ml）MSNs中48h后,检测其表面标志、细胞因子分泌。应用小动物活体成像系统体内追踪DCs的归巢,通过流式检测其对局部淋巴结T细胞的活化作用。3.我们在-2天于C57BL/6小鼠接种EG7-OVA小鼠T淋巴瘤细胞,于0天经尾静脉输注G-CSF动员后Balb/c小鼠脾细胞。分别在第0天和第7天将共孵育的DCs注入小鼠右侧脚垫中,并在第7天和第14天取小鼠尾静脉血通过多色流式技术检测嵌合。在第14天通过流式和细胞计数检测外周血及腘窝淋巴结T细胞的增殖活化。于第7天、10天、14天用游标卡尺测量并计算小鼠肿瘤体积。结果:1. DCI-6E7组在输细胞后+1天供者细胞植入为1.76±0.49%,+4天供者细胞嵌合到达最高2±0.54%,在7-14天其嵌合波动于1.2-1.9%,未见明显下降。但是14-21天其嵌合迅速降至0.18%,而后持续下降。DCI-6E7组小鼠细胞输注后体重逐渐上升,小鼠饮食、毛色、体态均未见明显异常,外周血白细胞仅仅是轻微下降而后恢复,但是血小板和血红蛋白却无明显变化。DCI-6E7组受鼠在1-14天时T、B细胞及其他亚群仅形成低比例供者嵌合（1.1%～4.5%）;+14天各细胞亚群嵌合均开始快速下降,至+28天,流式细胞术仅检测到极少量供者嵌合。6×107组CD3+,CD11b+,B220+细胞比例仅有轻度变化,分别波动于31.1-47.8%,25.6%-36%,8.6%-24.3%。CD4/CD8波动于1.5-3.2,持续>1。DCI-6E7组荧光强度在0-12小时上下波动,于+1天减弱,而1-5天无明显变化,并于第5-7天升高,随后持续下降,供者细胞荧光信号6×107组主要集中于淋巴结和脾脏。DCI-6E7组供者来源活化T细胞在输注后4-7天有不同程度扩增,而后逐渐下降。受者来源T细胞活化相关标志则在细胞输注后7-21天有剧烈扩增,而后逐渐下降。输细胞后+10天相对于输细胞前受者CD4+细胞差异基因明显上调的基因数目多余下调的基因数目,受者CD8+细胞差异基因明显下调的基因数目多余上调的基因数目。他们参与多种生物学过程和细胞组分以及分子学功能,涉及调节多种信号通路（包括免疫与炎症反应、自身免疫性疾病、感染性疾病等）。其中有许多基因参与免疫与炎症反应,他们通过调节TH1/TH2、TH17细胞的分化或直接通过细胞间的粘附通路调节炎症反应。2. 所有剂量（0-128μg/ml）不同大小的MSNs均不影响DCs的活性。128μg/ml的S-MSNs和L-MSNs处理的DCs其CD40、CD80、CD86和CCR7的表达显着升高。IL-12p70的分泌保持不变,而IL-1β减少分泌,TNF-α的分泌在某种程度上与MSNs治疗的剂量有关。只有128μg/ml的L-MSNs处理的DCs显着观察到增加的IL-6。MSNs处理显着促进了个体局部淋巴结和血液循环中DCs的体内外运动和体内归巢能力。DCs归巢能力增强的原因细胞是因为受ROS升高调节的细胞骨架的重排。经MSNs修饰的DCs接种到小鼠中,CD4+和CD8+T细胞的增殖和活化更为明显（以CD107a、CD69和ICOS的高表达为特征）。MSNs的处理并没有影响LPS诱导的DC激活、归巢和T细胞启动。3. OVA和MSNs的细胞毒性并不高,OVA单独不能促进DCs的成熟,而和MSNs共培养可以促进DC成熟,其特征是CD40,CD80和CD86的升高,增强IL-6的分泌。外周血造血干细胞输注可以在肿瘤小鼠体内产生供者细胞微嵌合,随着时间的延长有下降的趋势。外周血造血干细胞输注可以刺激肿瘤小鼠外周血B细胞和T细胞的扩增。特别是刺激了CD4+细胞、CD8+细胞中CD107a、CD69、ICOS活化标志细胞的大量扩增。DCs免疫可以刺激小鼠局部淋巴结中B细胞和T细胞的扩增,Mo S2修饰后可以进一步放大这种效果。特别是刺激了CD4+细胞,CD8+细胞中CD107a、CD69、ICOS活化标志细胞的大量扩增。对小鼠进行OVA-DCs免疫治疗可以抑制小鼠肿瘤的生长,而加上Mo S2修饰的DCs可以进一步抑制小鼠肿瘤生长。单独输注外周血造血干细胞也可以抑制肿瘤的生长。联合外周血造血干细胞输注和Mo S2-OVA-DCs免疫对肿瘤细胞的抑制效果最好。结论:1.通过活体成像,我们观察到供者细胞在受者体内形成微嵌合的过程。造血干细胞输注形成微嵌合与传统大嵌合相比仅轻度降低血象、无GVHD,激活了受者T细胞,并且可以刺激受者骨髓造血干祖细胞的扩增,调节受者免疫功能与炎症反应。这些结果为研究微嵌合的形成及其在抗肿瘤、自身免疫性疾病及促造血中的作用提供了基础。2.在DC的工程化修饰中,在相对高剂量（128μg/ml）时,MSNs可以提高DCs的体外成熟和淋巴结归巢,并大幅度提高DCs的活化能力,引起更强的CD4+和CD8+T细胞免疫反应。此外,ROS诱导的细胞骨架排列参与了MSNs修饰的DCs运动能力的提高。作为第一个系统研究MSNs对DC修饰的工作,我们的发现为修饰DC提供了新的方法,同时为MSNs作为免疫调节佐剂提供了支持证据。3. 造血干细胞微嵌合和二硫化钼纳米薄片修饰的DCs均具有一定抑制肿瘤的作用,联合二者可以发挥更强的抑制肿瘤生长的作用。发挥这一作用的途径可能是通过激活受者外周血及局部淋巴结T细胞的活化和扩增。
杨锦涛[2]（2019）在《滤泡辅助T细胞及单核/巨噬细胞来源的外泌体在肾移植术后抗体介导的排斥反应中的作用及机制研究》文中提出目的与意义:抗体介导的排斥反应是移植肾失功的关键因素,目前对于其免疫分子机制认识尚不充分,临床上对于ABMR的治疗仍停留在非特异性抑制或清除产生抗体的细胞或阻断已产生的抗体作用层面,靶向性差。滤泡辅助T细胞是一类促进B细胞成熟、形成抗体的CD4细胞。外泌体是一种小囊泡,由细胞装配和释放,参与譬如细胞迁移、抗原提呈、免疫应答、肿瘤侵袭等许多生物学过程。Tfh来源外泌体与B细胞分化以及与ABMR相关性尚无报道。肾移植术后,供者肾小球内皮细胞最先接触到受者免疫细胞,研究两者之间外泌体的传递对于研究移植排斥至关重要。移植肾进入体内后将立即激活受体的先天性免疫,大量的单核/巨噬细胞归巢和并浸润到移植物中。单核/巨噬细胞表面配体能作用于内皮细胞上受体,发挥粘附、促炎功能,因此其可作为一个有效模型,研究肾移植后免疫细胞同供体组织细胞之间外泌体传递。本课题在前期对Tfh细胞在ABMR中的作用机制研究的基础上,进一步研究其分泌的外泌体在ABMR的作用,检测CRAD患者循环CD4+CXCR5+外泌体,分析其与ABMR的相关性。并进一步分离Tfh细胞体外培养后获取Tfh细胞来源的外泌体,将其在SEB刺激下与B细胞共培养,分析其对B细胞增殖与分化的影响。不仅为阐明Tfh细胞辅助B细胞增殖和分化的机制提供了新的视角,而且为ABMR的预防和监测提供了新的途径。并且以Netrin-1作为一种分子模型来讨论神经分子对单核/巨噬细胞和肾小球内皮细胞信息交流的影响,为理解器官同种异体移植后神经、免疫和血管之间的相互作用和联系外泌体的传递提供新的见解。CD4+CXCR5+外泌体与肾移植术后ABMR的相关性研究方法:1、研究对象选择:选取在解放军总医院第八医学中心就诊的肾移植术后慢性移植肾失功（CRAD）患者作为研究对象,并选择同时期术后肾功正常患者做为对照组。2、标本的采集:入组的研究对象于清晨空腹收集液标本,ABMR组患者标本均为临床确诊ABMR针对治疗前及时收集血清标本。3、研究对象分组:依据2013年ABMR的Banff标准分两组,包括ABMR及非ABMR组。4、外泌体分离方法:利用聚合物沉淀法提取。5、鉴定外泌体:TEM鉴定外泌体形状和大小;NTA技术鉴定粒径和浓度;Western鉴定分子标志。6、流式检测:使用包被抗CD63抗体磁珠结合外泌体,应用流式细胞术检测CD4、CXCR5等表面标志:使用Invitrogen公司的Exosome-Human CD63分离/检测试剂,使外泌体和磁珠结合,应用流式检测CD4、CXCR5、CTLA-4、HLA-G,比较ABMR组患者与非ABMR组患者之间CD4+CXCR5+外泌体的差异,分析其与ABMR的相关性。7、收集临床资料:性别、年龄、肾移植术后的时间等和化验指标。8、数值数据记录为平均值土标准差（x±s）。应用SPSS 19.0对数据进行分析计算。使用双侧Wilcoxon秩和检验来比较临床资料。Spearman等级测试相关性和配对t检验比较实验数据。P<0.05设定为具备统计学差异。结果:1、外泌体的基本特点:TEM显示,分离的外泌体呈茶盘型/半球形,具有凹面,粒径50-100nm;NTA结果显示囊泡粒径约100nm;Western Blot检测外泌体蛋白表达;CD9、CD81及TSG101这三种标志蛋白在血清分离出的囊泡中均有表达。2、流式细胞仪比较各组受者血清分离的外泌体及其亚型的差异:CRAD组病例血清和移植肾功能正常病例血清CD4+CXCR5+外泌体比例无明显差异。在CRAD组中,CD4+CXCR5+CXCR3-外泌体的比例高于对照组。CRAD患者进一步分为ABMR组和非ABMR组,组间CD4+CXCR5+外泌体比例无显着差异,而ABMR组CD4+CXCR5+CXCR3-外泌体比例显着高于非ABMR组。3、流式检测Tfh细胞来源外泌体上HLA-G和CTLA-4水平:与对照组相比,CRAD组中HLA-G和CTLA-4的CD4+CXCR5+外泌体表达没有明显变化。CRAD患者中,ABMR组中CD4+CXCR5+外泌体上CTLA-4水平显着低于非ABMR组,但HLA-G水平差异不明显。结论:肾移植术后ABMR患者血清中CD4+CXCR5+CXCR3-外泌体增加,提示其和ABMR有关。ABMR患者血CD4+CXCR5+外泌体表面CTLA-4水平明显降低。ABMR患者外周血Tfh来源外泌体对B细胞的影响方法:1、研究对象及分组:同第一部分。2、标本的采集:获取外周血,保存抗凝管中。3、分离PBMC:淋巴细胞分离液获取PBMC。4、分选滤泡辅助T细胞:磁珠法先阴性分选标本CD4细胞;再阳性分选CD4+CXCR5+Tfh。5、培养滤泡辅助T细胞:将Tfh加入含10%去除外泌体胎牛血清RPMI1640培养基48h。6、分离Tfh细胞来源的外泌体:利用聚合物沉淀法提取。7、流式细胞术检测外泌体中HLA-G和CTLA-4的表达。8、外泌体示踪实验:使用PKH67进行染色,然后加至B细胞培养,验证其是否被吞噬。9、将外泌体加入耗尽Tfh细胞的淋巴细胞培养基共培养48h,流式细胞术测量其中B细胞（CD3-CD19+细胞）和浆细胞（CD3-CD19-CD38+细胞）的比例。并用ELISA检测Ig浓度。结果:1、在ABMR组患者中,Tfh细胞来源的外泌体上的CTLA-4表达降低,但HLA-G与非ABMR组无差异;2、Tfh细胞来源的外泌体可以被B细胞吞噬;3、ABMR患者Tfh来源外泌体刺激B细胞分化、扩增,相对于非ABMR组,B细胞和浆细胞的比例分别增加87.52%和110.2%;4、ABMR患者中Tfh来源外泌体刺激IgG和IgA产生,但对IgM产生没有显着影响。结论:1、Tfh来源外泌体可以被B细胞吞噬;2、ABMR患者Tfh来源外泌体促进B细胞分化、增殖,并且能够增加IgG、IgA抗体生成;3、ABMR组患者Tfh细胞来源的外泌体上的CTLA-4表达降低,但HLA-G的表达与非ABMR组无差异,推测外泌体可能是CTLA-4发挥免疫抑制效应的重要载体。单核细胞/巨噬细胞通过外泌体靶向递送HLA-G至内皮细胞方法:1、获取志愿者PBMC,分选单核/巨噬细胞;2、与丝裂霉素C处理过的肾小球内皮细胞以及来自相同志愿者的淋巴细胞进行混合淋巴细胞培养（MLC）;3、更换培养基继续培养单核/巨噬细胞,分组加入Netrin-1及外泌体抑制剂GW4869,流式细胞术检测单核/巨噬细胞的表型及HLA-G蛋白的表达;4、MLC48小时后,从单核/巨噬细胞中除去刺激因子,然后将细胞加入到室的上部,并且预先在室的下部放进肾小球内皮细胞。培养48h后获取下部内皮细胞;5、流式检测内皮细胞表面HLA-G及其受体、黏附分子水平;6、聚合物沉淀法试剂盒分离单核/巨噬细胞来源的外泌体,示踪实验检测是否被内皮细胞吞噬;7、外泌体同内皮细胞共培养,流式检测HLA-G蛋白水平。结果:Netrin-1促进了单核/巨噬细胞的表型转化和HLA-G的表达,神经突起导向因子Netrin-1刺激的单核/巨噬细胞通过外泌体的递送促进内皮细胞中HLA-G及其受体的表达,单核/巨噬细胞在Netrin-1刺激后外泌体HLA-G表达的显着增强;使用抗体密封外泌体上的HLA-G,可以显着抑制Netrin-1组中内皮细胞的HLA-G的表达。神经突起导向因子Netrin-1促进单核/巨噬细胞来源外泌体HLA-G靶向递送至内皮细胞。Netrin-1刺激的单核/巨噬细胞抑制内皮细胞中促炎分子表达。结论:1、MLC诱导单核/巨噬细胞向M1极化,增强其HLA-G表达,神经突起导向因子Netrin-1能部分逆转这种极化,进一步促进单核/巨噬细胞的HLA-G表达;2、单核/巨噬细胞通过外泌体靶向递送HLA-G至进内皮细胞,神经突起导向因子Netrin-1能促进这种传递方式。
谢亚龙[3]（2019）在《肾移植术后长期存活（＞20年）受者免疫状态评估》文中指出【目的】分析对比肾移植术后长期存活（>20年）移植肾功能稳定受者、肾移植术后近期（1-2年）移植肾功能稳定受者和健康人群部分免疫细胞亚群比例及血清部分细胞因子水平变化情况,对肾移植术后长期存活受者的免疫状态进行综合评估。【方法】以28例肾移植术后长期存活受者为研究对象,肾移植术后近期移植肾功能稳定受者15例及健康人15例作为对照组。通过流式细胞技术检测受试者外周血T淋巴细胞亚群（包括CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD25+CD127-T细胞（Tregs））、B淋巴细胞亚群(包括CD19+B细胞、CD19+CD24hi CD38hi B细胞、CD19+CD24hiCD27+B细胞)以及髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）（包括CD33+CD11b+HLA-DR-CD14-CD15+MDSCs、CD33+CD11b+HLA-DR-CD14+CD15-MDSCs）,流式细胞微球检测技术（CBA）检测IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A、IFN-γ的血清水平,酶联免疫吸附法（ELISA）检测TGF-β1的血清变化水平,并分析肾功能及HLA抗体检测结果等临床资料。【结果】免疫细胞当中,长期存活组和术后近期肾功能稳定组Tregs/CD4+T细胞、CD19+B细胞、CD19+CD24hi CD38hi B细胞低于健康对照组（P<0.05）,有统计学差异。细胞因子当中,长期存活患者血清INF-γ的水平明显高于术后近期移植肾功能稳定组和健康对照组（P<0.05）,有统计学差异;血清TGF-β1水平,长期存活组明显低于术后近期肾功能稳定组和健康对照组（P<0.05）,有统计学差异。长期存活组中有43%受者尿蛋白阳性,50%受者HLA抗体阳性。【结论】长期存活受者中,与促进免疫应答相关指标有升高,而与免疫抑制相关的指标却未见明显升高。移植肾长期有功能存活的受者可能处于低强度免疫制剂作用下免疫抑制和排斥反应共存的免疫平衡状态,如果将免疫抑制剂减少或完全停止,有可能会导致其向排斥方向的转化。
李芬[4]（2019）在《肾移植术后降钙素原与Th22和Th17细胞的临床相关性研究》文中研究表明背景:肾移植术后免疫抑制剂的使用在防范移植排斥发生的同时,增加了移植受者的感染风险,继而影响移植肾脏的长期存活甚至威胁移植受者的生命安全。因此,对肾移植术后感染进行早诊断并实施有效的干预尤为重要。研究表明降钙素原（PCT）在评估感染状态方面比传统指标具有更高的敏感性和特异性,且已逐渐应用于移植领域。然而,移植术后针对感染发生的诊治,需要综合性的考虑免疫调节因素,以满足肾移植术后抗感染和抗排斥的精细化要求。辅助性T细胞在肾移植术后的免疫调节中发挥关键作用,特别是研究表明Th17、Th22等辅助性T细胞亚群在移植免疫和感染免疫中均发挥重要的生物学功能。因此,进一步整合移植术后PCT和辅助性T细胞亚群分布以及相关细胞因子等免疫调节指标,基于临床样本探索各个指标的相关性,对移植术后精细化的感染诊断和治疗效果评价具有重要的临床意义。目的:研究肾移植术后受者早期PCT异常与外周血中重要的辅助性T细胞亚群（Th17和Th22）的临床相关性,为移植术后进行精细化的感染诊治提供临床参考。方法:本研究中主要采用流式细胞技术检测肾移植术后受者外周血中Th22、IL22+Th17、Th17细胞的频数变化;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血浆中IL-22、IL-17A、IL-6、TNF-α细胞因子的含量。基于PCT水平分组下分析临床常规指标的表达情况,以及分析Th细胞亚群分布特点与相应细胞因子水平。结果:（1）PCT异常组中常规的感染指标显着增高;并且评估肾功能状态指标也显着增高;（2）PCT异常组Th22、IL22+Th17细胞频数显着增高,而Th17细胞无明显的差异;（3）PCT异常组细胞因子IL-22、TNF-α、IL-17A水平均增高,但未发现IL-6有显着变化;（4）PCT异常组中IL-22和Th22细胞呈正相关,而TNF-α与其不具有相关性,并且IL22+Th17细胞与IL-22也不存在相关性。结论:肾移植术后PCT异常与Th22细胞以及细胞因子IL-22具有显着的临床相关性,提示整合相关指标可能有益于肾移植术后感染的精细化评估,并且为进一步研究辅助性T细胞亚群在肾移植术后感染中的免疫调节作用机制提供了思路。
朱凌峰,陈书尚,蔡锦全,谭建明,翁明芳[5]（2018）在《骨髓间充质干细胞对肾移植受者T淋巴细胞分化和miRNA-155表达的影响》文中提出目的探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）对肾移植受者T淋巴细胞分化和miRNA-155表达的影响。方法选取2013年1月至2017年12月于福州总医院接受MSCs诱导+同种异体肾移植术的受者20例（MSCs组）,对照组为同期配对的异体肾移植受者20例。两组患者术后免疫抑制方案均为霉酚酸酯+他克莫司+强的松。两组患者分别于移植术前、术后第15天抽取静脉血,流式细胞仪检测外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞/CD4+细胞亚群比值;ELISA检测白细胞介素2（IL-2）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素10（IL-10）浓度;免疫磁珠分选外周血T淋巴细胞后,Rea1-time PCR法检测外周血T淋巴细胞中miRNA-155的表达。两组间均数比较采用独立t检验,治疗前后均数比较采用配对t检验。结果移植前两组肾移植受者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞/CD4+细胞比值、IL-2、IL-10、TNF-α、T淋巴细胞mi RNA-155表达水平差异均无统计学意义（P均> 0.05）;术后第15天,与对照组相比,MSCs组外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞/CD4+细胞亚群比值（30.44%±4.23%vs26.06%±4.77%,t=2.365,P=0.042）、IL-10水平（20.35 ng/L±5.10 ng/L vs16.63 ng/L±6.26 ng/L,t=2.062,P=0.046）上升,而IL-2（27.47ng/L±4.30ng/L vs31.40 ng/L±5.33ng/L,t=2.252,P=0.015）、TNF-α（41.52 ng/L±8.32 ng/Lvs46.67 ng/L±6.71 ng/L,t=2.157,P=0.037）和T淋巴细胞miRNA-155表达水平（1.61±0.31vs 1.89±0.15,t=3.688,P=0.001）则降低。结论 MSCs能够升高肾移植受者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞/CD4+细胞比值和IL-10水平,降低IL-2、TNF-α和T淋巴细胞miRNA-155表达水平,与MSCs的免疫耐受诱导有关。
孔祥瑞[6]（2016）在《红细胞表面分子在肾移植术后免疫功能状态评价中的临床价值》文中研究指明肾移植手术发展至今,已经使无数的终末期肾病患者的生存质量得到显着提高,生存时间得以延长,但肾移植术后排斥反应和感染会导致移植肾失功,甚至危及受者生命。目前学术界普遍认为,上述两种亟需攻克的难题与机体免疫功能失衡息息相关。随着免疫抑制治疗手段的不断进步,组织配型技术和外科手术技术的提高,移植排斥反应的发生率正在逐年降低。但是免疫抑制药物的使用也提高了肾移植受者机会性感染的风险,可以说免疫抑制药物的临床应用具有双面性,在保护移植器官免受宿主体内免疫系统攻击的同时也导致了机会性感染的发生。因此,移植术后如何对受者的免疫功能状态做出客观、准确的评价,是指导临床免疫抑制药物合理使用的基础,这样既可以使肾移植受者的免疫状态在免疫排斥和免疫耐受之间保持平衡,确保移植物在受者体内长期存活,又可以避免因免疫抑制剂过量应用带来的潜在风险,因此肾移植术后受者体内免疫功能的评价是当前器官移植领域关注的焦点之一。红细胞（RBC）是血液运送氧气的最主要的媒介,而近年来的研究发现,红细胞除了具有携氧功能之外,还具有免疫功能,是人体内数量最多的天然免疫细胞。既往的研究认为,成熟的无核红细胞似乎不具备参与机体免疫功能的遗传物质基础。直到1981年Siegel提出“红细胞免疫系统”的概念,学术界才认识到红细胞膜表面表达了许多免疫分子,这些免疫相关物质参与了黏附、识别、浓缩、杀伤抗原、清除循环免疫复合物（circulating immune complex, CIC）等过程。对肺炎球菌和梅毒螺旋体等进行体外实验中发现,在有补体和红细胞参与的情况下,白细胞的吞噬功能明显增强；也有研究报道红细胞可以阻止肿瘤细胞在体内的扩散,这些研究均提示红细胞虽然没有细胞核,但是仍然具有免疫调节功能。红细胞对于维持机体免疫系统的平衡和稳定发挥着至关重要的作用,在体内可以与淋巴细胞等免疫细胞相互作用,协同参与对免疫细胞网络的调控。红细胞参与对机体免疫反应的调控主要是通过其表达的膜表面免疫分子实现的,其中,补体受体-1（complement receptor 1, CR1/CD35）在红细胞免疫黏附功能中具有非常重要的作用,其与C3b具有较强的亲和力,可以结合并参与清除血浆中的循环物质,促进单核-巨噬细胞吞噬循环中的免疫复合物,并通过二次抗原递呈的作用间接参与调控细胞因子的产生。红细胞还可通过产生特异性TNF诱导因子、NK细胞增强因子等来参与机体非特异性免疫调控,及细胞因子的调控,尽管其分子机制尚未完全明确,但有研究证实红细胞可以通过其膜表面CD58、CD59等淋巴细胞CD2的天然配体分子促进与NK细胞和T细胞的结合,清除淋巴细胞微环境活性氧物质,提高NK细胞杀伤活性和T细胞抗凋亡能力,并促进淋巴细胞产生IL-1、IL-2等细胞因子。已有多种疾病的病程进展中存在红细胞膜表面分子表达异常,如肝炎、良恶性肿瘤、自身免疫性疾病、糖尿病等。慢性肾衰竭患者由于肾功能的损坏,促红细胞生成素分泌减少,容易导致贫血的发生。肾移植手术后,随着肾功能恢复,同时贫血状况也随之改善,但是在此过程中,红细胞膜表面免疫分子的表达变化以及红细胞免疫功能状态等尚未有相关研究。鉴于此,本研究就红细胞免疫分子在肾移植术后表达变化及其机制进行了分析探讨。首先,通过流式细胞术测定肾移植受者红细胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59的表达,旨在明确肾移植及其术后不同免疫状态下受者红细胞膜表面分子表达变化情况,从而更全面的评估肾移植受者的免疫状态,以期为临床免疫抑制治疗提供更好的依据。并利用Transwell和细胞联合培养等方法,观察体外条件下,不同免疫抑制剂对红细胞免疫分子表达的影响,以及红细胞与T、B淋巴细胞的相互作用,通过对培养过程中细胞因子表达情况的检测,对不同免疫状态的肾移植受者红细胞对T和B淋巴细胞增殖情况的影响机制进行研究,观察红细胞免疫功能肾移植术后不同免疫状态下的变化,以及红细胞在体外对淋巴细胞调节作用的机制。一、红细胞CD35/CD58/CD59在肾移植受者中的表达变化选择2013年1月至2014年6月间接受首次同种异体肾移植手术,术后移植肾功能稳定的受者50例为稳定组,慢性肾衰竭患者65例为慢性排斥反应慢性肾衰竭组（简称CRF组）,以50例健康体检人员为对照组。同时,对52例肾移植受者进行组织病理学检查,选择肾移植术后发生移植肾功能延迟恢复的受者11例为移植肾功能延迟恢复组（简称DGF组）,以及肾移植术后发生急性排斥反应的受者16例为急性排斥反应组（简称AR组）,留取上述不良事件发生时的肾移植受者外周抗凝血样本。采用流式细胞术分别检测各组研究对象的外周血红细胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59的平均几何荧光强度（GMFI）表达,观察肾移植受者术后发生肾功能延迟恢复和排斥反应时外周血红细胞免疫分子CD35/CD58/CD59的变化,并与对照组和稳定组进行比较,来探讨红细胞免疫功能在受者肾移植后不同状态的表达情况。结果显示,CRF组CD35、CD58、CD59的GMFI表达分别为（25.26±7.92）、（89.94±13.8）、（75.38±16.49）明显低于对照组,P<0.05；稳定组CD35 （27.04 ±6.0）、CD59（87.62±20.90）的表达虽然较CRF组高,但明显低于对照组,P<0.05,稳定组CD59的表达明显高于CRF组,P<0.05；稳定组CD58的表达与对照组无明显差异,P>0.05。DGF组与AR组红细胞免疫分子CD35表达分别为（22.46±5.01）、（24.51±6.58）,明显低于对照组,P<0.05,但与稳定期对照组差异无统计学意义；DGF组和AR组CD58表达分别为（73.24±11.11）、（77.42±16.60）明显低于对照组,P<0.05; DGF组和AR组红细胞免疫分子CD59表达分别为（58.66±15.82）、（77.17±28.49）,明显低于对照组,P<0.05 AR组虽低于稳定组,但无统计学意义；DGF组CD59表达明显低于AR组,P<0.05。该结果提示,由于肾功能受损,CRF患者红细胞表达的免疫分子均有所下调,红细胞免疫功能受损,而肾移植术后随着肾功能恢复,红细胞表达的免疫分子有所恢复,但除CD58表达与正常对照无差别之外,CD35和CD59表达仍低于正常对照。在肾移植术后出现DGF时,体内出现过度的缺血再灌注损伤,对红细胞免疫分子表达影响明显,尤其是CD58和CD59,其表达低于稳定组和对照组,并且CD59甚至低于AR组,提示缺血再灌注损伤产生的大量活性氧自由基对红细胞表达免疫膜分子影响明显。而AR时,由于炎症的局限性,未能形成全身性的炎症反应,因此其表达变化较小。二、肾移植受者红细胞免疫功能与淋巴细胞亚群相关性及巨细胞病毒感染对红细胞CD35/CD58/CD59表达的影响对2013年1月至2014年6月间接受首次同种异体肾移植手术的受者术后血清肌酐恢复情况进行监测,选择30例肾移植术后功能稳定的受者为连续监测组,分别于术前1d、术后3d、7d、14d各个时间点采集连续监测组受者外周血样本；收集临床疑似病毒感染的肾移植受者外周血进行间接免疫荧光技术对其巨细胞病毒（CMV）早期抗原PP65检测,以发现1个或1个以上阳性细胞/2×105个白细胞,则定为阳性。选择外周血CMV-pp65抗原阳性的肾移植受者61例为CMV活动性感染组（简称CMV组）,采用流式细胞术同时检测其外周血红细胞免疫分子CD35/CD58/CD59的表达和T、B、NK淋巴细胞的水平。研究发现,健康对照组红细胞CD35的表达与CD59表达呈正相关,与CD4+T细胞的百分比呈正相关,与B细胞的百分比呈负相关,差异均有统计学意义。肾移植受者术前1d、术后3d、7d、14d的红细胞免疫分子CD35GMFI表达分别为（27.00±7.5）、（28.04±7.2）、（25.70±6.83）和（24.19±6.0）均低于对照组,P<0.05。受者术前、术后3d、7d、14d的红细胞免疫分子CD59GMFI表达分别为（80.44±20.56）、（91.50±23.17）、（85.02±24.92）和（82.67±25.56）均低于对照组,P<0.05。受者红细胞免疫分子CD58GMFI表达与对照组比较,差异没有统计学意义。连续监测组术后3dCD3+T淋巴细胞绝对数（773.5±301）低于对照组,P<0.05；术后3d与术前1d（2288±723）相比明显降低,P<0.05； NK细胞绝对数在术后3d时降至最低（108.3±40.1）,与对照组、术前1d、术后14d比较P<0.05；B细胞绝对数在术后7d（610.2±215.6）、14d（765.5±269.4）急剧增高,甚至高于术前和对照组,P<0.05。CMV组的红细胞免疫分子CD35/CD58/CD59表达明显低于对照组,P<0.05；非活动性感染组的CD59表达高于CMV组,P<0.05。其中高活动性感染组的红细胞CD35、CD59的表达均低于低活动感染组,P<0.05。三、红细胞对T、B淋巴细胞影响的初步探讨对2015年7月至2015年12月期间接受同种异体肾移植术后3个月内稳定期的受者,以及在B超引导下移植肾穿刺活检后病理结果提示发生排斥反应的受者,留取其外周抗凝血标本,用密度梯度离心法分离红细胞和单个核细胞（PBMC）.分离后的红细胞加免疫抑制剂刺激48h与单独培养48h的膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59表达相比没有明显差异。将稳定期受者红细胞、排斥受者红细胞分别与健康人的PBMC联合培养后,采用流式细胞术对培养后的混合细胞中红细胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59的表达和T、B淋巴细胞的水平进行检测,发现稳定红细胞组B细胞比例较排斥组明显增高,并且CD19表达的明显上调,出现强阳性细胞群。通过用流式细胞术对该群细胞表型分析以及胞内标记IL-10,结果显示该细胞为分泌IL-10的CD19+的调节性B细胞亚群,提示稳定期受者红细胞可以增加外周血Breg细胞比例。为了明确红细胞与诱导Breg之间的关系,我们利用磁珠分选纯化B细胞和T细胞,发现单独与红细胞共培养的B细胞没有明显增殖,而加入T细胞共培养则Breg亚群增加,提示红细胞是通过T细胞诱导Breg产生和B细胞增殖的。为了对细胞之间相互调控的机制进行深入研究,我们利用Transwell小室,将红细胞与T细胞联合至于小室上层进行培养,同时在下室加入B细胞,结果发现B细胞出现增殖,Breg亚群比例增加,提示T细胞可能通过旁分泌的方式诱导Breg的产生；ELISA检测结果显示,稳定红细胞组和T细胞共培养后培养上清中的IL-10和TGF-β的含量高于排斥红细胞组。体外联合培养的结果提示,红细胞可以通过促进T细胞分泌IL-10和TGF-β来诱导B细胞增殖和Breg的产生。结论：慢性肾衰竭患者体内红细胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59表达降低,提示在慢性肾功能衰竭的尿毒症状态损害了红细胞免疫功能,移植后,肾功能随着肌酐的降低逐渐恢复,红细胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59表达有所上调,但除了CD58之外,CD35和CD59表达在肾功能恢复后其表达仍低于健康对照组,可能与免疫抑制剂的使用有关。肾移植手术后,红细胞免疫功能和淋巴细胞免疫功能均出现紊乱,在术后随着血清肌酐的降低、肾功能稳定后可逐渐恢复。肾移植术后发生DGF、急性排斥反应和巨细胞病毒感染时,受者红细胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59表达下调,提示这些不良事件过程伴随有红细胞免疫功能的变化,与疾病过程有关。免疫抑制剂西罗莫司、环孢素和他克莫司在短时间内并不影响循环中红细胞表面CD35/CD58/CD59分子的表达。稳定期受者红细胞可促进健康对照者PBMC中的B细胞增殖,且可诱导B细胞向调节性B细胞亚群分化,该过程是是通过促进T细胞活化分泌细胞因子来间接诱导B细胞增殖的。采用流式细胞术对红细胞膜表面免疫分子CD35/CD58/CD59的表达进行检测,对于评估肾移植受者术后免疫状态,早期诊断、预防排斥反应、感染等不良反应的发生,以及指导合理用药有一定临床意义。
孙曙[7]（2016）在《抑制性中性粒细胞亚群与肾移植术后临床状态的研究》文中认为背景及目的:中性粒细胞（Neutrophil granulocyte）是外周血中含量最为丰富的免疫细胞亚群,一般认为是固有免疫系统内抗外源性病原体的重要细胞。近来的研究表明,中性粒细胞会根据环境信号的改变分化成不同表型的细胞亚群,可以在多种水平参与调控固有及适应性免疫应答,并在缺血再灌注损伤、创伤、肿瘤和感染等疾病的发病中发挥重要的作用。肾移植术后受者需长期口服免疫抑制剂,主要针对适应性免疫应答,尤其是T细胞的功能,而中性粒细胞等固有免疫细胞涉及较少。近年来随着研究的深入,固有免疫细胞在肾移植术后免疫功能维持过程中的作用逐渐受到重视。近来在肿瘤、HIV感染以及自身免疫性疾病过程中体内存在一个中性粒细胞亚群,该亚群在密度梯度离心分离外周血细胞过程中,与外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell）在同一层面,其密度低于与红细胞在同一层面的常规密度中性粒细胞（normal density granulocytes）,称之为低密度粒细胞（low-density granulocytes,LDGs）,通过表型鉴定发现,该亚群属于成熟并活化的中性粒细胞,在体外实验中发现其可抑制T细胞反应。最近在人实验性内毒素血症体外模型中发现了一个具有抑制性免疫功能的中性粒细胞亚群,其表型为CD15+CD16bright/CD62Ldim CD11b+CD11c+,目前研究证实其可以通过CD11b与T细胞相互作用,并可以通过表达Arg-1或CD274（PD-L1）以及在免疫突触释放过氧化氢等方式抑制T细胞的活化。在HIV感染并出现T细胞功能障碍的患者中发现,中性粒细胞表达CD274与免疫抑制状态有关,但并不局限于CD16+CD62Ldim 亚群。既往的器官移植研究多集中于T细胞、B细胞以及树突状细胞等,而对固有免疫细胞中的中性粒细胞涉及极少。近年来发现中性粒细胞具有不同的亚群,且参与了免疫调控,可以介导对T细胞的免疫抑制,提示中性粒细胞是免疫反应活跃的参与者,可能参与了肾移植术后免疫状态的维持。因此,本研究拟通过观察中性粒细胞抑制性亚群在肾移植术后不同临床状态下的表达,以期明确中性粒细胞抑制性亚群是否参与了肾移植术后免疫平衡的维持,以及明确其是否可以用于肾移植术后免疫状态的监测,为临床治疗提供参考和依据,并为下一步研究奠定基础。1、观察肾移植术后受者外周血ldgs在术后早期、发生移植肾功能延迟恢复（delayedgraftfunction,dgf）、感染和排斥反应冲击治疗过程中表达比例的变化,通过密度梯度离心方法分离外周血单个核细胞,并通过流式细胞术观察肾移植术后早期以及感染、dgf、排斥反应等各种不同临床状态下受者外周血ldgs表达比例的变化趋势。以揭示其在肾移植术后早期的表达与受者不同临床状态及移植肾功能之间的关系。2、通过流式细胞术分析肾移植术后不同临床状态下CD16bright/CD62ldim中性粒细胞亚群比例变化趋势,以及中性粒细胞CD15、CD16、CD11b、CD274等分子的表达。观察肾移植术后不同临床状态下CD16bright/CD62ldim中性粒细胞亚群比例变化趋势,以及CD15、CD16、CD11b、CD274等分子的表达,并根据CD16/CD62l区分不同的中性粒细胞亚群,以期发现与肾移植术后免疫平衡状态相关的抑制性中性粒细胞亚群,如CD16bright/CD62ldim中性粒细胞亚群比例变化及效应分子CD274表达的情况。结果:1、肾移植受者术后早期出现ldgs比例提高,并且术后早期发生dgf时也表达高水平的ldgs,两者之间无统计学差异（p>0.05）,提示术后早期存在的供体肾缺血再灌注损伤以及早期给予的免疫诱导等治疗可能参与了ldgs比例提高;术后发生cmv感染及非cmv感染受者ldgs比例显着高于稳定期受者（p<0.01,p<0.05）,由于cmv感染时中性粒细胞和内皮细胞损伤是首当其冲被感染的细胞,因此感染过程中伴随中性粒细胞亚群的改变;术后发生排斥反应给予冲击治疗过程中,冲击后肾功能恢复的患者ldgs表达上调,明显高于正常对照和稳定期受者（p<0.001,p<0.01）,提示ldgs表达变化与冲击治疗有关,与肾功能恢复及排斥反应本身关系并不明确;通过表型分析,在术后不同临床状态的ldgs均为中性粒细胞。2、肾移植术后受者CD16bright/CD62ldim中性粒细胞亚群在不同临床状态下表达比例有显着差异（p<0.0001）,正常恢复组该亚群比例显着高于健康对照组（p<0.001）和稳定期对照组（p<0.001）,正常恢复组该亚群比例显着高于dgf组（p<0.01）,可能与dgf组受者免疫抑制剂剂量较低,或较强的缺血再灌注损伤对中性粒细胞的激活作用有关;CD16bright/CD62ldim中性粒细胞亚群比例在发生排斥反应给予冲击治疗过程中与正常对照和稳定期对照比较有显着差异（p<0.01）,与排斥反应冲击前相比,在肾功能恢复组该亚群比例显着升高（p<0.01）,并高于冲击治疗后肾功能未恢复组（p<0.05）,该亚群中性粒细胞可通过多种途径抑制t细胞反应,其比例升高,可能有利于排斥反应的控制;CD16bright/CD62ldim中性粒细胞亚群在发生cmv感染时的表达显着高于稳定期对照组方法:（P<0.001）,并随着治疗时间的延长,其表达比例逐渐下降。提示治疗过程中调整免疫抑制剂使用提高了抗CMV感染免疫水平。分析中性粒细胞相关表型发现,CD16表达在各组间有显着差异（P<0.01）,两组间比较时,CMV感染组的CD16 MFI表达显着低于排斥反应冲击治疗后肾功能未恢复组（P<0.01）,可能是冲击治疗过程中大剂量糖皮质激素动员骨髓池中的中性粒细胞较多,而CMV感染组受者多处于过度抑制状态,尤其是骨髓抑制状态下更不利于中性粒细胞的动员,导致来自骨髓动员的CD16中性粒细胞较少;CD274表达于外周血,并不局限于LDGs及CD16bright/CD62Ldim 中性粒细胞亚群,中性粒细胞在受者发生排斥反应给予冲击治疗有效时可高表达CD274,该分子的表达可能与排斥反应恢复过程中免疫平衡有关。结论:1、肾移植术后稳定组和健康对照组受者外周血PBMC中LDGs亚群比例较低,两者无统计学差异;而肾移植术后外周血PBMC中LDGs亚群比例提高,与是否出现DGF等并发症无关,并随着肾移植术后恢复,其比例在术后3-4周下降,可能与缺血再灌注损伤和中性粒细胞的半寿期较短有关;排斥反应冲击治疗后外周血PBMC中LDGs亚群比例增加,可能与冲击治疗有关;2、肾移植术后早期恢复受者外周血表达CD16bright/CD62Ldim 亚群比例高于术后发生DGF患者,健康对照组和肾功能稳定组受者外周血该亚群中性粒细胞比例较低;3、肾移植术后受者发生排斥反应时外周血中性粒细胞CD16bright/CD62Ldim 亚群比例降低,甚至低于稳定期受者,而给予冲击治疗并恢复的受者该亚群比例较高,冲击后未恢复的受者该亚群比例较低。提示该亚群与免疫抑制程度有关,该亚群的表达上调有利于控制排斥反应;4、CMV感染时,中性粒细胞CD16bright/CD62Ldim 亚群比例明显高于稳定期对照,与免疫抑制状态下易发生CMV感染等机会性感染有关。并且在治疗过程中调整免疫抑制剂用量,该细胞亚群比例增加;5、中性粒细胞稳定期受者及感染、排斥反应等过程中不表达CD274,而受者在排斥反应给予冲击治疗有效后高表达CD274,提示CD274表达可能参与了控制排斥反应的过程。
胡克邦[8]（2014）在《Treg/Th17/Th1细胞及其细胞因子在肾移植排斥反应中的机制研究及临床意义》文中研究指明背景：肾功能衰竭是一种常见的临床疾病。近年来随着移植免疫的深入研究和新型免疫抑制剂的临床应用，其预后得到了明显改善，早期存活率大幅度提高，因此肾移植被认为是治疗终末期肾病患者的有效方法，备受关注，但是术后免疫排斥反应的发生仍然是影响移植肾长期存活的危险因素。因此进一步研究肾移植受者体内移植排斥的具体机制以及寻找一种能够有效监测移植肾功能状态的临床指标，将具有十分重要的临床意义。目的：通过检测移植治疗前后过程中移植肾受者外周血中的调节性T细胞，效应性T细胞及其血清中细胞因子IL-2，IFN，TNF，IL-4，IL-6和IL-10的表达水平，并与临床指标之间进行相关性分析，探讨这些免疫细胞及细胞因子在移植后免疫排斥发病机制中的作用，进一步评估其在临床意义。方法：通过流式细胞技术检测肾移植治疗前后患者和健康人外周血调节性T细胞和效应性T细胞亚型及其相关细胞因子的表达，采用微量样本多指标流式蛋白定量技术（CBA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-2，IFN，TNF，IL-4，IL-6和IL-10细胞因子的含量，并分析其与临床指标之间的关系。临床指标中血细胞计数、血沉、肌酐、尿素氮、肾小球滤过率等均由检验科专科医生完成。结果：1.终末期肾衰竭患者外周血中CD4+CD25-Foxp3+T细胞数量较健康对照组明显增加，而CD4+CD25+Foxp3+和CD4+CXCR5+Foxp3+T细胞数量与健康对照组无明显变化；2.在移植后，与移植前以及健康对照组相比，肾功能稳定组外周血中CD4+CD25+Foxp3+T细胞和CD4+CXCR5+Foxp3+T细胞数量明显增高，而肾功能稳定组患者外周血中CD4+CD25-Foxp3+T细胞数量明显减少；3.在移植后，急性排斥反应组和亚急性排斥反应组患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+T和CD4+CXCR5+Foxp3+T细胞数量明显低于移植前和健康对照组，而移植后CD4+CD25-Foxp3+T细胞数量高于移植前和健康对照组；而与亚急性排斥反应组相比，急性排斥反应组患者外周血中的CD4+CD25-Foxp3+T细胞明显增多，CD4+CD25+Foxp3+和CD4+CXCR5+Foxp3+T细胞明显减少；4.终末期肾衰竭患者外周血中CD4+IFN-γ-IL-17+Th17，CD4+IFN-γ+IL-17-Th1和CD4+IFN-γ+IL-17+Th1/17T细胞数量较健康对照组明显增加；5.在移植后，与移植前相比，肾功能稳定组外周血中CD4+IFN-γ-IL-17+Th17,CD4+IFN-γ+IL-17-Th1与CD4+IFN-γ+IL-17+Th1/17细胞数量明显减少；而外周血中CD4+CD25+Foxp3+T细胞数及其与CD4+IFN-γ-IL-17+Th17细胞比例增高；6.在移植后，在急性排斥反应组和亚急性排斥反应组患者外周血中CD4+IFN-γ-IL-17+Th17，CD4+IFN-γ+IL-17-Th1和CD4+IFN-γ+IL-17+Th1/17T细胞数量明显高于移植前和移植稳定组；此外，急性排斥反应组患者外周血中的CD4+IFN-γ-IL-17+Th17, CD4+IFN-γ+IL-17-Th1和CD4+IFN-γ+IL-17+Th1/17T细胞数量低于亚急性排斥反应组；7.终末期肾衰竭患者血清中IL-2，IFN-γ，TNF-α，IL-4，IL-6，IL-10及IL-17的浓度较健康对照组明显增加；8.在移植后，与移植前以及稳定组相比，各组移植排斥组患者血清中IL-2，IFN-γ，TNF-α和IL-17浓度更高，IL-10浓度更低；而血清中IL-4和IL-6的浓度在各移植组前后无显着差异；9.在移植后，与亚急性排斥反应组和慢性排斥组相比，急性排斥反应组患者血清中IL-2，IFN-γ，TNF-α和IL-17浓度更高，IL-10浓度更低，而血清中IL-4和IL-6的浓度在各组移植前后无显着差异；10.相关性分析显示各组移植患者血清中IL-17和IFN-γ浓度分别与CD4+IFN-γ-IL-17+Th17细胞数和CD4+IFN-γ+IL-17-Th1细胞数呈正相关，此外，各组移植患者外周血中的CD4+CD25+Foxp3+T细胞与CD4+IFN-γ-IL-17+Th17细胞的数量呈负相关；11.相关性分析显示各组移植患者中外周血中CD4+CD25+Foxp3+和CD4+IFN-γ-IL-17+Th17细胞分别与eGFR和血清肌酐水平呈正相关；血清中TNF-α和IL-17水平与血清肌酐水平呈正相关；相反，各组移植患者血清中IL-10浓度与血清肌酐水平呈负相关。结论：1.调节性T细胞在肾脏移植排斥反应中起着重要的作用；2.效应性T细胞及其分泌的效应细胞因子（IL-2，IFN-γ，TNF-α，IL-4，IL-6，IL-10及IL-17）可能参与肾脏移植排斥反应的发病过程；3.在各组肾移植排斥反应组中Treg细胞与Th17/Th1细胞呈负相关性；4.在肾脏移植后，各组肾移植受者血清中CD4+T细胞分泌的细胞因子的浓度与血清肌酐浓度具有一定的相关性，表明血清中细胞因子水平在移植排斥反应中可以作为一项临床监测指标，为预防抑制排斥反应的发生提供了新的思路，具有一定的临床意义。
李国文[9]（2014）在《监测T淋巴细胞亚群在评估肾移植术后免疫状态的临床意义》文中研究指明治疗慢性肾功能衰竭终末期的有效方法是同种异体肾移植术。随着免疫抑制药物的不断更新和发展,肾移植术后出现急性排斥反应的概率逐渐减少,移植肾的存活率得到了大大提高。但一直以来,由于肾移植后没有准确的监测免疫功能的指标；如何客观并准确地评估移植后患者的免疫状态,在免疫抑制不足和免疫抑制过度之间取得平衡,从而指导免疫抑制药物的个体化合理应用已经成为移植医生需要研究及迫切解决的一个重要问题。临床目前常通过有创手段和非侵入手段监测肾移植术后免疫状态,包括受体的全身情况、血肌酐、彩色多普勒超声、免疫抑制剂的血药浓度监测、移植物穿刺组织病理学检查等。但是血肌酐敏感度和特异性较差,对临床上的预防及治疗等意义不大;彩色多普勒超声受到超声诊断医生主观影响较大；目前临床上评估免疫状态的常用手段是监测免疫抑制剂的血药浓度,但是由于不同受者的体内药物代谢存在着个体差异,且机体内多种因素都可以影响免疫抑制药物的血药浓度,许多术后患者仍不可避免排斥反应的发生；而移植物穿刺组织病理学检查是一种有创性检查,对患者具有一定的风险性,不易反复监测。鉴于上述情况,本次研究拟通过检测移植肾受者外周血T淋巴细胞亚群的变化来评估受者的免疫状态。比较健康者、尿毒症期患者和术后肾功能稳定受者外周血T细胞的差异,了解移植术前与术后免疫状态之间的变化,同时比较肾功能稳定受者、急性排斥和感染时外周血T细胞的差异,意在证明T细胞在肾移植术后监测其免疫状态变化的意义；最后通过前瞻性分析和比较从围手术期到术后6月采用T细胞监测组患者与未采用T细胞监测的患者之间急性排斥、感染的发生率,以验证动态监测T细胞有助于了解移植术后的免疫状态,为指导临床个体化用药提供依据。第一章比较T细胞在健康者、尿毒症期患者和术后肾功能稳定者之间的不同目的本部分通过流式细胞术检测尿毒症期患者和肾功能稳定受者外周血T细胞的比例,并结合受者的状况,与健康人群进行比较,观察肾移植术前与术后T细胞的变化规律。方法以慢性肾功能不全尿毒症期患者、术后肾功能稳定患者各25例作为研究对象,并随机选取健康正常者25例为对照组,通过流式细胞仪技术检测患者的T淋巴细胞亚群,比较三组中T淋巴细胞亚群的不同。采用SPSS13.0软件对所得数据进行分析。研究中所得数据均经过正态性检验及方差齐性检验,以均数±标准差（mean±SD）表示。计量资料两组间均数比较采用t检验或秩和检验；多组间均数比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有显着性意义。结果①CD3+T淋巴细胞的百分比在健康组、尿毒症组与术后稳定组三组间的差异无统计学意义（P>0.05）。CD3+CD4+T淋巴细胞的百分比在健康组和尿毒症期组间无明显差异（P>0.05）,而二组分别与术后肾功能稳定组比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。CD3+CD8+T淋巴细胞的百分比在健康组、尿毒症组与术后稳定组三组间的差异无统计学意义（P>0.05）。同样, CD3+CD4+/CD3+CD8+在健康组、尿毒症期组和术后稳定组三组之间无明显差异（P>0.05）。②在健康组中CD3+CD4+T淋巴细胞计数与尿毒症组的差异无统计学意义（P>0.05）,而分别与术后稳定组比较,差异有统计学意义（P>0.05）。CD3+CD8+T淋巴细胞计数在健康组、尿毒症组与术后稳定组三组间的差异无统计学意义（P>0.05）。结论首先,免疫抑制药物对移植受者外周血CD3+CD4+T细胞有影响；其次,血清肌酐水平、腹膜透析、血液透析及输血等内科相关治疗对T淋巴细胞的变化影响较小。第二章比较T细胞在肾移植术后不同免疫状态之间的变化目的本部分通过流式细胞术检测肾功能稳定受者、急性排斥反应受者及感染时患者外周血T细胞的比例,并结合受者的具体状况,比较三组患者外周血T细胞亚群的差异,观察肾移植术后不同免疫状态下T细胞亚群的变化规律。方法纳入69例因慢性肾功能衰竭（尿毒症期）接受同种异体尸体供肾和亲属活体供肾肾移植手术的术后患者,所选患者均术后两周内血肌酐下降至正常水平,术中未发生超急性排斥,检测期间患者未出现其他影响患者免疫状态的疾病（如发生肿瘤或肾小球肾炎复发）。根据患者入院时不同的病情分为3组,即术后肾功能稳定组（n=25）,急性排斥组（n=23）和肺部感染组（n=21）,供受者ABO血型相同,淋巴细胞毒性试验<10%,受者群体反应性抗体<15%,人类白细胞抗原错配数均少于4个。通过流式细胞仪技术检测三组患者的T淋巴细胞亚群,比较三组中T淋巴细胞亚群的差异。采用SPSS13.0软件对所得数据进行分析。研究中所得数据均经过正态性检验及方差齐性检验,以均数±标准差（mean±SD）表示。计量资料两组间均数比较采用t检验或秩和检验；多组间均数比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有显着性意义。结果①纳入试验患者一般性资料分析：3组患者在性别、年龄及主要免疫抑制剂构成上均无显着性意义（P>0.05）,具有可比性。②CD3+T淋巴细胞的百分比在稳定组、急性排斥组与感染组三组间的差异无统计学意义（P>0.05）。CD3+CD4+T淋巴细胞的百分比在术后急性排斥反应组中最高,与移植术后肾功能稳定组比较,差异均有统计学意义（P<0.05）；而在感染组的CD3+CD4+T淋巴细胞的百分比为三组中最低,与移植术后肾功能稳定组比较,差异有统计学意义（P<0.05）. CD3+CD8+T淋巴细胞的百分比在急性排斥反应组中为最低,与移植术后肾功能稳定组比较,差异有统计学意义（P<0.05）；而在感染组中,CD3+CD8+T淋巴细胞的百分比为三组中最高,与移植术后肾功能稳定组比较,同样差异也有统计学意义（P<0.05）。CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值在急性排斥反应组中最高,感染组中最低,两组与移植术后肾功能稳定组比较,差异均有统计学意义（P<0.05, P<0.05）。CD3+CD4+T淋巴细胞计数在术后急性排斥反应组中最高,与移植后肾功能稳定组比较,差异有统计学意义（P<0.05）；而在感染组的CD3+CD4+T淋巴细胞计数为三组中最低,与移植术后肾功能稳定组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。CD3+CD8+T淋巴细胞计数在急性排斥反应组分别于移植后肾功能稳定组、感染组比较,差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.05）。③CD3=T淋巴细胞的百分比在感染治疗前后的差异无统计学意义（P>0.05）。肺部感染在调整免疫抑制方案、抗感染等对症及支持治疗后症状改善时,CD4+的百分比由19.87±7.95升高至38.42±7.69,差异有统计学意义（P<0.05）; CD8+的百分比由46.76±8.58降低至35.28±7.15,差异有统计学意义（P<0.05）；CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值由0.36±0.74升高至1.25±0.68,差异也有统计学意义（P<0.05）。CD3+CD4+T淋巴细胞计数由208±151（个/ul）升高至462±179（个/ul）,差异有统计学意义9P<0.05)；CD3+CD8+T淋巴细胞计数由316±182（个/ul）升高至393±187（个/ul）,差异有统计学意义（P<0.05）。④CD3+T淋巴细胞的百分比在抗排斥治疗前后之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。而急性排斥在激素冲击等一系列治疗后症状改善时,CD3+CD4+的百分比由49.14±7.81降低至38.26±9.25,差异有统计学意义（P<0.05）；CD3+CD8+的百分比由21.37±8.26升高至39.83±7.85,差异有统计学意义（P<0.05）；CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值由2.53±0.68降低至1.45±0.84,差异也有统计学意义（P<0.05）.CD3+CD4+T淋巴细胞计数由697±189（个/ul）降低至546±205（个/ul）,差异有统计学意义（P<0.05）；CD3+CD8+T淋巴细胞计数由363.7±199.6（个/ul）升高至415.4±216.4（个/ul）,差异有统计学意义（P<0.05）。结论①CD3+CD4+T淋巴细胞与移植物排斥反应和感染的发生密切相关。②动态观察T淋巴细胞亚群的变化,特别是CD3+CD4+T淋巴细胞计数的变化规律有助于指导临床上的免疫抑制剂用药。第三章采用T细胞监测的肾移植受者与未采用T细胞监测的受者之间术后并发症的比较目的本部分通过监测T细胞亚群绝对计数的变化,评估受者术后免疫状态情况,并依此适当调整免疫抑制剂用药及相关对症治疗,验证T细胞亚群有助于指导肾移植术后的用药方案。方法纳入因慢性肾功能衰竭终末期行同种异体肾移植术52例患者,根据患者围手术期至术后6月内有无采用T淋巴细胞监测免疫状态情况,可分为T细胞监测组（术前1d及术后3月内每周测定T淋巴细胞亚群,并根据亚群变化调整免疫剂用药方案）；未采用T细胞监测的为对照组。详细记录入选受者术后3月内的信息,包括：性别、年龄、体重、供体类别、配型、免疫诱导治疗、基础免疫抑制方案、血清肌酐（Scr）、移植肾功能延迟恢复（DGF）、急性排斥反应（AR）、感染、人/肾存活等临床资料；在术前、术后3月内每周行CD3+CD4+T细胞计数检测,根据CD3+CD4+T细胞计数水平调整免疫诱导和基础免疫抑制剂方案,根据既往的参考文献和我们的经验将CD3+CD4+T细胞计数目标值控在300-500个/μL或术前水平的60%-80%。观察每组患者急性排斥反应和感染的概率,对两组患者急性排斥反应和感染的发生率进行比较。统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计学分析,计量资料采用均数士标准差表示,率间比较采用X2检验,均数比较采用独立样本t检验,等级资料比较采用秩和检验,小样本采用Fisher确切概率法,统计学的显着性水准定为0.05。结果①纳入试验患者在性别、年龄、体重、HLA配型、供体类型、基础免疫抑制方案、抗体诱导治疗和DGF发生率方面的差异无统计学意义。②监测组和对照组术后1月平均肌酐水平分别为140.8±22.0μmol/L和153.5.4±25.5μmol/L,术后6月为145.6±37.6μmol/L和149.2±59.1μmol/L,术后1月和6月两个时间点两组之间无统计学差异。③监测组急性排斥反应事件发生率低于对照组,而感染事件发生率,两组间无统计学差异。结论动态监测T细胞的绝对计数有助于了解移植术后的免疫状态,对临床用药有指导意义。
周玉侠[10]（2011）在《急性移植排斥反应过程中MHC-I表达变化的实验研究与临床应用》文中研究说明背景器官移植是20世纪伟大的科学创举,器官移植的广泛开展挽救了无数终末期器官功能衰竭患者的生命。然而,器官移植技术仍存在诸多问题,使得移植后的器官不能正常发挥功能。移植后的急性排斥反应（AGR）是移植物功能降低甚至丧失的主要原因,也是导致慢性排斥反应的主要因素。尽早及时的发现急性排斥反应,并采取有效的措施加以控制,可挽救移植物或延长移植物寿命。目前移植物的病理组织学检查仍然是判断急性排斥反应的金标准。然而,由于病理组织学检查存在创伤性、操作复杂、费用昂贵、不适合重复操作等缺点,不能作为临床常规检查手段。目前常用的一些无创性检查方法,包括影像学、生化学检查以及抗体检测等,由于其在准确性、敏感性、特异性方面的不足而没能广泛应用于临床。至今为止,没有一种用于判断急性排斥反应的简单、无创性的检查方法获得大家的认可。主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）,是位于哺乳动物某一染色体的一组紧密连锁的基因群,其产物的主要作用是参与抗原递呈和T细胞激活,在免疫应答和免疫调节中执行重要而广泛的功能。人类MHC又称人类白细胞抗原复合体（human leucocyte antigen, HLA）。经典的MHC分子具有高度的多态性,正是由于移植供受者间这种MHC分子的不匹配导致了移植排斥反应的发生。也就是说MHC是启动移植排斥反应的靶抗原,是移植免疫的主角。在移植免疫研究领域,人们往往把目光集中在移植物MHC分子以及宿主血清中针对移植物的抗体上。但作为体内表达MHC-Ⅰ类分子最丰富的细胞,淋巴细胞尤其是T淋巴细胞MHC-Ⅰ类分子的功能研究却较少见。已有研究表明,外周血淋巴细胞表面HLA-A、B mRNA以及其相应蛋白的表达随年龄老化而降低,可以作为机体免疫功能衰退的指标；CD4+T细胞表面MHC-Ⅰ类分子可以延长CD4+T细胞的存活时间；记忆性T细胞表面MHC-Ⅰ类分子的表达对其自身具有保护作用。我们前期工作利用RNAi技术封闭淋巴细胞表面MHC-Ⅰ分子,发现淋巴细胞的增殖和杀伤活性均降低。另外我们前期对近交系小鼠皮肤移植模型的研究发现,当发生急性排斥反应时小鼠外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ基因中的H-2K、H-2D基因转录mRNA表达升高。那么MHC-Ⅰ蛋白作为行使功能的分子,与急性排斥反应的关系如何?以及其在临床上的应用如何?CD4+T细胞和CD8+T细胞哪个亚群细胞表面MHC-Ⅰ的表达更能代表急性排斥反应的发生?MHC-Ⅰ蛋白和MHC-ImRNA两者谁更利于急性排斥反应的早期发现?类似问题有待于我们进一步研究。为了系统的研究MHC-Ⅰ分子在急性移植排斥反应全过程中的变化规律,本研究首先采用近交系小鼠皮肤移植模型,研究了移植前、移植后不同时间点小鼠外周血淋巴细胞MHC-ImRNA的表达及外周血CD4+、CD8+T细胞亚群MHC-K、移植物MHC-Ⅰ分子的表达变化,分析了MHC-Ⅰ分子的表达水平与移植排斥全过程的对应关系。进而动态监测了临床上包括移植术后稳定和移植术后发生急性排斥的共53例肾移植患者外周血CD4+、CD8+T细胞MHC-Ⅰ分子的表达情况,从动物和临床两方面探讨了MHC-Ⅰ作为判断急性移植排斥反应指标的可行性。目的1.构建近交系小鼠皮肤移植模型,从而获得急性移植排斥反应的全过程,研究急性移植排斥反应时外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ的表达规律,探讨外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ表达与急性移植排斥反应病理分级之间的对应关系。2.对外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ基因的mRNA和蛋白两个水平进行研究,分析两水平表达趋势是否一致,哪一个水平的表达变化更能反映急性移植排斥反应。3.分别检测CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞表面MHC-Ⅰ分子的表达变化,分析MHC-Ⅰ分子的表达变化在两群细胞间是否存在差别。4.与T细胞活化指标MHC-Ⅱ比较,探讨MHC-Ⅰ分子作为判断急性移植排斥反应的可行性。5.动态检测肾移植患者术前和术后不同时间外周血单个核细胞HLA-I mRNA表达变化以及CD3+CD4+细胞和CD3+CD8+细胞HLA-Ⅰ蛋白水平的表达变化,对比排斥组和稳定组之间的差异,进一步探讨在临床肾急性移植排斥反应中HLA-I的诊断价值。方法1.实验小鼠分组：把270只BALB/C（简称BA）小鼠随机分为三组,分别是移植用药组（应用免疫抑制剂）、移植未用药组以及单纯感染组。用药组和未用药组又分为非手术组、同系移植组和异系移植组。用药非手术组即为用药术前对照组,未用药非手术组即为未用药术前对照组。用药组的设立是为了模拟临床采用了皮质激素（Horm）、环孢素A（CsA）及霉酚酸酯（MMF）中等剂量三联用药。采用肠球菌注射正常小鼠腹腔建立肠球菌小鼠腹膜炎模型既为细菌感染组。同系移植采用BA小鼠个体之间进行皮肤移植,异系移植以C57BL/6（简称C57）小鼠为供体,BA小鼠为受体,进行小鼠皮肤移植。每两天为一个时间点,分别为术后2、4、6天……,用药移植组小鼠观察到术后26天,未用药移植组小鼠观察到术后16天。2.构建小鼠皮肤移植模型以及标本的留取：以C57小鼠为供体,BA小鼠为受体,采用经典的小鼠背—背皮肤移植手术方法,建立小鼠皮肤移植动物模型。移植后每隔一天（每两天）对小鼠状态进行全面分析,每个时间点6只小鼠,进行以下操作：记录移植前和移植术后各时间点小鼠移植皮片的肉眼变化；通过眼球取血采集小鼠血液到EDTA-K2抗凝血常规管中备用；采血的同时取移植皮片组织用4%多聚甲醛固定,用于组织病理学检测和免疫组化检测。对正常组和细菌感染组小鼠收集血液备用。3.小鼠血液标本的检测：采用三色流式细胞技术检测小鼠外周血不同亚群T细胞：CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞表面MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子的表达；采用实时荧光定量RT-PCR技术检测小鼠外周血淋巴细胞MHC-ⅠmRNA,MHC-ⅡmRNA的表达变化；分析外周血淋巴细胞MHC-ⅠMHC-Ⅱ在AGR全过程中的变化规律,以及免疫抑制剂对上述指标表达水平的影响。4.小鼠移植皮片标本的检查：对留取的所有时间点的皮肤组织进行常规病理切片,H-E染色后观察移植皮片淋巴细胞浸润等组织学变化,根据病理组织学改变将术后不同天数的移植物排斥反应发生的程度分为Ⅰ-Ⅳ级,记录移植物病理排斥动态变化。对比用药和不用药对移植物病理组织学改变和存活时间的影响。采用免疫组织化学染色法检测小鼠移植皮片中组织细胞和浸润淋巴细胞MHC-Ⅰ的表达,观察急性移植排斥反应发生时小鼠移植皮片中MHC-Ⅰ表达强度的变化。5.临床肾移植患者：根据移植术后3个月之内是否发生过急性移植排斥反应,把肾移植患者分成稳定组和排斥组。收集肾移植稳定组患者术前和术后3天、7天……3月和大于3个月的血液标本和肾移植排斥组患者排斥前、排斥当天、抗排斥治疗后3天、7天、14天的血液标本,采用流式细胞技术对外周血中CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞表面的HLA-Ⅰ（MHC-Ⅰ）分子进行检测。采用实时荧光定量PCR技术对外周血淋巴细胞HLA-ImRNA进行检测。比较稳定组和排斥组的差异,初步从临床角度评价HLA-Ⅰ对于急性移植排斥反应的诊断价值。结果1.移植皮片的肉眼及病理组织学结果95%小鼠在实验过程中都有体重增长,其余5%在实验中被排除。同系移植组小鼠皮肤移植物生长良好,移植物缝合部位逐渐愈合,皮片柔软红润。在异系未用药组和异系用药组,移植物逐渐变暗、变黑,80%移植物坏死时发生在术后第10天和第22天。移植皮片经H-E染色,按照淋巴细胞浸润和皮肤组织坏死程度将急性排斥反应分为轻度（Ⅰ级）、中度（Ⅱ级）、重度（Ⅲ级）和极重度（Ⅳ级）四个等级。结果显示：随术后时间的延长,异系移植皮片淋巴细胞浸润逐渐增强。不用药情况下,病理Ⅰ-Ⅳ级排斥反应分别发生于术后2-4天、4-8天、8-12天和12-16天。用药情况下,淋巴细胞浸润时间延迟,病理排斥Ⅰ-Ⅳ级分别发生于2-8天、8-14天、14-20天、20-26天。同系移植皮片中很少淋巴细胞浸润,移植病理分级为0或Ⅰ级。2.未用药情况下,移植术后MHC-Ⅰ的表达变化同系移植组,术后各时间点外周血、皮肤移植物MHC-Ⅰ的表达变化不明显,与术前基本保持一致,而异系移植组在术后各时间点呈现出不同的变化。外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ的表达情况：CD3+CD8+细胞MHC-Ⅰ膜蛋白在术后6天表达明显升高,表达强度约为术前的1.3倍（MFI从术前219升高到290）,升高一直持续到术后12天,术后14天MHC-Ⅰ膜蛋白表达回复到术前水平,升高的时段与病理Ⅱ-Ⅲ级对应；CD3+CD4+细胞MHC-Ⅰ膜蛋白升高开始的时间比CD3+CD8+细胞早2天,但其表达趋势和表达强度与CD3+CD8+细胞基本一致；实时荧光定量RT-PCR检测MHC-ImRNA表达与流式细胞术检测CD4+细胞MHC-Ⅰ膜蛋白表达规律一致。异系移植术后4天,外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ表达明显升高,术后6天达峰值,约为术前的4倍（从术前1.38升高到5.96）,表达升高一直持续到术后12天,术后14天恢复到术前水平。免疫组化检测结果：所有小鼠移植皮片组织细胞、血管内皮细胞及浸润淋巴细胞均呈阳性表达,但当排斥反应发生时,移植物MHC-Ⅰ表达明显增强。3.应用免疫抑制剂情况下,移植术前及术后MHC-Ⅰ的表达变化在移植手术前,与未用药相比,用药后MHC-ⅠmRNA及蛋白表达水平降低,说明免疫抑制剂对MHC-Ⅰ的表达有抑制作用。同系移植组,术后各时间点外周血、皮肤移植物MHC-Ⅰ的表达变化不明显,与术前基本保持一致。而异系移植组在术后各时间点呈现出不同的变化。外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ的表达情况：CD3+CD8+细胞MHC-Ⅰ膜蛋白在术后12天表达明显升高,术后16天达峰值,表达强度约为术前的1.3倍（MFI从术前169升高到228）,升高一直持续到术后22天,术后24天MHC-Ⅰ膜蛋白表达回复到术前水平,升高的时段与病理Ⅱ-Ⅲ级对应；MHC-Ⅰ膜蛋白在CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞上表达趋势和表达强度基本一致,CD3+CD4+细胞MHC-Ⅰ升高开始的时间比CD3+CD8+细胞早4天；实时荧光定量RT-PCR检测mRNA表达与流式细胞术检测CD3+CD4+细胞膜蛋白表达趋势一致。异系移植术后8天,外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ表达开始升高,术后16天达峰值,相对表达量约为术前的9倍（从术前0.58上升为5.76）,然后逐渐下降到术后24天恢复到术前水平。免疫组化检测结果：所有小鼠皮片组织细胞、血管内皮细胞及浸润淋巴细胞均呈阳性表达,与未用药组比较,表达强度减弱。但当急性排斥反应发生时,移植物MHC-Ⅰ表达增强。4.感染组小鼠外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表达变化与正常对照组相比,感染组小鼠在腹腔注射肠球菌8小时时,外周血白细胞总数升高,外周血淋巴细胞MHC-ⅡmRNA和蛋白表达增强,但外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ无论在mRNA水平还是蛋白水平的表达都没有明显的变化,说明感染性疾病不影响MHC-Ⅰ的表达。5.外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ在急性移植排斥反应过程中表达变化的比较外周血淋巴细胞MHC-ⅡmRNA表达：在同系移植组,术后各时间点MHC-Ⅱ表达与术前相比,差异无统计学意义。在未用药组,MHC-Ⅱ在术后4天开始升高,术后6天达峰值,约为术前的2.1倍（从术前1.29升高到2.71）,术后14天降到术前水平。应用免疫抑制剂的情况下,MHC-Ⅱ在术后8天开始升高,术后24天恢复术前水平。与MHC-Ⅰ表达相比,MHC-Ⅱ升高幅度较小。外周血淋巴细胞MHC-Ⅱ膜蛋白的表达：在未用药组,仅在术后6天和8天时升高,在用药组,仅在术后12、14、16天表达升高,与MHC-Ⅰ相比,升高开始时间晚、升高持续时间短。6.肾移植患者术前、术后以及发生移植排斥时MHC-Ⅰ表达变化稳定组：CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞HLA-Ⅰ膜蛋白表达趋势相同。术后一周内淋巴细胞HLA-Ⅰ表达稍有升高,升高幅度较小,约为术前的1.3倍,到术后2周时,恢复到术前水平。外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ转录水平与膜蛋白水平趋势相同,但变化幅度较小。排斥组：与排斥前最后一次随访检测的HLA-Ⅰ表达水平相比,在排斥发生的当天,HLA-Ⅰ表达明显升高（排斥当天308.2 vs.术前110.9）,约为术前的2.7倍。应用免疫抑制剂冲击治疗3天后,HLA-Ⅰ表达明显下降,7天后,HLA-Ⅰ表达逐渐降低到术前水平。反复发生排斥反应的患者HLA-Ⅰ始终处于高表达水平,免疫抑制剂冲击治疗对HLA-Ⅰ的表达影响较小。结论1.动物实验研究发现在急性移植排斥的早期阶段,病理显示Ⅱ-Ⅲ级时,外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ蛋白和mRNA水平表达升高。与MHC-Ⅱ相比,MHC-Ⅰ表达升高开始时间早、升高持续时间长,升高变化幅度大。MHC-Ⅰ蛋白和（?）nRNA水平的表达变化均能及时预测急性移植排斥反应的发生。2.临床应用进一步证实肾移植急性排斥反应发生时,外周血淋巴细胞HLA-Ⅰ蛋白和mRNA水平表达升高,尤其是膜蛋白水平表达升高更为明显。外周血淋巴细胞表面膜蛋白HLA-Ⅰ水平可作为诊断急性移植排斥反应发生的无创性检测指标。
二、肾移植受者外周血白细胞淋巴细胞功能相关抗原-1表达的意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肾移植受者外周血白细胞淋巴细胞功能相关抗原-1表达的意义（论文提纲范文）
（1）造血干细胞微嵌合及工程化树突状细胞促进受者T细胞活化的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 异体造血干细胞输注形成微嵌合并刺激受者外周血T细胞的活化 |
| (一)材料和方法 |
| (二)实验结果 |
| (三)实验讨论 |
| 第二章 工程化DCs促进受者局部淋巴结T细胞活化 |
| (一)材料和方法 |
| (二)实验结果 |
| (三)实验讨论 |
| 第三章 外周血造血干细胞联合工程化DC抑制肿瘤生长 |
| (一)材料和方法 |
| (二)实验结果 |
| (三)实验讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述:米托蒽醌和柔红霉素在AML诱导化疗中的系统性综述和meta分析 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（2）滤泡辅助T细胞及单核/巨噬细胞来源的外泌体在肾移植术后抗体介导的排斥反应中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 CD4+CXCR5+外泌体与肾移植术后ABMR的相关性研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料及方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ABMR患者外周血Tfh来源外泌体对B细胞的影响 |
| 一、前言 |
| 二、材料及方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 单核细胞/巨噬细胞通过外泌体靶向递送HLA-G至内皮细胞 |
| 一、前言 |
| 二、材料及方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 外泌体在免疫应答中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章 |
| 致谢 |
（3）肾移植术后长期存活（＞20年）受者免疫状态评估（论文提纲范文）
| 主要缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（4）肾移植术后降钙素原与Th22和Th17细胞的临床相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 移植术后发生感染会影响移植物的长期存活 |
| 1.2 降钙素原是移植术后感染的一种有前景的生物标志物 |
| 1.2.1 降钙素原是评估感染的良好指标并逐步应用于移植领域 |
| 1.2.2 单个降钙素原指标对肾移植术后感染监测和评估存在不足 |
| 1.3 肾移植术后受者感染的诊断和干预需要综合考虑免疫调节因素 |
| 1.3.1 CD4+Th细胞在移植免疫中发挥重要的调节作用 |
| 1.3.2 Th17 细胞及细胞因子相关免疫调节的研究 |
| 1.3.3 Th22 细胞及其细胞因子相关免疫调节的研究 |
| 1.4 小结以及学术假说 |
| 1.5 本文的主要工作 |
| 1.6 本论文的结构安排 |
| 第二章 实验材料与研究方法 |
| 2.1 研究目的 |
| 2.2 研究路线 |
| 2.3 研究对象 |
| 2.4 实验材料 |
| 2.4.1 主要的实验耗材 |
| 2.4.2 主要的实验仪器 |
| 2.4.3 主要的实验试剂 |
| 2.4.4 主要试剂的配制 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 血浆的分离与保存 |
| 2.5.2 肾移植受者外周血单个核细胞的分离与提取 |
| 2.5.3 流式细胞术检测外周血细胞亚群 |
| 2.5.4 酶联免疫吸附试验 |
| 2.5.5 统计学处理 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 肾移植受者降钙素原与临床常规指标的研究 |
| 3.1 研究对象的基本资料 |
| 3.2 PCT分组下肾移植受者常规感染指标的变化 |
| 3.3 PCT分组下肾移植受者肾功能指标的变化情况 |
| 3.4 临床常用指标分组下CD4+T细胞亚群的频数变化 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 肾移植受者降钙素原与细胞亚群相关性研究 |
| 4.1 研究方法 |
| 4.2 Th22和Th17 细胞的流式圈门策略 |
| 4.3 PCT分组下细胞亚群的频数比较 |
| 4.3.1 PCT分组下CD4+T细胞与淋巴细胞的频数比较 |
| 4.3.2 移植受者IL22+CD4+T细胞的频数比较 |
| 4.3.3 移植受者Th17 细胞的频数变化 |
| 4.3.4 降钙素异常组中不同亚群间的相关性 |
| 4.4 降钙素分组下血浆细胞因子表达水平 |
| 4.4.1 肾移植受者IL-22 的表达 |
| 4.4.2 肾移植受者IL-17A的表达 |
| 4.4.3 TNF-α和 IL-6 在肾移植受者PCT分组的表达 |
| 4.5 细胞亚群与细胞因子的相关性分析 |
| 4.5.1 Th22 细胞与IL-22 细胞因子的相关性分析 |
| 4.5.2 Th22 细胞与TNF-α细胞因子的相关性分析 |
| 4.5.3 IL-22+Th17 细胞与IL-22 细胞因子的相关性分析 |
| 4.5.4 Th17 细胞与IL-17A细胞因子的相关性分析 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 本章小结 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 本研究的主要贡献以及局限性 |
| 5.3 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 |
（5）骨髓间充质干细胞对肾移植受者T淋巴细胞分化和miRNA-155表达的影响（论文提纲范文）
| 资料与方法 |
| 一、资料 |
| 二、方法 |
| 1. MSCs免疫诱导方案: |
| 2. 外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞/CD4+细胞亚群比值和测定: |
| 3. 外周血细胞因子浓度检测: |
| 4. 免疫磁珠分选外周血T淋巴细胞: |
| 5. Rea1-time PCR法检测外周血T淋巴细胞中mi RNA-155的表达: |
| 三、统计学分析方法 |
| 结果 |
| 一、MSCs对外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞/CD4+细胞亚群比值的影响 |
| 二、MSCs对外周血IL-2、TNF-α和IL-10浓度的影响 |
| 三、MSCs对肾移植术后外周血T淋巴细胞mi RNA-155表达的影响 |
| 讨论 |
（6）红细胞表面分子在肾移植术后免疫功能状态评价中的临床价值（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、红细胞CD35/CD58/CD59在肾移植受者中的表达变化 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 二、肾移植受者红细胞免疫功能与淋巴细胞亚群相关性及巨细胞病毒感染对红细胞CD35/CD58/CD59表达的影响 |
| （一）肾移植受者红细胞CD35/CD58/CD59与T、B淋巴细胞亚群的变化 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| （二）肾移植受者巨细胞病毒感染时红细胞CD35/CD58/CD59表达的变化 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 三、红细胞对T、B淋巴细胞影响的初步探讨 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 发表论着（一） |
| 发表论着（二） |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）抑制性中性粒细胞亚群与肾移植术后临床状态的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 低密度中性粒细胞与肾移植术后临床状态的研究 |
| 1. 材料及方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第二部分 抑制性中性粒细胞亚群与肾移植术后临床状态的研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读学位期间参与的科研课题 |
| 发表的论文 |
| 致谢 |
（8）Treg/Th17/Th1细胞及其细胞因子在肾移植排斥反应中的机制研究及临床意义（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 免疫学在器官移植方面的研究进展 |
| 1.1.1 同种异体肾移植 |
| 1.1.1.1 器官移植基础的发展历史 |
| 1.1.2 同种异体肾脏移植术 |
| 1.1.2.1 术前准备 |
| 1.1.2.2 肾移植外科技术 |
| 1.1.2.3 术后处理 |
| 1.1.3 现状及研究进展 |
| 1.2 移植免疫学 |
| 1.2.1 移植免疫基础 |
| 1.2.2 移植物排斥反应 |
| 1.2.3 配型试验 |
| 1.3 免疫耐受 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 免疫耐受基本理论 |
| 1.3.3 免疫耐受建立的机制 |
| 1.3.4 移植免疫耐受相关研究进展 |
| 1.4 调节性 T 细胞在肾移植排斥反应中的作用 |
| 1.4.1 肾移植排斥反应 |
| 1.4.2 调节性 T 细胞的功能 |
| 第2章 调节性 T 细胞亚群及其功能在肾移植排斥反应中作用的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 临床指标 |
| 2.2.3 标本采集 |
| 2.2.4 主要试剂和仪器 |
| 2.2.5 Foxp3+调节性 T 细胞（Rregulatory T cell，Treg）水平测定 |
| 2.2.5.1 样本的采集与处理 |
| 2.2.5.2 操作步骤 |
| 2.2.5.3 细胞计数 |
| 2.2.6 酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清 IL-10 水平 |
| 2.2.7 研究方法 |
| 2.2.8 观察指标 |
| 2.2.10 统计学处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 入选患者的一般信息和临床特点 |
| 2.3.2 肾衰竭患者流式试验的结果分析 |
| 2.3.3 肾衰竭患者移植后临床分析 |
| 2.3.4 肾衰竭患者移植前后流式试验的结果分析 |
| 2.3.5 肾衰竭患者血清中 IL-10 的表达 |
| 2.3.6 肾衰竭患者移植前后血清中 IL-10 的表达 |
| 2.3.7 肾衰竭患者调节性 T 细胞和临床指标间的相关性 |
| 2.3.8 肾衰竭患者血清中 IL-10 和临床指标间的相关性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 CD4+ T 细胞亚群及其功能在肾移植排斥反应中作用的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 研究对象 |
| 3.2.2 临床指标 |
| 3.2.3 标本采集 |
| 3.2.4 主要试剂和仪器 |
| 3.2.5 Foxp3+ 调节性 T 细胞（Rregulatory T cell，Treg）水平测定 |
| 3.2.6 流式细胞仪对外周血辅助性 T 细胞的检测 |
| 3.2.6.1 外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMC）分离 |
| 3.2.6.2 细胞计数 |
| 3.2.6.3 操作步骤 |
| 3.2.7 微量样本多指标流式蛋白定量技术（CBA）对 Th1/Th2 细胞因子检测 |
| 3.2.8 研究方法 |
| 3.2.9 观察指标 |
| 3.2.10 统计学处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 入选患者的一般信息和临床特点 |
| 3.3.2 肾衰竭患者流式试验的结果分析 |
| 3.3.3 肾衰竭患者移植后临床分析 |
| 3.3.4 肾衰竭患者移植前后流式试验的结果分析 |
| 3.3.5 肾衰竭患者血清中 Th1/Th2/Th17 型细胞因子的表达 |
| 3.3.6 肾衰竭患者移植前后血清中 Th1/Th2/Th17 型细胞因子的表达 |
| 3.3.7 肾衰竭患者调节性 T 细胞和辅助性 T 细胞及其细胞因子之间的相关性 |
| 3.3.8 肾衰竭患者 CD4+T 细胞和临床指标间的相关性 |
| 3.3.9 肾衰竭患者血清中 Th1/Th2/Th17 型细胞因子的水平和临床指标间的相关性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）监测T淋巴细胞亚群在评估肾移植术后免疫状态的临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 比较T细胞在健康者、尿毒症期患者和移植后肾功能稳定者之间的不同 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二章 肾移植术后不同免疫状态下T淋巴细胞亚群的变化 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三章 采用T细胞监测的肾移植受者与未采用T细胞监测的受者之间术后并发症的比较 |
| 1. 研究对象 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（10）急性移植排斥反应过程中MHC-I表达变化的实验研究与临床应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分:急性排斥反应过程中MHC-Ⅰ表达的动物实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分:肾移植术后HLA-Ⅰ表达的变化规律 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新性 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 发表论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
四、肾移植受者外周血白细胞淋巴细胞功能相关抗原-1表达的意义（论文参考文献）
- [1]造血干细胞微嵌合及工程化树突状细胞促进受者T细胞活化的机制研究[D]. 邓磊. 军事科学院, 2020(01)
- [2]滤泡辅助T细胞及单核/巨噬细胞来源的外泌体在肾移植术后抗体介导的排斥反应中的作用及机制研究[D]. 杨锦涛. 中国人民解放军医学院, 2019(02)
- [3]肾移植术后长期存活（＞20年）受者免疫状态评估[D]. 谢亚龙. 华中科技大学, 2019(03)
- [4]肾移植术后降钙素原与Th22和Th17细胞的临床相关性研究[D]. 李芬. 电子科技大学, 2019(01)
- [5]骨髓间充质干细胞对肾移植受者T淋巴细胞分化和miRNA-155表达的影响[J]. 朱凌峰,陈书尚,蔡锦全,谭建明,翁明芳. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2018(04)
- [6]红细胞表面分子在肾移植术后免疫功能状态评价中的临床价值[D]. 孔祥瑞. 中国人民解放军军事医学科学院, 2016(02)
- [7]抑制性中性粒细胞亚群与肾移植术后临床状态的研究[D]. 孙曙. 中国人民解放军军事医学科学院, 2016(02)
- [8]Treg/Th17/Th1细胞及其细胞因子在肾移植排斥反应中的机制研究及临床意义[D]. 胡克邦. 吉林大学, 2014(03)
- [9]监测T淋巴细胞亚群在评估肾移植术后免疫状态的临床意义[D]. 李国文. 南方医科大学, 2014(12)
- [10]急性移植排斥反应过程中MHC-I表达变化的实验研究与临床应用[D]. 周玉侠. 山东大学, 2011(11)