一、用结核分枝杆菌HSP70启动子构建分枝杆菌穿梭表达质粒的研究（论文文献综述）
李大帅[1]（2018）在《布鲁氏菌L7/L12、Omp31基因及其融合基因在卡介苗中的表达及其试验原性研究》文中认为布鲁氏菌病是目前最为常见的动物疾病,可感染多种动物,在全球范围内广泛流行。这种疾病的感染可导致动物流产、消瘦,严重时可致动物死亡。其严重的临床症状及其流行特性,对国内外的养殖业造成了严重的经济危害,引起了国内外学者的广泛关注。接种疫苗是目前国际公认的预防动物疫病的最佳方法。市面上通用的布鲁氏菌疫苗主要为减毒活疫苗,包括S2、S19、M5、104M等。但近年来,动物感染布鲁氏菌的案例屡见不鲜,故本实验利用布鲁氏菌的L7/L12基因、Omp31基因及其融合基因L7/L12-Omp31构建重组卡介苗,以期预防布鲁氏菌病,为新型疫苗的研制做出有益的探索和尝试。1重组卡介苗rBCG-L7/L12、rBCG-Omp31、rBCG-L7/L12-Omp31的构建将卡介苗表达基因19kDa信号肽插入整合表达载体pMV361中,构建可将外源基因在卡介苗表达的新型重组载体pMV361L。之后将L7/L12基因、Omp31基因及L7/L12-Omp31融合基因通过同源重组方法分别插入到重组载体pMV361L中,共构建了三种重组整合表达质粒,分别命名为pMV361L-L7/L12、pMV361L-Omp31、pMV361L-L7/L12-Omp31。将三种整合表达质粒电转入卡介苗感受态中,经过抗酸染色及菌液PCR验证,表明整合表达质粒已成功转入卡介苗中,分别命名为rBCG-L7/L12、rBCG-Omp31、rBCG-L7/L12-Omp31。将鉴定正确的三种阳性重组卡介苗通过热诱导的方式表达出相应的目的蛋白,提取总蛋白并作Western Blot鉴定,结果显示,目的蛋白大小与预期大小相同。2重组卡介苗rBCG-L7/L12、rBCG-Omp31、rBCG-L7/L12-Omp31的免疫原性研究将三种重组卡介苗分别在第0天、14天、28天经腹腔免疫小鼠,并于免疫后第14天、28天、42天、56天,各组分别取三只进行眼球采血,取血清做抗体效价检测及细胞因子检测。免疫第56天时,取脾淋巴细胞,通过脾淋巴细胞增殖及T淋巴细胞亚群含量的测定综合评价小鼠的体液免疫和细胞免疫水平。抗体检测结果表明,重组卡介苗组均能产生不同程度的抗布鲁氏菌的特异性抗体;体外淋巴细胞增殖试验表明,重组卡介苗组的增殖效果高于对照组,融合基因组的增殖效果高于单一基因组,且运用S2菌液进行特异性刺激时,明显高于ConA刺激的效果,重组卡介苗能够诱导小鼠产生细胞免疫应答;T淋巴细胞亚群含量测定结果显示,重组卡介苗组的CD4+/CD8+比值均高于PBS组,表明重组卡介苗诱导的免疫反应主要以CD4+免疫为主。而细胞因子的检测结果表明,重组卡介苗能够诱导小鼠体内产生Th1型及Th2型免疫反应,且以Th1型反应为主导。另外,在整个免疫过程中,融合基因的重组卡介苗免疫效果高于单一基因重组卡介苗。本实验将布鲁氏菌L7/L12和Omp31基因融合后共同插入pMV361L表达载体,电转至卡介苗中实现共表达,对构建的重组卡介苗进行免疫试验研究。这将为研制出有效预防布鲁氏菌病的基因工程疫苗做出有益的探索和尝试。
王鑫[2]（2011）在《分枝杆菌同源膜锚定表达载体的构建与细胞定位分析》文中研究说明结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是引起结核病（tuberculosis）的病原菌,而卡介苗（bacillus Calmette-Guérin,BCG）是全球公认的唯一有效的结核疫苗。通过表达某些重要保护性抗原编码基因来构建重组卡介苗（recombinant bacillus Calmette-Guérin,rBCG）是改进结核疫苗效力的重要方法之一。通常情况下,构建的rBCG将抗原分泌至胞外或锚定于细胞外膜表面,可更为有效地递呈并产生免疫反应。目的:比较结核分枝杆菌（M. tb）突变型启动子pfurAma的突变体pfurAma-N和pfurAma-N3以及phsp60控制基因表达的活性,用以构建分枝杆菌膜锚定表达载体,并分析外源目的蛋白的表达情况及其亚细胞定位分析。方法:PCR扩增启动子pfurAma突变体,并在其5’端额外引入NdeⅠ酶切位点以便于信号序列或标签分子的克隆,并将导致的pfurAma-N（pfurAma启动子起始密码子上游-3-1位AGT→CAT突变）和pfurAma-N3（pfurAma启动子起始密码子上游-1位增加三个密码子CAT）分别亚克隆入探针载体pMC210,以pfurAma和phsp60启动子重组报告质粒分别电转化耻垢分枝杆菌mc2155,通过检测胞外β-半乳糖苷酶活性评估启动子活性。然后选取最强的启动子pfurAma-N取代pMV261载体中的phsp60启动子,从而构建胞内表达载体pMFA42。随后,人工合成带有NdeⅠ和BamHⅠ粘性末端的结核分枝杆菌19 kDa抗原膜结合信号序列的正义链和反义链,退火后将其直接亚克隆至pMFA42载体中构建膜锚定表达载体pMFA42M。PCR扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）编码基因,分别亚克隆至上述两种不同类型的载体中并电转化耻垢分枝杆菌（M.s）,分别获得重组EGFP融合胞内表达菌株和膜锚定表达菌株;接着,将M. tb主要保护性抗原Ag85A及其嵌合抗原Ag856A2的编码基因亚克隆入膜锚定表达载体pMFA42M中构建M. tb抗原-EGFP融合表达菌株;通过Western-blot和流式细胞表面标记技术来分析目的抗原的表达水平及其亚细胞定位,并进一步通过荧光显微镜直接观察重组EGFP融合表达菌株在体外和感染巨噬细胞后的荧光强度。结果:成功扩增出启动子突变体pfurAma-N和pfurAma-N3,启动子活性分析发现pfurAma启动子起始密码子上游三位密码子的突变并不影响启动子活性,pfurAma-N与pfurAma活性相当,均为phsp60活性的2倍左右;而增加启动子和起始密码间的距离则将导致其活性显着下降,pfurAma-N3活性仅为phsp60的一半。通过引入M. tb 19 kDa脂蛋白膜分泌信号,在高效的启动子pfurAma-N的驱动下,成功地构建了分枝杆菌膜锚定表达载体。利用EGFP作为标签抗原,通过Western-blot、荧光显微观察和流式细胞表面标记等技术均证实了外源目的抗原可在分枝杆菌中高水平表达并定位至细胞膜上。结论:本研究为重组BCG和分枝杆菌膜蛋白功能研究提供了一种新型的膜锚定表达载体,所构建的EGFP重组表达菌株亦可作为一种模式示踪菌为细胞吞噬和动物免疫中的细菌定植和移位分析提供新的思路。
曾瀚庆,吕琳,梅浙川,王丕龙,娄世锋[3]（2010）在《采用卡介苗结核蜡酸合酶启动子构建分枝杆菌穿梭表达质粒》文中提出目的采用卡介苗（BCG）结核蜡酸合酶（Mycocerosic acid synthase,Mas）启动子,将分枝杆菌穿梭质粒pJEM11改建为分枝杆菌穿梭表达质粒。方法 PCR扩增BCG基因组中Mas启动子,定向克隆至质粒pJEM11的ApaⅠ与SnaBⅠ位点之间,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pJMas。将幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）UreB基因克隆至pJMas质粒,转化耻垢分枝杆菌（Mycobacteria smegmatis,M.smegmatis）mc2155,SDS-PAGE检测重组UreB蛋白在M.smegmatis mc2155中的表达,Western blot分析其反应原性。结果克隆的Mas启动子序列与结核杆菌H37Rv株的Mas启动子序列（gi31619628）同源性达99%;重组穿梭表达质粒pJMas经PCR及双酶切鉴定证明构建正确;UreB基因在M.smegmatis mc2155中成功表达,表达的蛋白可与Hp阳性病人血清发生特异性反应。结论成功构建分枝杆菌穿梭表达质粒pJMas,为构建以耻垢分枝杆菌为载体的多价疫苗奠定了基础。
王秋悦[4]（2009）在《柔嫩艾美耳球虫rhomboid基因重组卡介苗的构建及其免疫保护性研究》文中进行了进一步梳理鸡球虫病（Coccidiosis）是由艾美耳属（Eimeria）的各种球虫寄生在鸡的肠道引起的寄生性原虫病,所有日龄和品种的鸡都易感,严重影响了养殖业的发展。卡介苗（BCG）集佐剂与抗原于一身,是表达外源基因的理想活菌疫苗载体。为探讨重组卡介苗（rBCG）对鸡球虫感染的免疫保护作用,本研究首先构建了E.tenella rhomboid基因穿梭表达载体pMV261-Rho和整合表达载体pMV361-Rho,并在BCG内进行了rhomboid基因的诱导表达和免疫原性分析;然后将两种rBCG疫苗通过不同途径免疫雏鸡,观察其对动物免疫保护效果;在此基础上构建EGFP标记的rBCG,对Rhomboid蛋白在鸡体内各组织器官中的分布及稳定性和消长规律进行了研究;此外还将rhomboid基因与鸡IL-2基因（ChIL-2）联合构建rBCG,观察抗球虫效果。结果表明在鸡肝、脾、肺、肾、盲肠各组织器官均检测到rhomboid基因表达,雏鸡免疫14天后基因表达量达到最高,随后开始下降,至28天后消失;动物免疫保护性实验表明rBCG疫苗对E.tenella卵囊的攻击具有一定的免疫保护作用,诱导产生细胞免疫和体液免疫反应,且以滴鼻方式免疫效果最佳,抗球虫指数为174.6;将rhomboid基因与ChIL-2基因联合在卡介苗中表达,结果显示IL-2具有明显增强Rhomboid蛋白的免疫保护作用,其中pMV261-Rho-IL-2滴鼻免疫组保护效果最为明显,抗球虫指数ACI达到180以上,已达到临床使用的要求。本研究为球虫病的预防奠定了基础。
吕琳,曹红丹,王丕龙,刘少宁,王丽娟,向廷秀[5]（2008）在《分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70的构建及鉴定》文中指出目的用结核分枝杆菌热休克蛋白70（heat shock protein70,HSP70）启动子改建分枝杆菌穿梭质粒pJEM11为分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70,并对其功能进行鉴定。方法以卡介苗（BCG）基因组DNA为模板,利用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增HSP70启动子,克隆至pMD18-T载体,经鉴定后,再定向克隆入pJEM11的ApaⅠ位点与SnaBⅠ位点之间,构建pJHSP70载体,并对载体进行PCR及酶切鉴定,然后再将幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,HP）尿素酶B亚单位（urease B subunit,UreB）基因克隆入pJHSP70载体,评价其在耻垢分枝杆菌（Mycobacteria smegmatis,M.smegmatis）mc2155中的表达情况。结果从BCG基因组中扩增出160bp的基因片段,所构建的穿梭质粒经酶切和PCR鉴定与预期结果一致。测序结果证实插入片段正确,UreB基因在M.smegmatis中成功表达。结论成功改建穿梭质粒pJEM11为穿梭表达质粒pJHSP70。
柏佳宁,边艳青,赵宝华[6]（2007）在《肾型IBVS1基因重组BCG菌株的构建及其免疫原性研究》文中认为S1基因是传染性支气管炎病毒（IBV）的主要保护性抗原基因,应用RT-PCR技术特异地扩增嗜肾型传染性支气管炎病毒X株的S1基因,经序列分析证实为S1基因,将其连接到含有人结核分枝杆菌启动子hsp70基因和堪萨斯分枝杆菌α信号肽基因的表达载体pRR3上,从而构建了大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pR-α-S1,再电转化至BCG中,形成重组菌株rBCG-S1。热激后S1蛋白在耻垢分枝杆菌M.smegmatismc2155中高效表达,并且通过ELISA和Western blot检测能够被抗IBVS1蛋白的单克隆抗体识别。将106CFU的重组菌株rBCG-S1皮下注射免疫6周龄的SPF鸡,动物保护试验结果表明重组菌株rBCG-S1对鸡具有一定的免疫保护效果,能够保护SPF鸡抵抗IBVX毒株强毒攻击。血凝抑制试验表明血凝抑制抗体滴度能够显着增加。构建的重组菌株为今后开发新型鸡传染性支气管炎基因工程弱毒疫苗奠定了基础。
向廷秀[7]（2006）在《幽门螺杆菌重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建及作用机理研究》文中研究表明背景和目的:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）是慢性胃炎和消化性溃疡的重要病因,与胃癌和胃MALT淋巴瘤的发病也有密切关系。目前临床上常用的三联疗法不足以根治Hp感染,甚至导致耐药菌的不断增多,费用昂贵,病人依从性差,容易复发。免疫接种是彻底消除Hp感染的有效措施,目前Hp疫苗的研究主要为免疫保护抗原加佐剂,但效果仍不够满意。研究新的疫苗预防Hp感染已成为当前国内外研究的热点。重组活载体疫苗具有无需纯化抗原、无需佐剂、可避免抗原在胃内的降解和变性等优点,被认为是最有开发和应用前景的疫苗。卡介苗（Bacille Calmette-Guérin,BCG）是理想的重组活载体疫苗。近10年的研究表明,BCG有诸多不足:（1）难于培养;（2）对多种抗生素有抗药性;（3）转化率低;（4）对于免疫力低下者,有可能诱发致命的结核病。人们期待着基因工程新载体的出现,许多学者转向非致病分枝杆菌作为载体的研究。耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis,M.S）是一类快速生长型分枝杆菌,生长快,1～3h繁殖1代,M.S既是一种非致病菌又是一种细胞免疫佐剂,很多外源蛋白能在M.S中表达。这为进一步研究
张灵霞[8]（2005）在《卡介苗重组疫苗的构建、免疫原性及抗结核作用的初步研究》文中提出目的:构建结核分枝杆菌重组卡介苗,研究其免疫原性及抗结核作用,以期获得结核病预防性和治疗性疫苗。 方法:通过基因工程重组技术将结核分枝杆菌保护性抗原ESAT6、MPT64、Ag85A、Ag85B的编码基因分别与穿梭质粒载体PMD31、pYUB295重组,通过电穿孔技术导入卡介苗中,应用PCR扩增、PAGE电泳鉴定重组卡介苗。将重组卡介苗免疫小鼠后,通过ELISA法检测其血清中特异性抗体,用MTS法分析其脾淋巴细胞增殖指数;结核分枝杆菌攻击后,通过小鼠半数死亡时间、一定时间内的死亡率、肺、肝、脾细菌生长最低稀释度等指标评价各重组卡介苗对结核分枝杆菌感染的预防作用和治疗效果。 结果:通过PCR扩增获得esat6、mpt64、ag85a、ag85b基因,与穿梭表达载体PMD31、pYUB295重组后,通过PCR扩增、限制性内切酶酶切、DNA测序鉴定表明成功地构建了esat6、mpt64、ag85a、ag85b基因PMD31、pYUB295重组质粒。 将各重组质粒通过电穿孔导入卡介苗。质粒PMD31重组卡介苗在抗性培养上不能很好生长,质粒pYUB295重组卡介苗在抗性培养基上生长良好。pYUB295-目的基因重组卡介苗基因组DNA的PCR扩增以
姚建忠,许崇波,刘齐贵,靳风烁[9]（2005）在《表达人白细胞介素-2重组耻垢分枝杆菌疫苗株的建立》文中研究表明目的 建立表达人IL 2重组耻垢分枝杆菌疫苗株,为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治膀胱癌打下基础。方法 分别从中间质粒pY60 13和pIJK 1中克隆出分枝杆菌热休克蛋白70 （HSP70 ）启动子和堪萨斯分枝杆菌α抗原信号肽,再从质粒pHIG5 3中利用PCR扩增出不含信号肽的IL 2cDNA ,利用分枝杆菌质粒pRR3构建IL 2分枝杆菌穿梭表达载体并使IL 2在其中分泌表达。将重组质粒电转化到耻垢分枝杆菌中建立重组耻垢分枝杆菌疫苗株。连续传代培养观察重组菌株的稳定性。Westernblot和IL 2活性测定等方法观察IL 2的表达及其活性。结果 经测序表明HSP70、α抗原信号肽及IL 2的序列及读码框架均正确。Westernblot及IL 2活性检测表明在重组耻垢分枝杆菌上清中有IL 2表达,其生物活性为118 5U/ml （细菌浓度为5×10 5CFU /ml,其培养时间为3 6h）。结论 成功建立了分泌人IL 2的重组耻垢分枝杆菌,为进一步防治膀胱肿瘤的复发奠定了基础。
郑海洲,杨虹,柏佳宁,赵宝华[10]（2004）在《鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达》文中认为以ILTV基因组为模板 ,利用PCR特异扩增出gB基因 ,定向克隆到中间质粒载体pYα ,构建了中间质粒pYαgB。然后以中间质粒pYαgB为模板 ,扩增出含有人结核分枝杆菌启动子hsp70基因和堪萨斯分枝杆菌α信号肽基因的hspαgB片段 ,回收补平后与穿梭表达载体pRR3平端连接 ,从而构建大肠杆菌分枝杆菌穿梭表达质粒pRαgB。再将其电转化至耻垢分枝杆菌M .smegmatismc2 15 5 ,ELISA检测表明重组菌株M .smegmatismc2 15 5 （pRαgB）的表达产物具有很好的反应原性。Westernblot检测说明gB基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性。鸡胚中和试验结果表明该重组菌株可以中和 1个剂量EID50 的ILTV强毒 ,能够保护SPF鸡胚抵抗强毒攻击
二、用结核分枝杆菌HSP70启动子构建分枝杆菌穿梭表达质粒的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用结核分枝杆菌HSP70启动子构建分枝杆菌穿梭表达质粒的研究（论文提纲范文）
（1）布鲁氏菌L7/L12、Omp31基因及其融合基因在卡介苗中的表达及其试验原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 综述部分 |
| 第一章 布鲁氏菌病研究进展 |
| 1.1 布鲁氏菌病简介 |
| 1.2 布氏杆菌分型 |
| 1.3 布鲁氏菌病理学特征 |
| 1.4 布鲁氏菌生物学特征 |
| 1.5 布鲁氏菌诊断方法 |
| 1.6 布鲁氏菌L7/L12及Omp31基因 |
| 1.7 布鲁氏菌的疫苗开发 |
| 第二章 卡介苗研究进展 |
| 2.1 卡介苗简介 |
| 2.2 重组卡介苗研究进展 |
| 2.3 影响因素 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 整合表达载体的改造及质粒的构建 |
| 1.1 材料和仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 重组卡介苗rBCG-L7/L12、rBCG-Omp31、rBCG-L7/L12-Omp31的构建及表达 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组卡介苗rBCG-L7/L12、rBCG-Omp31、rBCG-L7/L12-Omp31的免疫原性研究 |
| 3.1 材料及仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）分枝杆菌同源膜锚定表达载体的构建与细胞定位分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 重组卡介苗的研究进展 |
| 1 卡介苗简介 |
| 2 重组卡介苗的问世 |
| 3 重组卡介苗应用载体介绍 |
| 3.1 构建重组卡介苗载体的启动子 |
| 3.2 分泌表达载体 |
| 4 未来研究趋势 |
| 第二部分 研究报告 |
| 第二章 研究目的与内容 |
| 1 研究目的及意义 |
| 2 研究策略与内容 |
| 2.1 分析新型启动子活性 |
| 2.2 膜锚定表达载体的构建与细胞定位分析 |
| 3 技术路线 |
| 第三章 分枝杆菌新型启动子活性分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 启动子突变体pfurAma-N 和pfurAma-N3 的PCR 扩增 |
| 3.2 启动子基因的亚克隆与酶切鉴定 |
| 3.3 启动子活性的比较 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 膜锚定表达载体的构建与细胞定位 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 分枝杆菌膜锚定表达载体的构建 |
| 3.2 EGFP 标签融合表达载体的构建 |
| 3.3 重组膜锚定融合表达载体pMFA42MAG 和pMFA42MA2G 的构建 |
| 3.4 Western-blot 分析目的蛋白的表达情况及其亚细胞定位 |
| 3.5 荧光显微观察重组菌的体外和感染巨噬细胞后的EGFP 表达情况 |
| 3.6 流式细胞术分析目的蛋白的亚细胞定位 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 1 已取得的成果 |
| 2 有待进行的研究 |
| 附录一： 缩略词中英文对照表 |
| 附录二： 实验中使用的部分载体结构图 |
| 附录三 攻硕期间科研情况 |
| 1 研究课题 |
| 2 发表论文 |
| 致谢 |
（3）采用卡介苗结核蜡酸合酶启动子构建分枝杆菌穿梭表达质粒（论文提纲范文）
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 质粒及菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 Mas启动子基因的扩增 |
| 1.4 重组克隆质粒的构建 |
| 1.5 分枝杆菌穿梭表达质粒p JMas的构建 |
| 1.6 重组分枝杆菌穿梭表达质粒表达功能的鉴定 |
| 2. 结果 |
| 2.1 Mas启动子扩增产物的鉴定 |
| 2.2 重组克隆质粒的鉴定 |
| 2.3 重组穿梭表达质粒的鉴定 |
| 2.4 重组分枝杆菌穿梭表达质粒的表达功能 |
| 3. 讨论 |
（4）柔嫩艾美耳球虫rhomboid基因重组卡介苗的构建及其免疫保护性研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 寄生虫重组卡介苗的研究 |
| 1.1 重组卡介苗的特点 |
| 1.2 重组卡介苗的构建 |
| 1.3 重组卡介苗抗寄生虫感染 |
| 1.4 重组卡介苗的应用 |
| 第2章 鸡球虫病免疫预防及现状 |
| 2.1 球虫病的流行与危害 |
| 2.2 球虫疫苗研究现状 |
| 2.3 球虫病免疫机制的研究 |
| 2.4 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 重组质粒pMV261-Rho和pMV361-Rho的构建及在卡介苗中的表达 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 重组卡介苗pMV261-Rho和pMV361-Rho对鸡柔嫩艾美耳球虫的免疫保护性实验 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 EGFP标记重组质粒pMV361-Rho-EGFP的构建及在鸡体内分布研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 重组质粒pMV261-Rho-IL-2 和pMV361-Rho-IL-2 的构建及在卡介苗中的表达 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 重组卡介苗pMV261-Rho-IL-2 和pMV361-Rho-IL-2 对鸡柔嫩艾美耳球虫的免疫保护性实验 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 pMV261 和 pMV361 载体图谱 |
| 攻博期间发表的学术论文及其他成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
（5）分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70的构建及鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒和菌株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 HSP70启动子的扩增 |
| 1.2.2 T载体重组质粒的构建及鉴定 |
| 1.2.3 重组穿梭表达质粒pJHSP70的构建及鉴定 |
| 1.2.4 重组穿梭表达质粒pJHSP70表达功能的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 HSP70启动子基因片段的扩增 |
| 2.2 T载体重组质粒pMD-HSP70的构建及鉴定 |
| 2.3 重组穿梭表达质粒pJHSP70的鉴定 |
| 2.3.1 PCR鉴定 |
| 2.3.2 酶切鉴定 |
| 2.4 重组质粒pJHSP70表达功能的鉴定 |
| 3 讨论 |
（7）幽门螺杆菌重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建及作用机理研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 正文：幽门螺杆菌重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建及作用机理研究 |
| 前言 |
| 第一部分 重组耻垢分枝杆菌疫苗株的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 幽门螺杆菌重组耻垢分枝杆菌疫苗体内外稳定性研究及在小鼠体内的定植 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 重组耻垢分枝杆菌疫苗抗幽门螺杆菌免疫保护实验及免疫保护机理初探 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本课题创新点 |
| 图片 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表文章 |
| 申请基金情况 |
（8）卡介苗重组疫苗的构建、免疫原性及抗结核作用的初步研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
（9）表达人白细胞介素-2重组耻垢分枝杆菌疫苗株的建立（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 PCR引物设计及目的片段的扩增 |
| 1.2.2 分枝杆菌穿梭表达载体pR-α-IL-2的构建 |
| 1.3 重组分枝杆菌疫苗株的构建及体外检测 |
| 1.4 重组分枝杆菌的生长特性和体外传代稳定性分析 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 分枝杆菌穿梭表达载体pR-α-IL-2的构建与鉴定 |
| 2.2 重组分枝杆菌疫苗株的建立及鉴定 |
| 2.2.1 穿梭表达载体pR-α-IL-2的电转化 |
| 2.2.2 重组分枝杆菌分泌表达的免疫印迹分析 |
| 2.2.3 IL-2活性测定结果 |
| 2.2.4 重组分枝杆菌的生长曲线 |
| 2.2.5 重组分枝杆菌体外传代稳定性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 分枝杆菌穿梭表达载体的构建特点及优势 |
| 3.1.1 具有强的高效可控启动子 |
| 3.1.2 α抗原信号肽的特点 |
| 3.2 重组耻垢分枝杆菌的特点 |
| 3.3 IL-2在重组分枝杆菌中的表达和活性分析 |
（10）鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株和质粒: |
| 1.1.2 酶和试剂: |
| 1.1.3 实验动物和疫苗: |
| 1.2 ILTV gB基因的扩增 |
| 1.3 重组中间质粒pY_α_gB的构建 |
| 1.4 hsp_α_gB片段的扩增和序列分析 |
| 1.5 重组穿梭表达质粒pR_α_gB的构建 |
| 1.6 耻垢分枝杆菌的培养和电穿孔转化 |
| 1.7 表达产物gB糖蛋白的免疫学检测 |
| 1.8 重组菌株的鸡胚中和试验 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 中间载体pY_a的酶切鉴定 |
| 2.2 ILTV gB基因的PCR扩增和同源性分析 |
| 2.3 重组中间质粒pY_α_gB的构建 |
| 2.4 hsp_α_gB目的片段的扩增和测序 |
| 2.5 间接ELISA检测表达产物与抗体的特异性反应 |
| 2.6 重组分枝杆菌表达产物的Western blot 检测 |
| 2.11 重组菌株的鸡胚中和试验结果 |
| 3 讨论 |
四、用结核分枝杆菌HSP70启动子构建分枝杆菌穿梭表达质粒的研究（论文参考文献）
- [1]布鲁氏菌L7/L12、Omp31基因及其融合基因在卡介苗中的表达及其试验原性研究[D]. 李大帅. 吉林农业大学, 2018(03)
- [2]分枝杆菌同源膜锚定表达载体的构建与细胞定位分析[D]. 王鑫. 苏州大学, 2011(06)
- [3]采用卡介苗结核蜡酸合酶启动子构建分枝杆菌穿梭表达质粒[J]. 曾瀚庆,吕琳,梅浙川,王丕龙,娄世锋. 中国生物制品学杂志, 2010(10)
- [4]柔嫩艾美耳球虫rhomboid基因重组卡介苗的构建及其免疫保护性研究[D]. 王秋悦. 吉林大学, 2009(08)
- [5]分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70的构建及鉴定[J]. 吕琳,曹红丹,王丕龙,刘少宁,王丽娟,向廷秀. 第三军医大学学报, 2008(10)
- [6]肾型IBVS1基因重组BCG菌株的构建及其免疫原性研究[J]. 柏佳宁,边艳青,赵宝华. 微生物学报, 2007(02)
- [7]幽门螺杆菌重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建及作用机理研究[D]. 向廷秀. 重庆医科大学, 2006(01)
- [8]卡介苗重组疫苗的构建、免疫原性及抗结核作用的初步研究[D]. 张灵霞. 北京市结核病胸部肿瘤研究所, 2005(07)
- [9]表达人白细胞介素-2重组耻垢分枝杆菌疫苗株的建立[J]. 姚建忠,许崇波,刘齐贵,靳风烁. 第三军医大学学报, 2005(07)
- [10]鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达[J]. 郑海洲,杨虹,柏佳宁,赵宝华. 微生物学报, 2004(06)