一、人原发性肝癌分子生物学研究近况（论文文献综述）
崔香丹[1]（2018）在《草苁蓉环烯醚萜苷对肝癌的抑制作用及其机制的实验研究》文中认为目的:1.研究草苁蓉环烯醚萜苷（IGBR）含药血清对人肝癌SMMC-7721、HepG2和SK-Hep1细胞生长的抑制作用。2.研究IGBR含药血清诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用,探讨其作用机制。3.观察二乙基亚硝胺（DEN）诱发肝癌大鼠的肝功能和肝组织病理变化,研究IGBR的抗氧化和诱导细胞凋亡的作用,探讨其作用机制。方法:1.体外实验:（1）含药血清的制备:雄性Wistar大鼠每组6只,随机分为对照组、5-氟尿嘧啶（5-FU）组、IGBR低、中、高剂量组。每日1次给予对照组大鼠2mL生理盐水,5-FU组大鼠75mg/kg 5-FU,IGBR组大鼠分别给予 125mg/kg、250mg/kg、500mg/kgIGBR连续灌胃1个月后处死各组大鼠,采集心脏血液,3 000转离心20min,56℃恒温水浴30 min,灭活血清中的补体及其他活性成分,-20℃保存备用。（2）体外培养人肝癌SMMC-7721、HepG2和SK-Hep1细胞株,以常规化疗药物5-FU为阳性对照,通过四甲基偶氮唑蓝法（MTT法）检测肝癌细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率,荧光显微镜观察肝癌细胞形态变化,蛋白印迹法（Western Blot）检测细胞凋亡相关蛋白的表达。2.体内实验:（1）DEN诱发大鼠原发性肝癌模型的制备:雄性Wistar大鼠每组33只,随机分为对照组、肝癌组、5-FU组及IGBR组。造模第一天对照组大鼠给予腹腔注射1次0.1 mL/100 g生理盐水,余3组大鼠给予腹腔注射1次200 mg/kg DEN;然后给予各组大鼠0.05%的DEN水溶液自由饮用。第二天开始5-FU组大鼠每周腹腔注射3次25 mg/kg 5-FU;IGBR组大鼠每日灌胃1次500 mg/kg IGBR。实验第12、20周末各组大鼠均处死6只,第28周末各组大鼠均处死20只,采集心脏血液,福尔马林固定肝脏。（2）以全自动生化分析仪检测大鼠肝功能;谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）的含量参照试剂盒操作步骤进行测定;用比色法测定肝组织抗氧化酶活性;通过HE染色观察肝组织病理变化、利用原位末端转移酶标记技术（TUNEL）检测肝细胞凋亡率、Western Blot法检测细胞凋亡相关蛋白的表达。结果:1.体外实验:（1）5-FU含药血清和IGBR含药血清能够抑制人肝癌SMMC-7721、HepG2和SK-Hep1细胞的增殖,有浓度和时间依赖性。（2）5-FU含药血清和IGBR含药血清作用于人肝癌SMMC-7721细胞后,出现细胞皱缩、变圆、细胞核固缩等典型的细胞凋亡改变;与对照组相比,5-FU组和IGBR组细胞凋亡率上升,差异有统计学意义（P<0.05）,IGBR高剂量组和5-FU组间无明显统计学差异（P>0.05）。（3）5-FU含药血清和IGBR含药血清作用于人肝癌SMMC-7721细胞后,与对照组相比5-FU组和IGBR中、高剂量组半胱天冬氨酸蛋白-3（Caspase-3）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、磷酸化c-jun氨基末端激酶（p-JNK）、磷酸化p38MAPK激酶（p-p38）蛋白表达增多,而B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）蛋白表达减少,差异均有统计学意义（P<0.05）,IGBR高剂量组和5-FU组间无明显统计学差异（P>0.05）;但ERK、JNK、p38、Akt蛋白表达无显明变化。采用丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）抑制剂分别作用后进一步证实IGBR含药血清通过调节上述信号传导通路,抑制肝癌细胞的生长,诱导细胞凋亡。2.体内实验:（1）给予大鼠灌胃DEN28周后,成功诱发原发性肝癌大鼠模型。与对照组相比,肝癌组大鼠毛发无光泽、粗糙、精神萎靡不振,肝重下降呈暗红色、质地坚硬、肝结节融合形成包块;与肝癌组相比,IGBR组和5-FU组大鼠上述变化较轻,但肝重无明显变化。（2）与对照组相比,肝癌组丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性、GST、γ-GT含量和肝组织抗氧化酶水平增高,差异均有统计学意义（P<0.05）;与肝癌组相比,5-FU组与IGBR组大鼠血清ALT和AST活性、GST、γ-GT含量和肝组织抗氧化酶水平降低,差异均有统计学意义（P<0.05）,IGBR组和5-FU组间无明显统计学差异（P>0.05）。（3）HE染色结果:肝癌组大鼠肝组织病理改变主要表现为肝脏炎症反应、肝硬化和肝癌三个阶段。与对照组相比,肝癌组出现细胞核大、深染,肝异型增生的癌变细胞。与肝癌组相比,5-FU组与IGBR组大鼠肝小叶结构基本存在,可见点状、灶状坏死,细胞核异型性较大,诱癌的三个阶段的病理变化明显改善。（4）TUNEL检测结果:与对照组相比,肝癌组大鼠肝脏肝细胞凋亡增加,细胞质呈棕黄色,凋亡的肝细胞皱缩、核固缩及核仁消失。与肝癌组相比,5-FU组与IGBR组细胞凋亡增多,差异有统计学意义（P<0.05）,IGBR组和5-FU组间无明显统计学差异（P>0.05）。（5）免疫组化结果:磷蛋白53（p53）、Bcl-2、磷蛋白21（p21）和c-myc阳性细胞主要分布于不典型增生灶和癌灶中,表达于胞浆。与对照组相比,肝癌组p53、Bcl-2、p21和c-myc表达增多,差异均有统计学意义（P<0.05）;与肝癌组相比,5-FU组和IGBR组p53、p21表达增多,而Bcl-2和c-myc表达减少,差异有统计学意义（P<0.05）,IGBR组和5-FU组间无明显统计学差异（P>0.05）。（6）Western Blot检测结果:与对照组相比,肝癌组p-ERK、p-Akt表达减少,p-JNK、p-p38表达增多,均有统计学差异（P<0.05）;ERK、p38、JNK、Akt表达无显明变化。与肝癌组相比,5-FU组与IGBR组p-ERK、p-Akt蛋白表达减少,p-JNK、p-p38蛋白表达增多,均有统计学差异（P<0.05）;IGBR组和5-FU组间无明显统计学差异（P>0.05）。结论:1.IGBR含药血清能够抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖。2.IGBR含药血清诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡,且呈浓度依赖性。3.MAPK和PI3K/Akt信号传导通路参与调节IGBR含药血清诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡。4.IGBR可通过提高肝组织抗氧化活性,保护DEN诱发肝癌大鼠肝脏。5.IGBR通过调节凋亡相关蛋白及肝癌相关信号传导通路蛋白的表达,诱导细胞凋亡,抑制DEN诱发大鼠肝癌细胞的生长。
常虹[2]（2015）在《原发性肝癌“毒瘀互结”的病机理论及丹参酮胶囊联合三氧化二砷干预机制的研究》文中进行了进一步梳理目的:（1）探讨分析原发性肝癌毒瘀互结的病机特点。（2）通过实验研究,丹参酮胶囊联合三氧化二砷诱导人肝癌bel-7404细胞凋亡及其机制,从分子角度佐证原发性肝癌病因病机的特点。方法:采用文献分析与实验相结合的研究方法。（1）文献研究:通过原发性肝癌古今文献的系统梳理,对肝癌病名进行了考证,并详尽阐述了原发性肝癌毒瘀互结的病因病机,在此基础上,确立治疗法则及用药。（2）实验研究:①采用CCK-8法检测丹参酮胶囊联合三氧化二砷对肝癌bel-7404细胞、人肝正常LO2细胞的增殖抑制情况,流式细胞仪检测对其凋亡的影响;②采用Western Blot法检测丹参酮胶囊联合三氧化二砷对肝癌bel-7404细胞凋亡蛋白的表达,如Bcl-2、XIAP、Survivin、Bax、PARP、caspase-9、caspase-3 等;(三采用 Western Blot法检测丹参酮胶囊联合三氧化二砷对肝癌bel-7404细胞MAPK信号转导通路的影响。结果:（1）文献研究表明:医学经典专着《黄帝内经》中,已有原发性肝癌的类似记载。其机制主要是在外感邪毒、劳倦内伤、饮食、情志等致病因素的基础上,酿生癌毒,以正气不足为内在条件,瘀毒互结,形成肿瘤。肝藏血,体阴而用阳,藏血而调血,肝脏肿瘤与血瘀的关系尤为密切。“毒”“瘀”“虚”贯穿肝癌发生发展的全过程,构成肝癌病机复杂性,治疗应抓住主要矛盾,切中病机,以毒攻毒、化瘀扶正,结合现代科技研究成果,选用三氧化二砷攻克癌毒,丹参酮胶囊化瘀扶正,两药联合,协同增效,起到了标本同治的效果。（2）实验研究:①细胞增殖抑制实验,以2μm/L浓度的三氧化二砷处理bel-7404细胞24h,以2.5、5、10、20μg/mL等不同浓度的丹参酮胶囊处理bel-7404细胞24h,丹参酮胶囊单药组随药物浓度提高抑制率增加;2+2.5、2+5、2+10、2+20（μm/L+μg/mL）联合组对bel-7404细胞的生长抑制作用,随浓度的增加而增加;2+2.5、2+5、2+10、2+20（μm/L+μg/mL）联合组对肝正常L02细胞的生长抑制作用,2+2.5、2+5（μm/L+μg/mL）低浓度联合组未见明显的抑制作用,而2+10、2+20（μm/L+μg/mL）高浓度联合组出现明显的生长抑制作用,分别达到29.7±1.9%、42.8±2.7%。选5μg/mL丹参酮胶囊+2μm/L ATO联合进行后期实验。流式细胞检测,联合组作用bel-7404细胞24h,早期凋亡率49.4%,与单独用药比较,差异有统计学意义（P<0.01）②Western Blot法检测联合组对肝癌bel-7404细胞作用24h,明显抑制Bcl-2、XIAP、Survivin等凋亡抑制蛋白表达,与对照组、单药组比较差异有统计学意义（P<0.01）,caspase-9、caspase-3和PARP切割片段明显增加,而单独用药组的蛋白变化不明显。③Western Blot法检测联合组作用肝癌bel-7404细胞12h,p-JNK、p-P38蛋白表达增高与对照组、单药组比较差异有统计学意义（P<0.01）;p-ERK蛋白表达下降,与对照组和丹参酮胶囊单药组比较有统计学意义（p<0.01）,而与砷剂单药组比较无统计学意义（P>0.05）。用JNK特效抑制剂SP600125（20μm）处理细胞后,可显着减少联合组p-JNK蛋白的表达,抑制JNK磷酸化,同时抑制下游caspase-9、caspase-3蛋白活化。结论:（1）“毒”“瘀”“虚”胶合蕴结为原发性肝癌病因病机特点,正气不足为内在前提,癌毒肆虐是肝癌发生发展的启动因素,脉络瘀滞贯穿疾病始终,因此,针对治疗原发性肝癌毒瘀互结的病机特点,选用三氧化二砷以毒攻毒,丹参酮胶囊化瘀扶正,二者联合使用可以起到毒瘀同治的作用,并且丹参酮胶囊有望成为提高三氧化二砷化疗敏感性的有效药物。（2）丹参酮胶囊联合三氧化二砷作用人肝癌bel-7404细胞,联合增效作用可能主要通过激活JNK通路,偶联P38MAPK通路,同时下调Bcl-2、XIAP、Survivin等凋亡抑制蛋白,活化下游caspase-9、caspase-3等诱导细胞发生凋亡。研究低毒、高效的中药联合化疗方案,多靶点、多通路诱导肝癌细胞凋亡,为提高低剂量三氧化二砷的临床疗效奠定理论基础;应用现代分子生物学技术揭示联合增效的作用及相关机制,既阐明了肝癌毒瘀互结之病机内涵,又为临床抗肝癌治疗提供可资借鉴的方法和思路。
白山岭[3]（2014）在《牛黄参对HepG2的P53、Bcl-2基因调控及细胞凋亡的影响研究》文中提出目的：基于肝癌的发病机制与细胞增殖和凋亡的失衡密切相关，以P53、Bax、Bcl-2与肝癌细胞凋亡明确相关的基因为切入点，进行相关研究，观察牛黄参（NHS）含药血清体外诱导人肝癌细株HepG2细胞凋亡的作用，初步探讨其作用机制，为牛黄参胶囊的研究与应用提供理论与实验依据以及为临床治疗原发型肝癌开辟一条新思路。方法：采用药物血清学和细胞药理学方法，对比观察（阴性无药物血清对照、阳性药CTX对照）NHS含药血清对HepG2细胞凋亡及凋亡相关调控基因Bax，Bc1-2及抑癌基因P53的影响。主要观察指标及检测方法如下：1．含药血清的制备：40只SD大鼠，随机分为空白对照组（8只）、CTX含药血清组（8只）和牛黄参含药血清组（24只）。以成人临床一日常用量为含药血清组的有效剂量，按人和大鼠体表面积折算的等效剂量比值换算出大鼠的一日用药剂量，并设为含药血清组终剂量。空白对照组：灌服等效生理盐水每天两次，每次5mL。含药血清组：CTX水溶液（25.2mg/kg）每天灌胃两次，每次5mL；牛黄参煎液（1.07g/kg）每天灌胃两次，每次5mL；重复给药连续七天，末次给药45分钟后采取心脏穿刺采血法取血，将采集的血液在室温中静置4h，3000rpm，离心15min，收集血清，将收集的血清在56℃水浴30min进行灭活，而后在超净台内用0.22pm微孔滤膜过滤除菌，将血清移至干净试管中，置-20℃保存备用，需要时用培养液配制成所需浓度的含药血清。2．以CCK-8法检查五个药物血清浓度对IIepC2细胞增殖的抑制作用，从中找出NHS的最佳有效药物血清浓度。3．HepG2细胞NHS含药血清给药48h后，AO/EB和DAPI荧光染色，荧光显微镜下观察细胞形态学变化。4．流式细胞术AnnexinV-FITC/PI双染色法检测NHS含药血清对HepG2细胞周期和凋亡百分率影响。5．蛋白质印迹法（Western Blot）检测NHS含药血清对HepG2细胞的P53、Bcl-2基因蛋白表达的影响。6．免疫组化方法检测NHS含药血清三个有效药物浓度对HepG2细胞Bcl-2, Bax及细胞核增殖性抗原（PCNA）表达的影响。7．Real time RT-PCR检测含药血清处理前、后的HepG2细胞中Bcl-2和Bax mRNA的相对表达。结果：1. CTX组及牛黄参各浓度组细胞增殖受到明显抑制，且随着浓度增加和作用时间延长，HepG2细胞的增殖数目和速度下降，牛黄参各浓度组与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。2.通过荧光显微镜观察到典型的细胞形态学改变：含药血清组部分的细胞核呈现折缝样、波纹状，核染色质着桔红色，部分染色质出现浓缩状态；CTX含药血清组、20%NHS含药血清组可见大量不同程度的坏死和凋亡细胞，其细胞体积变小，核膜消失，胞质内空泡增多，细胞器较少，细胞核染色质固缩，形态不规则，可见核碎裂，产生凋亡小体，且培养时间越长，改变越显着。3．流式细胞仪分析HepG2细胞呈现出明显的亚二倍体凋亡峰，且细胞凋亡数量随着给药剂量的增加而增加。HepG2细胞在CTX含药血清、5%NHS含药血清、10%NHS含药血清和20%NHS含药血清给药48h后，凋亡细胞所占比例分别为30.13%、11.05%、19.76%和28.32%。细胞周期分析说明NHS含药血清组使该细胞生长阻止于G0/G1期。4．蛋白质印迹法（Western Blot）结果显示：与空白对照组相比，牛黄参含药血清作用HepG2细胞后，Bcl-2蛋白的表达量显着下降（P<0.05），P53蛋白的表达量显着上升（P<0.05），且两两组间相比有显着性差异（P<0.05）。5．免疫组化结果显示：随着NHS含药血清给药浓度的增加，PCNALI逐渐降低，表明NHS含药血清可抑制HepG2肿瘤细胞的增殖，且随着NHS含药血清浓度增加，能够明显降低HepG2细胞内Bcl-2蛋白的阳性表达率，Bax蛋白表达呈中强性表达，20%NHS、CTX组和10%NHS组阳性表达率分别为56.89%，58.33%，44.73%，与空白对照组比较，具有显着性差异（P<0.01，P<0.05）。6．实时荧光定量PCR检测各组细胞的CT值，分析各细胞凋亡相关因子mRNA相对表达水平显示,随着NHS含药血清浓度的增加Bax mRNA的表达水平增加，而Bcl-2mRNA的表达水平却降低。结论：1. NHS含药血清能在一定程度上抑制HepG2细胞的增殖。2. NHS含药血清具有诱导HepG2细胞凋亡的作用。3. NHS含药血清诱导HepG2细胞凋亡的作用机制之一可能是上调促凋亡基因Bax和P53的表达，下调Bcl-2的表达有关。
国家中医药管理局国家中医临床研究基地办公室[4]（2013）在《我国16个重点病种的国家中医临床研究基地论文统计表（2008年～2013年）》文中研究指明
李姵萱[5]（2011）在《疏肝清毒汤诱导人肝癌细胞HepG-2凋亡及其机制的实验研究》文中认为1.目的：疏肝清毒汤是对癌症具有比较客观疗效的—自拟方,本文以其来处理肝癌细胞株HepG-2,以初步探讨疏肝清毒汤体外抗肝癌的作用机制。2.方法：2.1细胞的培养：用0.06%胰蛋白酶将HepG-2细胞分散成单个细胞悬液,用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成浓度为3×105个/ml的细胞悬液,按0.1ml/孔分种于96孔板,置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养。2.2疏肝清毒汤对HepG-2细胞的毒性作用实验：将疏肝清毒汤原液作系列倍比稀释成以下八个浓度100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78g/L。用0.06%胰蛋白酶将HepG-2细胞分散成单个细胞悬液,用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成浓度为3×105个/ml的细胞悬液,按0.1ml/孔分种于96孔板,置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养,培养24小时细胞贴壁,2d后换含药培养液0.1ml/孔,每个浓度2孔,并设不加药物的对照。置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内继续培养,12d后去掉上清,将所余细胞用MTT法测药物细胞毒性。2.3疏肝清毒汤对HepG-2细胞生长曲线的影响：取对数生长期细胞用10%胎牛血清的DMEM培养液配成细胞数为1×104/ml的单细胞悬液,在24孔培养板中接种细胞,每孔1ml。培养24小时细胞贴壁后,用完全培养基将疏肝清毒汤稀释至浓度为60g/L和30g/L,对照组用2%DMEM取代疏肝清毒汤。37℃、5%CO2、饱和湿度条件下于CO2培养箱中培养。在培养后即刻及1、2、3、4、5、6、7天,各取样4孔,消化后各孔取40μl,加0.4%台盼蓝染液10μl,置血球计数板计数拒染的活细胞数,并与培养时间作图。2.4疏肝清毒汤对HepG-2细胞AFP分泌的影响：将疏肝清毒汤原液作系列倍比稀释成以下八个浓度60、30、15、7.5、3.751、1.875、0.938、0.469g/L。用0.06%胰蛋白酶将HepG-2细胞分散成单个细胞悬液,用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成浓度为3×105个/ml的细胞悬液,按0.1ml/孔分种于96孔板,置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养,培养24小时细胞贴壁,2d后换含药培养液0.1ml/孔,每个浓度2孔,并设不加药物的对照。置37℃、饱和湿度、5%C02培养箱内继续培养；12d后收集上清,用人血清甲胎蛋白（AFP）酶联定量诊断试剂盒检测上清中AFP的分泌量。2.5疏肝清毒汤对HepG-2细胞ALT和LDH的影响：用0.06%胰蛋白酶将HepG-2细胞分散成单个细胞悬液,用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成浓度为3×105个/ml的细胞悬液,将细胞悬浮液加入96孔培养板中,每孔200μl,置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养,培养24小时细胞贴壁。弃培养液,加入浓度为60g/L和30g/L的疏肝清毒汤,每个浓度2孔,对照组用2%DMEM取代疏肝清毒汤。分别培养24 h和48 h后离心收集上清,用酶联免疫法（ELISA）检测ALT、LDH。2.6疏肝清毒汤对HepG-2肝癌细胞凋亡的影响：取对数生长期的细胞,0.06%胰酶消化后制成单细胞悬液,0.4%台盼蓝染色,计算拒染的活细胞率为97.5%。将细胞悬液接种至50cm2培养瓶中,106个细胞/瓶,培养液为含10%FCS、100U/ml青链霉素的10%胎牛血清的DMEM,在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24小时后,更换培养液,药物组：每瓶培养液5 ml中加入疏肝清毒汤终浓度为60g/L、30g/L；对照组加入等量2%DMEM。加药后于24小时、48小时每个时间点各取3瓶细胞,进行检测。凋亡细胞的检测：小心弃掉培养液,0.06%胰酶消化3分钟,轻轻吹打细胞成单细胞悬液,1000r/min离心10分钟,Binding Buffer重悬细胞至1×106/ml,取100μl细胞悬液（HepG-2细胞）至5ml FACS管中,加入5μl Annexin V-FITC,10μlF混匀,室温下避光孵育15分钟后每管加入400μl Binding Buffer,1小时内上机进行流式细胞分析。同时设对照管（主细胞）和补偿设置管,即未染色的细胞,单染Annexin V-FIT的管和单染PI的管。FCM流式细胞术分析：采用FACS Calibur（美国BECKMAN COULTE公司）ALTRA型流式细胞仪,488nm激发光源。先将对照管上样,通过调整参数FSC和SSC,在散射光点图（FSC/SSC）中清获显示出一个清晰、集中的细胞群体,对细胞群体进行设门（Gate）,再以门中细胞进行后续荧光信号检测。将对照管（裸细胞）的荧光强度设定为非特异性本底荧光,并在此基础上确定阳性荧光表达比率。调定流式细胞仪,使荧光散入图中裸细胞集中分布在左下象限。保持FL1、FL2、FL3不变分别将单染AV-FITC的管和单染PI的管上样,调整仪器荧光补偿值,进行光谱重叠校正后即可分析样本。每个样本上获取10,000个细胞,采用CellQuest功能软件进行分析。2.7AO/EB荧光染色法测定疏肝清毒汤诱导HepG-2细胞凋亡：将1×106/ml HepG-2细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,加入疏肝清毒汤终浓度为60g/L、30g/L,置37℃、5%CO2浓度及饱和湿度的恒温培养箱中悬浮培养,孵育后分别于24及48小时观察结果。AO/EB染色及观察结果：取细胞悬液100μl,加入AO/EB染料4μl混匀,置1滴于载玻片,上覆盖玻片,荧光显微镜下观察结果并计数200个细胞。2.8疏肝清毒汤对细胞凋亡调控基因p53的影响：细胞爬片分组以24孔培养板每孔置入一块无菌玻片,取对数生长期HepG-2细胞消化制备成细胞悬液,调整细胞浓度为1×105/ml,接种24孔板内lml/孔。置培养箱24小时后,中药组加入疏肝清毒汤终浓度分别为60g/L和30g/L,对照组加入2%DMEM,以上各组均平行三孔,继续培养48小时后,取出爬满的细胞的玻片,用PBS漂洗二遍,经4%多聚甲醛固定30分钟,PBS洗涤后自然风干,-20℃保存备用。检测方法按试剂盒说明书进行,主要步骤有：滴入过氧化物酶阻断剂50μl；37℃10分钟；PBS反复洗三次,滴入正常非免疫羊血清50μl；37℃10分钟,直接甩干,分别加入p53一抗,37℃2小时；PBS洗3次,滴入生物标记的二抗,37℃10分钟；PBS洗3次,滴入链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶溶液,37℃10分钟；PBS洗3次,滴入新鲜配制的DAB显色溶液,光学显微镜下观察显色效果,至显色明显,用自来水冲洗后,苏木素复染。中性树胶封固,摄像。2.9疏肝清毒汤对HepG-2肝癌细胞的Fas/FasL表达的影响：细胞的准备：取对数生长期细胞用10%胎牛血清的DMEM培养液配成细胞数为1×104/ml的单细胞悬液,在24孔培养板中接种细胞,每孔1ml。培养24小时细胞贴壁后,用完全培养基将疏肝清毒汤稀释至浓度为60g/L和30g/L,对照组用2%DMEM取代疏肝清毒汤。37℃,5%CO2、饱和湿度条件下于CO2培养箱中培养。Fas/FasL mRNA相对表达量的变化：分别抽提对照组HepG-2,疏肝清毒汤60g/L、30g/L组HepG-2三组细胞总RNA,逆转录为cDNA。取逆转录反应产物1μl作为模板,共扩增Fas基因片段和内参β-actin。PCR反应条件：94℃预变性5min,94℃变性45s,64℃退火30 s,72℃延伸1min,经35个循环。扩增产物在1.8%琼脂糖凝胶中电泳,将结果在凝胶呈像系统中扫描其辉度值,以Fas基因与内参基因的辉度比值作为其相对表达量,比较各组之间的差别。同样实验共重复3次。取逆转录反应产物1μl作为模板,共扩增FasL基因片段和内参β-actin。PCR反应条件：94℃预变性5 min,94℃变性45 s,58℃退火30 s,72℃延伸1 min,经38个循环。扩增产物在1.8%琼脂糖凝胶中电泳,将结果在凝胶呈像系统中扫描辉度值,以Fas L基因与内参基因的辉度比值作为其相对表达量,比较三组之间的差别。同样实验共重复3次。3.结果3.1疏肝清毒汤对HepG-2细胞的毒性作用实验：（1）疏肝清毒汤在设定的八个浓度（100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78g/L）时,对HepG-2细胞的药物半数毒性浓度TC50为62.65 g/L,对HepG-2细胞的破坏率分别为107.66、37.83、5.82、-0.97、-3.88、-15.52、4.85、21.34%；（2）疏肝清毒汤在浓度100g/L,细胞出现空泡、萎缩、脱落,破坏率分别达107.66%和88.90%；疏肝清毒汤浓度为50g/L,镜下可见细胞形态大致正常。3.2疏肝清毒汤对HepG-2细胞生长曲线的影响：疏肝清毒汤浓度为60g/L,在0-7天时,其细胞数分别为1、1.7、1.8、1.2、0.9、0.7、0.4、0.3万/ml,浓度为30g/L,其细胞数分别为1、1.7、1.9、1.6、1.4、0.9、0.6、0.4万/ml,细胞增殖缓慢。可见,疏肝清毒汤（60g/L、30g/L）能抑制’HepG-2细胞的生长。3.3疏肝清毒汤对HepG-2细胞AFP分泌的影响：疏肝清毒汤浓度为60g/L和30g/L时,HepG-2细胞AFP的分泌量为13.22 ng/ml和18.08 ng/ml,而对照组为214.52 ng/ml。根据正常参考值为小于20ng/ml的标准,可以看出当疏肝清毒汤浓度在60、30 g/L时,能抑制HepG-2细胞AFP的分泌,在体外对肝癌细胞HepG-2的AFP分泌有抑制作用。故疏肝清毒汤在体外抑制肝癌细胞HepG-2分泌AFP的作用较好。3.4疏肝清毒汤对HepG-2细胞ALT和LDH的影响：加入疏肝清毒汤24h后,疏肝清毒汤60g/L组ALT为12.34 U/L,LDH为182.42 U/L,疏肝清毒汤30g/L组ALT为10.89 U/L,LDH为165.33 U/L,与空白组比较有极显着性差异；加入疏肝清毒汤48 h后,疏肝清毒汤60g/L组ALT为18.60 U/L,LDH为284.40 U/L,疏肝清毒汤30g/L组ALT为15.18 U/L,LDH为218.30 U/L,与空白组比较有显着性差异。3.5疏肝清毒汤对HepG-2肝癌细胞凋亡的影响：疏肝清毒汤随浓度增加,HepG-2细胞的凋亡率升高,出现典型的凋亡峰,与对照组相比差异有显着性（P<0.05）。但本实验凋亡率较小,可能与细胞凋亡发生的整个过程短暂,凋亡时间不同步,部分凋亡细胞碎裂未能检测到有关。但实验结果还是较明确地证明了疏肝清毒汤能直接诱导HepG-2细胞凋亡,这可能是疏肝清毒汤抗肝癌的重要机制之一。3.6AO/EB荧光染色法测定疏肝清毒汤诱导HepG-2细胞凋亡：对照组细胞在24和48小时其凋亡率分别为2.10%和3.21%；疏肝清毒汤60g/L诱导HepG-2细胞凋亡,在24和48小时其凋亡率分别为8.90%和18.32%；疏肝清毒汤30g/L诱导HepG-2细胞凋亡,在24和48小时其凋亡率分别为6.40%和12.54%。3.7疏肝清毒汤对细胞凋亡调控基因p53的影响：疏肝清毒汤组p53表达显色较对照组明显加深,呈强染色,且阳性细胞数明显增多。疏肝清毒汤浓度为60g/L时,p53阳性细胞率为33.56%,疏肝清毒汤浓度为30g/L时,p53阳性细胞率为29.45%,与空白对照组比较,有显着性差异（P<0.05）,且呈剂量依赖关系。3.8疏肝清毒汤对HepG-2肝癌细胞的Fas/FasL表达的影响：（1）Fas基因mRNA相对表达量的变化：Fas基因与β-actin RT-PCR共扩增,表明以疏肝清毒汤60g/L剂量处理后的HepG-2细胞其Fas基因的相对表达量较对照组明显增高。（2）FasL基因mRNA相对表达量的变化：FasL基因与β-actin RT-PCR共扩增,表明疏肝清毒汤60g/L剂量组HepG-2细胞Fas L基因的相对表达量较空白对照组和阴性对照组明显增高。4.结论4.1疏肝清毒汤能抑制HepG-2细胞的生长,对HepG-2细胞有明显的细胞毒作用,并且这种改变随着药物作用时间的延长而更加明显。4.2疏肝清毒汤在体外抑制肝癌细胞HepG-2分泌AFP的作用较好。4.3疏肝清毒汤抗癌的作用机制是诱导细胞凋亡,且诱导作用随诱导时间延长,其细胞凋亡率逐渐增高。4.4疏肝清毒汤能上调人肝癌细胞HepG-2凋亡相关基因p53的表达,且呈剂量依赖关系。4.5疏肝清毒汤能上调Fas/FasL的表达,从而诱导肝癌细胞的凋亡。
吴洁,白广德[6]（2010）在《原发性肝癌的中医药治疗研究近况》文中研究指明 原发性肝癌（PLC）是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,因其治疗困难,生存期短,而冠有"癌王"之称。我国是肝癌的高发区,肝癌的发病人数占全球的50%以上,成为世界上肝癌发病最集中的国家。目前手术治疗仍是肝癌首选的治疗方法,但肝癌发病隐蔽,诊断时已不能手术切除的病例占70～80%以上。因而积
宋焱艳[7]（2008）在《大鼠肝癌变进程中差异表达序列标签的初步筛选及分析》文中提出目的:采用mRNA差异显示反转录聚合酶链式反应技术（DDRT-PCR）筛选大鼠肝癌变不同时期的差异表达序列标签（Express sequence tags, ESTs）,探索肝癌发生和发展的分子机理。方法:用二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine, DENA）作诱癌剂建立SD大鼠肝癌变不同时期的动物模型。自给药起,分别在14d、28d、56d、77d、105d、112d处死大鼠,取其肝组织,用mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）研究不同病理时期差异表达的基因,克隆与测序后用生物信息学方法对测序结果进行分析。结果:获得12条差异表达片段。其中有3个片段（EST-1,EST-3,EST-5）在大鼠ESTs数据库和基因组数据库中均未找到同源序列,可能是新基因片段;有1个差异表达片段EST-12在大鼠ESTs数据库中未找到同源序列,但与基因组数据库中的蛋白激酶C- alpha基因有95%的同源性,可以认为是该基因的同源序列,可作为大鼠新的EST;有2个差异表达片段EST-7和EST-11分别与大鼠BN/SsNHsdMCW线粒体基因片段和酪氨酸/色氨酸单加氧酶激酶基因片段同源性达100%,可以认为分别是上述二种基因的部分序列,但BN/SsNHsdMCW线粒体基因编码蛋白尚未知晓;其余6个差异表达片段（EST-2、EST、EST-6、EST-8、EST-9和EST-10）在大鼠已知ESTs数据库和基因组数据库中的均找到与其同源达97%以上的序列,可以认为是已知基因的同源序列。结论:初步筛选出12个肝癌变进程中差异表达的ESTs,其中9个为已知基因片段, 3个为新基因片段。EST-7与大鼠线粒体BN/SsNHsdMCW基因片段同源性达100%,可以认为是该基因的一段序列。本研究首次发现线粒体BN/SsNHsdMCW基因在大鼠肝癌变各时期的差异表达情况。
徐冰[8]（2007）在《常见人体肿瘤转移动物模型的建立及相关机理研究》文中提出转移性是恶性肿瘤主要的生物学特性之一，也是导致肿瘤患者死亡的主要原因，即使对患者实施肿瘤切除，术后转移的发生也是影响手术疗效的主要障碍。肿瘤转移的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂生物学过程。因此，研究肿瘤的转移，就必然要建立与临床表现相近的肿瘤转移动物模型。人体肿瘤移植于裸小鼠建立人癌异种移植动物模型为肿瘤的深入研究提供了可能。皮下移植和原位移植是目前常用的两种方法。原位移植由于获得与人体肿瘤生长相似的微环境，更利于肿瘤恶性行为的表达，因此，建立肿瘤转移动物模型大多采用原位移植的方法。肝癌、胃癌和肺癌是常见的肿瘤，利用这三种肿瘤进行研究具有一定的代表意义。本课题利用不同程度免疫缺陷小鼠观察了人肝癌原位移植肿瘤在宿主体内的生物学特性差异；模拟临床，建立了人肝癌和人肺癌术后转移动物模型；同时利用经体内筛选建立的人胃癌高转移动物模型以及建立的人胃癌细胞株MKN-45mc，对肿瘤转移的相关机制进行探讨。一、目的1．建立人肝癌NOD-SCID小鼠和裸小鼠原位移植模型，并通过两种模型生物学特性的比较，对不同类型免疫缺陷动物在人肝癌异种移植方面的应用价值进行初步探讨。2．建立人肝癌术后转移动物模型，观察并比较手术切除肿瘤后对人肝癌小鼠皮下移植模型和原位移植模型的影响。3．建立裸小鼠人肺癌术后转移模型，为研究肺癌的转移机制和术后抗转移治疗提供适宜的动物模型。4．比较体内筛选前后建立的人胃癌原位移植动物模型，以及人胃癌细胞株MKN-45mc和MKN-45生物学特性出现的差异，对转移的相关机制进行探讨。二、方法1．将组织结构完整的SMMC-LTNM瘤块植入NOD-SCID小鼠和裸小鼠肝脏内，建立人肝癌原位移植模型。观察成瘤率、肿瘤体积和重量、脏器的转移情况以及血清甲胎蛋白（AFP）、γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ（γ-GTⅡ）等指标。2．将组织结构完整的HC-031瘤块植入NOD-SCID小鼠皮下和肝脏内，分别建立人肝癌皮下移植和原位移植模型。模拟临床肿瘤手术切除方法，切除皮下移植瘤和原位移植瘤，建立肝癌术后转移模型。观察肿瘤生长和动物的生存状况。通过病理解剖和组织病理学技术研究肿瘤在动物体内转移情况。3．将人非小细胞肺癌NCI-H460组织块植入裸小鼠皮下，建立皮下移植瘤模型。4w后，25只裸小鼠作为手术组切除肿瘤组织，建立术后转移模型，15只裸小鼠作为对照组。每两周两组各处死5只动物动态观察其远处各脏器转移情况。动物明显消瘦时结束实验。采用免疫组化方法检测MMP-2、OPN、CD44v6、CD62等蛋白在转移灶及原发灶的表达情况。4．用人胃癌MKN-45sci和MKN-45肿瘤组织块建立人胃癌原位移植动物模型，观察并比较两种模型的肿瘤生长和转移、血清肿瘤标志物及MMP-2、OPN、CD44v6、CD62与Timp-2的表达情况。取MKN-45sci肝转移灶形成的皮下移植瘤，用组织块法进行原代培养，建立MKN-45mc细胞株，观察肿瘤细胞的形态学、生长速度、体外侵袭能力、细胞周期变化，并与MKN-45细胞株进行比较。三、结果1．NOD-SCID小鼠人肝癌原位移植模型于5w可扪及肿瘤的生长，成瘤率为100％，11w肿瘤体积为（4.48±0.93）cm3，瘤重为（7.02±1.15）g，肺部转移率为53.85％；裸小鼠人肝癌原位移植模型于6w～7w可扪及肿瘤的生长，成瘤率为100％，11w肿瘤体积为（1.02±0.70）cm3，瘤重为（2.87±0.44）g，体内未见转移发生。NOD-SCID小鼠的瘤体积、瘤重、肺转移率均高于裸小鼠（P=0.000，P=0.000，P=0.011）。二者均保持AFP高分泌和γ-GT同工酶阳性的特性。2．人肝癌HC-031皮下移植模型和原位移植模型由于肿瘤负荷过大分别于11w和6w而出现濒死状态，荷瘤平均生存时间为75d和44d。病理解剖，皮下移植瘤模型未发现转移（0／7），原位移植瘤模型的肿瘤和邻近脏器侵袭明显，部分出现肺部转移（2／7）。皮下切瘤动物和肝原位切瘤动物分别于17w和12w出现恶病质现象，平均生存时间为154d和112d。病理解剖发现肺部均有肉眼可见癌性转移结节（7／7，7／7）。未切瘤动物和切瘤动物血清中AFP和γ-GTⅡ表达均为阳性。3．人肺癌NCI-H460裸小鼠皮下移植瘤10w时瘤体严重坏死，并且动物出现明显消瘦，解剖未发现转移。手术组裸小鼠于10w、12w各发现一例肺转移（1／5），14w时裸小鼠明显消瘦，肺转移率达100％（5／5），有肉眼明显可见的肺转移结节，其他脏器未见转移。免疫组化结果表明，MMP-2、OPN、CD44v6、CD62和Timp-2在肺转移灶内的表达明显高于原发灶，CD54和MMP-9在转移灶内的表达则低于原发灶。4．人胃癌原位移植模型MKN-45sci组动物的肝转移出现早且转移率高，4w左右肉眼即可看到肝转移结节（100％），同时伴有淋巴结转移（100％）、肺转移（71％）、脾转移（29％）和腹水；移植瘤体积和重量明显增加，分别达到（3089±1617）mm3和（2.66±1.32）g，动物出现恶病质。而4w时MKN-45组肝、肺、脾未见明显转移灶，仅2只动物有淋巴结转移；小鼠未见明显消瘦，移植瘤体积和重量为（275±90）mm3和（0.35±0.14）g。MKN-45sci组血清中NSE和CYFRA21-1的浓度均较高，且随着肿瘤生长时间的延长而增高。而MKN-45组CYFRA21-1始终呈现阴性，4w时NSE仅为76.9 ng／ml。免疫组化结果显示MMP-9、OPN抗体在MKN-45sci组原位移植瘤和转移灶呈强阳性反应，而在MKN-45组原位移植瘤反应较弱。CD44v6抗体在MKN-45sci组原位移植瘤和转移灶呈阳性反应。E-cadherin抗体在MKN-45sci组原位移植瘤呈阳性反应，肝转移灶呈阴性反应。建立的MKN-45mc细胞株的染色体为超三倍体细胞，具有人类恶性肿瘤细胞染色体的特点。细胞形态为典型的上皮样细胞，与MKN-45的形态学特点相似。流式细胞分析显示MKN-45mc与MKN-45细胞周期各时相比例分别为：G0-G1期62.51％／53.95％，S期9.46％／1452％，G2-M期28.04％／31.53％，两株细胞DNA合成期的细胞比例均较高。MKN-45mc与MKN-45细胞倍增时间分别为34.8h和42.1h，前者的生长速度高于后者。MKN-45mc与MKN-45的36h体外过膜数分别为（60.38±8.86）／高倍视野和（32.50±17.26）／高倍视野，前者多于后者。四、结论1．建立了与临床表现相似的人肝癌动物模型。与裸小鼠相比，NOD-SCID小鼠在建立人肝癌的异种移植模型方面有更大的应用价值。2．模拟临床肿瘤切除方法，建立人肝癌术后转移动物模型。实验结果表明，荷瘤动物肿瘤切除后，生存期延长，有利于肿瘤转移发生。3．裸小鼠人肺癌术后转移模型模拟了临床肿瘤根除术后发生远处转移的过程，结果提示肺癌转移的发生可能与部分粘附分子的异常表达相关，同时为研究肺癌转移机制和术后抗转移治疗提供理想的动物模型。4．人胃癌原位移植动物模型体内筛选前后肿瘤的生物学特性不同，经筛选后肿瘤的生长和转移能力较未筛选的增强，其机理与肿瘤细胞粘附和降解能力得到强化有关。筛选后建立的细胞株生长速度、过膜能力比原细胞株增强，表明肿瘤转移与肿瘤细胞增殖和运动变形能力有关。
蒋磊,覃扬,孙芝琳,孙泽芳,王锦红,杨鲁川[9]（2007）在《限制性内切酶结合半巢式PCR法检测人肝癌P16抑癌基因启动子区甲基化研究》文中进行了进一步梳理目的建立甲基化敏感的限制性内切酶结合半巢式降落PCR方法,研究原发性肝癌P 16基因启动子区甲基化状态。方法针对P 16基因启动子区富含CpG的序列,设计3条引物,进行半巢式降落PCR扩增,检测原发性肝癌P 16基因启动子区甲基化状态;并将P 16基因启动子区340 bp片段克隆到pM D 18-T载体,E.coli JM 109扩增此质粒后经CpG甲基化酶M.S ssⅠ处理,再用Hp aⅡ酶切验证获得P 16基因启动子区甲基化阳性的质粒P 16Pm+并进行特异性和灵敏度实验。以此甲基化敏感的限制性内切酶结合半巢式降落PCR方法检测40例人原发性肝癌和3例正常人肝组织DNA样品的P 16基因启动子区甲基化状态。结果所采用的Hp aⅡ酶切后半巢式PCR方法的特异性强,灵敏度达100 fg;对40例人原发性肝癌组织DNA样品P 16基因的启动子区甲基化状态检测显示甲基化阳性率为30%（12/40）,3例正常人肝组织均为阴性（0/3）。结论P 16抑癌基因启动子区甲基化可能与肝癌发生发展有关。本实验方法简便、成本低廉,并有高度的特异性与灵敏度,在大规模检查中有实际应用价值。
武嫣斐[10]（2006）在《原发性肝癌中医证候潜变量分析及其生物学基础的初步研究》文中研究指明目的:1.用潜变量分析技术探讨原发性肝癌中医证候辨证标准的建立方法,初步建立5种证候的结构方程。2.通过探索性分析,了解中医证型与中医症状和体征、细胞免疫、肝功能状态、肝纤维化指标的关系。3.探讨AFPmRNA、IGFIImRNA和GGTmRNA表达与原发性肝癌不同中医证候的关系。方法:采用流行病学研究方法,采集2003年10月至2005年12月太原市辖区四所医院的原发性肝癌患者用以下方法进行研究。1.调查原发性肝癌患者中医四诊信息,探讨证型分布特征及其与临床分期的关系。采用Binary logistic多元逐步回归分析初步判定证型与中医症状和体征的相关性。采用LISREL软件建立证候结构方程,并对其拟合度进行检验。2.以西医症状和体征为自变量,以中医证型为因变量,进行Binary logistic多元逐步回归分析,提出西医症状和体征的中西医结合的辨证方法。采用LISREL软件,建立以西医症状和体征为显变量的中医宏观证型结构模型,并对其进行拟合度检验。3.对患者临床实验室指标,以本证组与非本证组实验室指标进行比较,探讨本证的生物学基础。采用Binary logistic多元逐步回归分析的方法,确定中医证型的相关实验室指标,并以此为基础进行本证组与本证的组合组实验室指标比较,探讨本证演变的生物学基础。采用潜变量分析的方法,探讨实验室指标为显变量的潜在的变量—中医证型的存在,用LISREL软件建立中医证型微观辨证模式,并对其进行拟合度检验,分析中医证的生物学基础。4.采用探索性因子分析的方法,了解中医证型与原发性肝癌患者临床相关变量之间的关系。5.以原发性肝癌中医辨证为肝血瘀阻、脾气虚、肝胆湿热患者为研究对象,应用RT-PCR检测外周血单个核细胞中AFPmRNA、IGFIImRNA、和GGTmRNA的表达。并用Binary logistic多元逐步回归分析的方法,探讨AFPmRNA、IGFIImRNA、和GGTmRNA与中医证型的关系。结果:自2003年10月至2005年12月,共采集和观察原发性肝癌患者439例。1.原发性肝癌基本证型分布特点为单证、两证相合、三证相兼,单证187例占42.3%,两证相合213例占48.5%,三证相兼39例占9.2%。不同的中医症状和体征的组合具有一定的规律,原发性肝癌两证相合有肝血瘀阻合并脾气虚、脾气虚合并肝胆湿热、脾气虚合并肝肾阴虚、肝郁气滞合并肝血瘀阻、肝郁气滞合并脾气虚、肝血瘀阻合并肝胆湿热、肝血瘀阻合并肝肾阴虚、肝胆湿热合并肝肾阴虚、肝郁气滞合并肝胆湿热。原发性肝癌三证相兼表现为肝郁气滞、肝血瘀阻合并脾气虚;脾气虚、肝胆湿热合并肝肾阴虚;肝血瘀阻、脾气虚合并肝肾阴虚;肝血瘀阻、脾气虚合并肝胆湿热;肝郁气滞、肝血瘀阻合并肝肾阴虚;肝血瘀阻、肝胆湿热合并肝肾阴虚。2.证型与临床分期的关系:I期以肝郁气滞、肝血瘀阻、脾
二、人原发性肝癌分子生物学研究近况（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人原发性肝癌分子生物学研究近况（论文提纲范文）
（1）草苁蓉环烯醚萜苷对肝癌的抑制作用及其机制的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 第一部分 草苁蓉环烯醚萜苷含药血清抑制肝癌细胞增殖作用及机制 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第二部分 草苁蓉环烯醚萜苷抑制原发性肝癌形成及作用机制 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 创新点与展望 |
| 综述一 草苁蓉提取物药理学研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 肝癌相关的分子信号传导通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文目录 |
（2）原发性肝癌“毒瘀互结”的病机理论及丹参酮胶囊联合三氧化二砷干预机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分: 理论研究 |
| 一、病名溯源 |
| (一) 伏梁 |
| (二) 症积 |
| (三) 黄疸 |
| (四) 鼓胀 |
| (五) 胁痛 |
| 二、对原发性肝癌病因病机的认识 |
| (一) 病因的认识 |
| 1. 外邪因素 |
| 2. 饮食因素 |
| 3. 情志因素 |
| 4. 劳倦内伤 |
| (二) 原发性肝癌病机特点 |
| 1. 癌毒是肝癌发生发展的启动因素 |
| 2. 血瘀阻滞脉络是肝癌发生发展的基本病理机制 |
| 3. 正气不足是肝癌发病的内在条件 |
| 三、以毒攻毒、化瘀扶正是治疗原发性肝癌的基本治则 |
| 四、选药依据 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 实验研究 |
| (一) 实验一: 丹参酮胶囊联合ATO对肝癌bel-7404细胞增殖与凋亡的影响 |
| 1. 实验材料与方方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 分析与讨论 |
| 4. 小结 |
| 5. 参考文献 |
| 6. 附图 |
| (二)实验二: 丹参酮胶囊联合ATO对bel-7404细胞凋亡蛋白表达的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 分析与讨论 |
| 4. 小结 |
| 5. 参考文献 |
| (三)实验三: 丹参酮胶囊联合ATO对bel-7404细胞MAPK信号转导通路的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 分析与讨论 |
| 4. 小结 |
| 5. 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 附：文献综述 |
| 参考文献 |
（3）牛黄参对HepG2的P53、Bcl-2基因调控及细胞凋亡的影响研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1.中医对原发性肝癌的认识 |
| 1.1 中医对原发性肝癌病因病机的认识 |
| 1.2 中医对原发性肝癌治疗的认识 |
| 2.西医对原发性肝癌的认识 |
| 2.1 原发性肝癌发病机制 |
| 2.2 细胞凋亡与原发性肝癌的关系 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 NHS 含药血清对 HepG2 细胞的抑制率影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 NHS 含药血清对 HepG2 细胞的形态学影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 NHS 含药血清对 HepG2 细胞周期和凋亡百分率影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 NHS 含药血清对 HepG2 细胞的 P53、Bcl-2 基因蛋白表达的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验五 NHS 含药血清对 HepG2 细胞核增殖性抗原表达的影响44 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验六 NHS含药血清对HepG2细胞的Bcl-2和Bax mRNA相对 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验七 NHS 含药血清对 HepG2 细胞 Bcl-2, Bax 表达的影响表达的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 讨论 |
| 1.中药血清药理学实验方法探讨 |
| 1.1 中药血清药理学的含义与优点 |
| 1.2 中药血清药理学实验方法与应用 |
| 2.细胞模型及各检测方法评价 |
| 2.1 细胞模型选择 |
| 2.2 检测方法评价 |
| 3.牛黄参胶囊组方药物分析及现代药理探讨 |
| 3.1 牛黄 |
| 3.2 西洋参 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 综述一 细胞凋亡的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 抑癌基因 P53 与原发性肝癌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附图 1 HepG2 细胞荧光染色图 |
| 附图 2 HepG2 细胞 PCNA 免疫组化图 |
| 附图 3 HepG2 细胞 Bax、Bcl-2 免疫组化图 |
| 致谢 |
（5）疏肝清毒汤诱导人肝癌细胞HepG-2凋亡及其机制的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 第一节 肝癌概述 |
| 第二节 现代医学文献部分 |
| 1.肝癌的流行病学 |
| 2.肝癌的病因研究 |
| 3.肝癌分子与细胞生物学 |
| 4.肝癌的生物治疗 |
| 5.p53基因与肝癌的研究进展 |
| 6.原发性肝癌细胞凋亡的研究进展 |
| 第三节 中医学对肝癌的认识 |
| 1.肝癌的临床表现及中医学描述 |
| 2.肝癌的病因病机 |
| 第四节 抗肝癌中草药研究进展 |
| 第五节 疏肝清毒汤应用于诱导人肝癌细胞HepG-2凋亡及其机制的思路 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 疏肝清毒汤对HepG-2细胞的毒性作用实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 疏肝清毒汤对HepG-2细胞生长曲线的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 疏肝清毒汤对HepG-2细胞AFP分泌的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 疏肝清毒汤对HepG-2细胞ALT和LDH的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验五 疏肝清毒汤对HepG-2肝癌细胞凋亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验六 AO/EB荧光染色法测定疏肝清毒汤诱导HepG-2细胞凋亡 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验七 疏肝清毒汤对细胞凋亡调控基因p53的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验八 疏肝清毒汤对HepG-2肝癌细胞的Fas/FasL表达的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 主要创新点 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 外文缩略语表 |
| 致谢 |
（7）大鼠肝癌变进程中差异表达序列标签的初步筛选及分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 肝癌概述 |
| 1.2 肝癌的病因学 |
| 1.2.1 环境因素 |
| 1.2.2 内在因素 |
| 1.3 肝癌动物模型研究 |
| 1.3.1 动物模型概述 |
| 1.3.2 诱发性大鼠肝癌模型 |
| 1.4 MRNA 差异显示技术及在肿瘤研究中的应用 |
| 1.4.1 m RNA 差异显示技术的基本原理 |
| 1.4.2 m RNA 差异显示技术的优缺点 |
| 1.4.3 m RNA 差异显示技术的改进 |
| 1.4.4 m RNA 差异显示技术在肿瘤研究中的应用 |
| 1.5 肝癌相关基因的研究 |
| 1.5.1 肝癌相关癌基因 |
| 1.5.2 肝癌相关抑癌基因 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 大鼠肝癌模型的建立 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 一般试剂的配制 |
| 2.1.4 引物序列 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 组织病理切片制作与观察 |
| 2.2.2 总RNA 的提取及纯化 |
| 2.2.3 逆转录单链cDNA 的合成 |
| 2.2.4 PCR 扩增 |
| 2.2.5 差异表达片段的分离与回收 |
| 2.2.6 差异表达片段的二次PCR 及回收 |
| 2.2.7 PCR 产物的克隆及检测 |
| 2.2.8 DNA 片段的测序及核苷酸序列的分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 肝癌病理结果 |
| 3.1.1 大鼠体征观察结果 |
| 3.1.2 大鼠肝脏肉眼观察结果 |
| 3.1.3 病理切片显微观察结果 |
| 3.2 肝组织总RNA 的提取与纯化结果 |
| 3.3 CDNA 鉴定结果 |
| 3.4 MRNA 差异显示结果 |
| 3.5 差异表达片段二次扩增结果 |
| 3.6 差异表达片段的克隆转化结果 |
| 3.7 阳性转化子的鉴定结果 |
| 3.8 差异表达片段的测序及同源性分析结果 |
| 3.8.1 测序结果（部分测序图谱见图22） |
| 3.8.2 序列同源性分析结果 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 大鼠肝癌模型的建立 |
| 4.2 大鼠肝癌变进程中差异表达序列标签的初步分析 |
| 4.2.1 对已知ESTs 的分析 |
| 4.2.2 对未知ESTs 的分析 |
| 4.2.3 对未知基因的展望 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 图版 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（8）常见人体肿瘤转移动物模型的建立及相关机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第1章 不同免疫缺陷动物肿瘤原位移植模型生物学特性的比较 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 参考文献 |
| 第2章 肿瘤术后转移动物模型的建立 |
| 2.1 肝癌术后转移动物模型的建立 |
| 2.1.1 材料与方法 |
| 2.1.2 结果 |
| 2.1.3 讨论 |
| 2.1.4 参考文献 |
| 2.2 肺癌术后转移动物模型的建立 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.2.3 讨论 |
| 2.2.4 参考文献 |
| 第3章 肿瘤转移相关机制的体内和体外实验研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 参考文献 |
| 结论 |
| 附录1:缩略语与中英文对照 |
| 附录2: 综述 |
| 在读期间科研成绩 |
| 致谢 |
（9）限制性内切酶结合半巢式PCR法检测人肝癌P16抑癌基因启动子区甲基化研究（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 标本来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 引物设计与判断甲基化标准 |
| 1.4 组织DNA的提取 |
| 1.5 P16基因启动子区甲基化阳性质粒的构建 |
| 1.6 特异性和灵敏度检测 |
| 1.6.1 特异性检测 |
| 1.6.2 灵敏度检测 |
| 1.7 肝癌和正常组织DNA P16基因启动子区甲基化状态的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 P16基因启动子区甲基化阳性质粒的鉴定 |
| 2.2 特异性检测结果 |
| 2.3 灵敏度检测结果 |
| 2.3 P16基因启动子区甲基化状态检测 |
| 3 讨论 |
（10）原发性肝癌中医证候潜变量分析及其生物学基础的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一章 原发性肝癌中医证候宏观辨证潜变量分析 |
| 1 资料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小 结 |
| 参考文献 |
| 第二章 原发性肝癌西医症状和体征与中医证潜变量分析 |
| 1 资料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小 结 |
| 参考文献 |
| 第三章 原发性肝癌中医证型生物学基础分析 |
| 1 资料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小 结 |
| 参考文献 |
| 第四章 原发性肝癌中医证型探索性因子分析 |
| 1 资料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小 结 |
| 参考文献 |
| 第五章 原发性肝癌不同证型 AFPmRNA、IGFII－mRNA、GGTmRNA 基因表达 |
| 1 资料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小 结 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 综述原发性肝癌中医证候研究近况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、人原发性肝癌分子生物学研究近况（论文参考文献）
- [1]草苁蓉环烯醚萜苷对肝癌的抑制作用及其机制的实验研究[D]. 崔香丹. 延边大学, 2018(12)
- [2]原发性肝癌“毒瘀互结”的病机理论及丹参酮胶囊联合三氧化二砷干预机制的研究[D]. 常虹. 浙江中医药大学, 2015(01)
- [3]牛黄参对HepG2的P53、Bcl-2基因调控及细胞凋亡的影响研究[D]. 白山岭. 湖北中医药大学, 2014(12)
- [4]我国16个重点病种的国家中医临床研究基地论文统计表（2008年～2013年）[J]. 国家中医药管理局国家中医临床研究基地办公室. 世界科学技术-中医药现代化, 2013(05)
- [5]疏肝清毒汤诱导人肝癌细胞HepG-2凋亡及其机制的实验研究[D]. 李姵萱. 广州中医药大学, 2011(09)
- [6]原发性肝癌的中医药治疗研究近况[J]. 吴洁,白广德. 内蒙古中医药, 2010(13)
- [7]大鼠肝癌变进程中差异表达序列标签的初步筛选及分析[D]. 宋焱艳. 河南师范大学, 2008(01)
- [8]常见人体肿瘤转移动物模型的建立及相关机理研究[D]. 徐冰. 南方医科大学, 2007(03)
- [9]限制性内切酶结合半巢式PCR法检测人肝癌P16抑癌基因启动子区甲基化研究[J]. 蒋磊,覃扬,孙芝琳,孙泽芳,王锦红,杨鲁川. 四川大学学报(医学版), 2007(01)
- [10]原发性肝癌中医证候潜变量分析及其生物学基础的初步研究[D]. 武嫣斐. 山西医科大学, 2006(12)