一、Development of Gene Expression and Gene Silencing Vectors Based onCotton Leaf Curl Virus for Functional Genomics in Cotton（论文文献综述）
郝梦媛,杭琦,师恭曜[1]（2022）在《VIGS基因沉默技术在作物基因功能研究中的应用与展望》文中指出随着作物基因组测序工作的陆续完成,大量影响作物重要农艺性状的基因功能等待挖掘。由于缺少高效的遗传转化方法,多种作物的基因功能研究进展缓慢。病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术不依赖遗传转化,通过病毒载体接种即可在当代植物体内实现对靶向基因的沉默。VIGS技术因其起效时间快、沉默效率高、操作成本低、便于高通量和应用植物范围广等特点,被越来越多地应用于不同作物基因功能和代谢通路解析的反向遗传学研究中。介绍了VIGS的技术原理及其发展过程,系统归纳了VIGS在不同作物中的应用,总结和讨论了现有VIGS应用的局限性以及影响其沉默效率的几个关键因素,并对VIGS技术在未来植物生物学研究中的应用进行了展望,以期为VIGS技术的进一步应用和发展提供参考。
李雨珈[2]（2021）在《桑树中与桑脉带相关病毒N蛋白互作的蛋白筛选、鉴定及其表达分析》文中进行了进一步梳理桑脉带相关病毒（Mulberry vein banding associated virus,MVBa V）是桑树病毒病的主要病原病毒,属于番茄斑萎病毒科（Tospoviridae）正番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus）的成员,其S RNA编码的核外壳（nucleocapsid,N）蛋白。筛选、鉴定MVBa V N蛋白互作蛋白,进而研究其互作机制对揭示MVBa V的致病机理具有重要作用。前期研究中我们制备了MVBa V N蛋白多克隆抗体,本研究在检测其灵敏度和特异性的基础上,采用免疫共沉淀筛选N蛋白的互作蛋白,并经双分子荧光互补和酵母双杂交系统对10个候选互作蛋白进行验证,对部分编码互作蛋白的基因进行表达分析。主要研究结果如下:1、通过Western blot验证,表明所制备的抗体能够检测出低至0.50 ng的MVBa V N融合蛋白,在稀释倍数1:1000时与细菌表达的融合N蛋白及感病桑叶中的N蛋白产生特异性识别,不与寄主蛋白产生交叉反应,表明具有良好的特异性和较高的灵敏度。2、以具有典型桑脉带病症状的桑叶为材料提取总蛋白,利用免疫共沉淀联合质谱分析（Co IP-MS）的方法,筛选到与MVBa V N存在相互作用的蛋白有106个,其中包括MVBa V编码的运动蛋白（non-structural movement,NSm）、非结构蛋白（non-structural suppressor,NSs）、核外壳蛋白（nucleocapsid protein,N蛋白）。3、选取类乳胶蛋白423（MLP-like protein 423,MLP-LP423）、结瘤素相关蛋白1（Nodulin-related protein 1,NRP1）、果胶酯酶（Pectinesterase,PECT）、烯醇化酶（Enolase,ENO）、14-3-3蛋白B（14-3-3-like protein B,14-3-3LPB）、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（Fructose-bisphosphate aldolase,FBA）、核糖体再循环因子（Ribosome-recycling factor,RRF）、丝氨酸羟甲基转移酶（Serine hydroxymethyltransferase,SHMT）、腺苷高半胱氨酸水解酶（Adenosylhomocysteinase,SAHH）和丙二烯氧化物合酶（Allene oxide synthase,AOS）共10个候选互作蛋白进行双分子荧光互补试验和酵母双杂交系统验证,结果显示,MLP-LP423、NRP1、PECT、14-3-3LPB、FBA、RRF和SAHH共7个蛋白与病毒N蛋白之间存在互作。4、利用实时荧光定量PCR对14-3-3LPB、PECT、RRF、SAHH基因在健康桑树、病毒病桑树以及不同非生物胁迫和激素处理桑幼苗的表达模式进行检测。桑树受MVBa V侵染后,14-3-3LPB的表达量在根部和茎部中呈上调表达;PECT的表达量在叶部和茎部中呈上调表达,在根部中呈下调表达;RRF的表达量在上部叶片和茎部中呈上调表达;SAHH的表达量在根部及叶部中呈上调表达,在茎部中呈下调表达。PECT在不同非生物胁迫和激素处理下的表达量均呈现下调趋势,14-3-3LPB、RRF和SAHH的变化趋势则各不相同。研究结果为进一步阐明MVBa V的致病机制及其与寄主蛋白之间的互作机制打下一定基础。
雷建峰[3]（2021）在《棉花高效CRISPR/Cas9基因编辑体系的研究》文中指出棉花基因功能的鉴定和新品种的选育离不开突变体的获得,CRISPR/Cas9基因组编辑技术的出现为实现棉花分子育种提供了强大的技术工具。目前,棉花基因编辑技术体系已经建立并陆续得到升级和改良（CRISPR/Cpf1和单碱基编辑系统）。然而,要实现棉花目标基因的靶向编辑必须要经过转基因,通过组织培养的方法才能获得目标基因突变体。而棉花的遗传转化费时费力,周期长,且受棉花品种基因型的限制,仅有少数几个棉种可以进行有效的遗传转化。针对以上问题,本研究主要开展了两种途径的研究。第一种途径:以棉花花粉作为转基因受体,构建棉花生殖特异性CRISPR/Cas9基因编辑体系,在花粉内部靶向敲除目标基因,然后以突变后的花粉通过授粉的方式获得棉花突变体;第二种途径:建立基于棉花叶皱缩病毒CLCr V介导的基因编辑系统（VIGE）,以超表达Cas9（Cas9-OE）的棉花作为转基因受体,利用拟南芥成花素FT基因将sg RNA长距离运输至棉花顶端分生组织的功能,以期避开组织培养的过程来获得稳定遗传的棉花突变体。验证通过以上两种途径可以避开组织培养,高效获得棉花突变体。主要研究结果如下:1.在棉花TM-1根、茎、叶、花粉、萼片和花瓣6个组织中分析了GhPLIM2b和GhMYB24基因的组织特异性。结果显示:GhPLIM2b基因在棉花花粉中特异表达,而GhMYB24是一个在棉花花粉中表达的基因;进而克隆了GhPLIM2b（1530 bp）和GhMYB24（1435 bp）启动子,并成功构建了GhPLIM2b P::GUS和GhMYB24P::GUS的融合表达载体。瞬时转化棉花花粉GUS组织化学染色结果显示:GhPLIM2b和GhMYB24启动子均能驱动GUS在棉花花粉中表达,棉花花粉被染成蓝色,且这两个启动子转录活性无明显差异;使用GhPLIM2b和GhMYB24启动子驱动Cas9基因表达,设计了靶向编辑棉花GhCLA1、GhGGB和GhERA1的编辑载体。突变检测结果显示:GhMYB24P::Cas9和GhPLIM2b P::Cas9编辑载体均可以实现对棉花花粉内源基因的靶向编辑,编辑效率为3.29%-6.45%,且这两个编辑系统编辑效率无明显差异,但存在少数的脱靶现象。由于转化后的大部分花粉已经失去了授粉活力,导致无法以基因编辑的花粉通过授粉的方式获得可遗传基因编辑的后代。本研究证明了GhPLIM2b P::Cas9和GhMYB24P::Cas9编辑体系的有效性,为使用棉花花粉作为转基因受体快速获得棉花突变体提供了有效的基因编辑系统。2.在拟南芥中建立了基于棉花叶皱缩病毒CLCrV介导的VIGE系统,以Cas9-OE拟南芥作为转基因受体,利用CLCr V介导的VIGE系统靶向敲除了拟南芥BRI1、GL2和PDS以及转基因GUS基因,验证了该系统的可行性和高效性;同时,证明了以分生组织高效表达的Pro Yao::Cas9转基因拟南芥作为转基因受体,可以显着提高CLCr V介导的VIGE的基因编辑效率;针对VIGE系统的不足,进一步将102 bp FT m RNA与sg RNA融合去转化Pro Yao::Cas9和Pro35S::Cas9拟南芥,探究利用拟南芥成花素FT基因将sg RNA长距离运输至植物顶端分生组织的功能,以期避开组织培养的过程来获得稳定遗传的突变后代。结果显示:5’端融合了FT m RNA的sg RNA（FT策略）,可以在当代植株中有效实现基因编辑。同时,也可以不经过稳定遗传转化的过程获得可遗传的突变后代,后代发生编辑的效率为4.35%-8.79%。此外,由FT-sg RNA产生的基因编辑的后代中并不存在CLCr V病毒基因组成分。利用FT-sg RNA策略在拟南芥上获得了可遗传给后代的基因编辑,展现了该策略在作物功能基因组学和分子设计育种中具有广阔的应用前景。3.为了扩展CLCrV介导的VIGE体系的应用范围,在棉花中测试了CLCr V介导的VIGE系统的可行性。以Cas9-OE棉花作为转基因受体,利用CLCr V介导的VIGE系统高效地实现了棉花GhPDS和GhCLA1基因的靶向编辑,证明了CLCr V介导的VIGE系统同样适用于棉花;与此同时,CLCr V介导的VIGE系统在棉花中可以同时投送多个sg RNAs,实现了棉花GhPDS和GhCLA1基因的双突变;鉴于FT-sg RNA策略在拟南芥中能够实现可遗传的基因编辑后代,进一步验证该策略在棉花中是否同样适用。结果显示:102 bp的FT m RNA融合到sg RNA的5’同样也能够实现棉花内源基因GhPDS、GhCLA1、GhBsrk1和GhMAPKKK2的靶向编辑;在棉花中CLCr V介导的VIGE系统,在不依赖FT-sg RNA的情况下,仍然可以实现棉花胚珠细胞的基因编辑。且由CLCr V介导的VIGE产生的基因编辑的后代（胚珠）中并不存在CLCr V病毒基因组成分。CLCr V介导的VIGE系统在棉花中的成功应用为棉花生物学研究、大规模构建棉花基因突变体库和实现棉花全基因组水平上的精准遗传改良奠定了重要的技术基础。
斯欢[4]（2021）在《全基因组关联分析解析棉花代谢产物的遗传和生化基础》文中进行了进一步梳理植物能够合成大量结构与功能各异的代谢产物,其中一些代谢产物与作物品质以及抗性的形成有着密切的关联。解析这些代谢产物的遗传及生化基础对于解析复杂数量性状形成的调控机制有重要的意义。本研究利用代谢组及全基因组关联分析方法对棉花代谢谱以及代谢产物自然变异的遗传基础进行了研究,结果如下:1、棉花非靶向代谢组学方法的建立为了稳定、高通量地对棉花代谢产物进行分析,本研究基于UPLC-QTOF-MS平台建立了棉花半极性代谢物液相分离和质谱检测的方法,随后结合计算机模拟、手动搜索以及标准品验证等方式对棉花中所检测到的代谢产物进行鉴定,最终注释和鉴定了125个代谢产物,并利用标准品验证了其中的10种。2、昆虫口腔分泌物诱导下的棉花代谢谱研究为了验证上述所建立的方法的有效性,本研究对棉铃虫和斜纹夜蛾口腔分泌物以及机械损伤处理下的棉花叶片的代谢谱进行分析,结果显示,昆虫口腔分泌物处理能够显着地引起棉花代谢谱的变化,而不同的昆虫口腔分泌物所引起的代谢物的差异积累趋势并不相同。棉花受到机械损伤后能够引起棉酚含量的显着积累,而这种积累模式却能够被昆虫口腔分泌物处理显着地抑制,本研究对棉酚合成路径上基因的表达量分析也证明了这种抑制作用的存在。3、棉花种间代谢谱差异及代谢物驯化研究为了探究棉花在驯化和改良过程中代谢谱的变异情况,本研究对25个具有代表性的陆地棉栽培种、6个陆地棉地理种系以及部分野生材料的代谢谱进行了比较,聚类分析和主成分分析都表明栽培种与野生种之间在代谢水平上存在显着的差异。驯化分析表明,在检测到的1775个代谢特征物中,595个代谢物在栽培种与地理种系间存在潜在的选择信号,其中包括了类黄酮路径和谷胱甘肽代谢路径上的代谢产物。4、基于代谢产物的全基因组关联分析为了研究陆地棉代谢产物的遗传基础,本研究将一个包含267份陆地棉栽培种的自然群体种植于不同环境进行取样和代谢组学分析,并在3个不同环境中分别检测到了996（2016年武汉）,828（2016年鄂州）和776个（2017年鄂州）几乎无冗余的代谢信号。随后利用大约270万个高质量的SNP基于代谢性状在混合线性模型下进行全基因组关联分析。最终在不同环境下分别检测到了1877（2016年武汉）,1419（2016年鄂州）和898（2017年鄂州）个m QTL。进一步结合候选基因表达量分析以及同源基因比对,最终得到了14个可能影响代谢物积累的候选基因。5、腺体形成基因编码区的转座子插入影响多种代谢产物的积累为了研究m QTL在染色体分布的均一性,本研究对其分布区域进行了热点区域分析。其中一个位于A12染色体上的区域与包含棉酚在内的多种代谢产物的含量呈现显着的关联。对该热点的进一步分析发现,候选区域内存在一个腺体形成相关基因Ghir＿A12G025340,沉默该基因的表达后棉花植株中超过20%的代谢产物发生差异积累,其中棉酚的含量下调80%以上。超表达该基因能够显着提升棉酚含量,而次生代谢产物的高量积累也同时影响愈伤组织的进一步分化。对极端材料中该基因的序列进行比较发现,低棉酚品种中该基因编码区含的一个～5kb的转座子插入可能是影响腺体发育进而影响代谢物积累的关键。6、多组学结合促进候选基因鉴定为了更加高效地鉴定代谢性状相关的候选基因,本研究利用40份棉花材料的表达谱数据进行e QTL分析以及代谢物与基因表达量的相关性分析,结合关联分析结果构建了“SNP-基因表达量-代谢物含量”的网络,并挑选了其中的两个基因进行了功能验证。其中Ghir＿D13G004710被鉴定为一个编码酰基转移酶的基因,其基因表达量与目标代谢物含量呈显着正相关,且e QTL区间与目标代谢物m QTL区间重叠,沉默该基因的表达可以显着抑制部分丙二酰基化类黄酮的含量。类似地,本研究中利用同样的方法鉴定和验证了Ghir＿A12G019280在调控棉花中山奈酚及其衍生物含量上的功能。7、糖基转移酶影响ABA-GE的合成并参与调控棉花抗旱通过全基因组关联分析,我们在D02染色体上鉴定到一个与ABA-GE含量显着相关的m QTL,进一步分析发现,该区间内存在一个糖基转移酶基基因Ghir＿D02G002230。表达模式分析显示,该基因受干旱诱导下调表达且在耐旱材料中的表达量显着低于敏旱材料。体外表达分析实验证明重组Ghir＿D02G002230蛋白具有糖基化ABA的活性。在棉花体内沉默该基因的表达后,ABA-GE的含量显着下调。抗旱性实验证明沉默该基因的表达能够有效增强棉花对干旱的抗性。8、抗虫相关代谢产物的筛选为了获得与棉花抗虫性相关的代谢产物及其候选基因,本研究结合田间抗虫表型数据和代谢物含量,通过共表达网络分析以及性状与模块的相关性分析鉴定到了一个与植物抗虫性呈显着正相关的代谢物模块,并从该模块中筛选到了一个关键的代谢产物,并将其候选基因定位于A06染色体。
李保奇[5]（2020）在《基于田间表型和表型组平台图像指标解析棉花响应干旱的遗传基础》文中进行了进一步梳理抗旱性是复杂的数量性状,受到遗传和环境的共同调控。棉花是一种相对耐旱的经济作物,但随着全球气候变暖及我国种植结构的变化,棉花种植区逐渐向西北部干旱地区转移,水资源短缺已成为制约棉花产量和品质的重要因素。开展棉花抗旱机制研究、克隆抗旱基因并应用于棉花育种是解决棉田缺水的有效途径。目前,棉花抗旱基因的发掘进展缓慢,虽有一些调控基因及功能基因的研究报道,但相对于玉米、水稻、小麦等粮食作物的抗旱研究仍有些滞后。由于棉花的生育期长,棉花抗旱性的评价指标一直是研究者们思考和尝试解决的难题。本研究利用陆地棉栽培种组成的自然群体,一方面在新疆大田进行控水处理,获取田间农艺性状、产量和品质等18个性状,另一方面在温室进行干旱处理,通过表型平台采集获取大量数字化表型指标,结合基因组重测序和转录组测序,运用关联分析鉴定棉花抗旱性相关重要位点和重要候选基因。主要研究结果如下:1.大田棉花抗旱性状综合研究及抗旱性状的关联分析本研究利用517份棉花种质组成的自然群体为研究对象,在新疆南北地区进行两年两点的大田控水试验,采用全生育期灌水量为对照组灌水量50%作为水分限制处理,考察了包含农艺性状、纤维品质、产量指标在内的共18个性状,分析了不同性状的广义遗传力和变异系数。根据不同性状与控水处理的关系,描绘了各性状之间的相关性网络。结果表明,群体内不同品种对干旱胁迫的响应差异明显,除铃重和纤维整齐度受水分影响不显着外,其他16个性状在对照和限水处理间表现极显着差异;一方面,50%限水处理使纤维品质降低,表现在纤维长度降低和马克隆值增加;另一个方面,50%限水处理使棉田实收籽棉产量提高8.46%,同时促进相关优良农艺性状的建成,使生育期普遍缩短、株高普遍降低,有利于集中吐絮和合理密植。研究进一步对314个棉花种质进行重测序,结合前期203份种质的重测序结果,我们共获得2564238个SNP用于全基因组关联分析（GWAS）。利用不同表型性状的抗旱系数（DRC）和综合抗旱指数（CIDT）进行关联分析,分别检测到33个和6个与水分胁迫相关的QTL,其中包含两个新的QTL热点区域。结合转录组测序和q RT-PCR,在这两个热点区域内鉴定到6个差异表达基因（DEGs）。本研究不仅为新疆棉田的节水灌溉提供了新思路,也为棉花的抗旱性改良提供了理论基础和候选基因。2.基于表型组学图像指标的关联分析解析棉花苗期响应干旱的遗传基础棉花中开展抗旱鉴定的主要方法是建立旱池、苗期水培实验或盆栽处理,相关指标的采集主要限于株高等人工可采集指标。为了获取抗旱性评价指标,我们利用表型组平台在温室对苗期干旱处理下的200份棉花种质资源进行了动态的RGB图像采集。通过人工测量和无损图像提取进行建模,分析人工采集数据与图像特征数据之间的相关性,共获取了119个基于棉花图像的数字化特征（i-traits）,包括56个形态特征,63个纹理特征。研究验证了株高、株宽、生物量等用于干旱评价的传统指标,并进一步鉴定到了能准确反映棉花苗期响应干旱的多个非人工获得性i-traits:形态特征植株密度（PD）、相对频数（RF）和纹理特征G分量熵值（ET＿G）等。通过综合各棉花形态特征的表现,我们将200个棉花种质的抗旱性分为高抗、中抗、敏感3个等级。本研究表明,表型组学技术突破了人工检测指标少、误差大及通量小的瓶颈,为棉花抗旱性研究提供了优良的技术平台。研究进一步结合基因组重测序数据,通过不同i-traits抗旱系数的GWAS,鉴定到390个与干旱相关的QTL,包括前人在棉花中报道过的抗旱相关基因Gh RD2、Gh NAC4、Gh HAT22和Gh DREB2。结合抗旱种质ZY168和敏旱种质ZY7的转录组数据,我们在一个QTL热点区间内鉴定到此前未报道的两个串联重复基因Gh DNRs（Gh＿A04G0377、Gh＿A04G0378）。病毒介导的基因沉默（VIGS）实验表明,沉默两个基因的表达使棉花植株在干旱处理下表现更抗旱,沉默植株生物量（SA）和株高显着高于对照植株、子叶脱落晚于对照植株、叶片内的可溶性糖含量高于对照植株,证明Gh DNRs是棉花抗旱的负调控因子。本研究结合表型组、基因组和转录组等多组学,不仅为棉花抗旱鉴定提出了新的方法,也为深入解析棉花抗旱机制及棉花抗旱性状的遗传改良提供了强有力的理论和技术支撑。
张驰[6]（2020）在《陆地棉纤维品质和产量性状的全基因组关联分析及候选基因的功能验证》文中指出棉花是重要的经济作物,也是研究多倍体起源、进化和驯化的理想物种。陆地棉作为棉花主要的栽培种之一,其纤维品质和产量的遗传作用机理一直是研究的热点。棉花纤维是由单个表皮细胞发育成的毛状体,几乎由纯纤维素组成,同时也是研究细胞伸长和细胞壁修饰的理想单细胞模型。本研究利用355份陆地棉品种（系）所组成的自然群体以及纤维长度相关的F2和F2:3作图群体,通过收集其纤维品质和产量的表型数据,利用基因型数据（包括全基因组重测序和SLAF简化测序技术获得的SNPs）,定位了纤维产量和品质相关的优异变异位点,鉴定出相关候选基因并对基因功能进行了初步验证,包括基因在拟南芥中的过表达、病毒诱导基因沉默（VIGS）在棉花中的瞬时表达和棉花中的基因编辑等。本研究探索了纤维品质和产量的遗传基础与分子机理,为棉花纤维品质和产量的改良提供依据。主要结果如下:1.对355份陆地棉材料进行多年多点的种植,收集11个环境下的五项纤维品质相关性状和两个产量相关性状,包括:纤维长度（Fiber Length:FL）,纤维强度（Fiber Strength:FS）,纤维整齐度（Fiber Uniformity:FU）,马克隆值（Fiber Micronaire:FM）,纤维伸长率（Fiber Elongation:FE）,衣分（Lint Percentage:LP）和单铃重（Boll Weight:BW）。对表型数据的统计分析发现7个纤维品质和产量的性状均存在显着的表型变异,且数据均呈现正态或近正态分布;Pearson相关性分析结果显示,FM与其它6个性状呈显着负相关,而其余6个性状间均为正相关关系;遗传力分析表明,7个纤维品质和产量性状的遗传力都普遍较高,介于59.4%～91.6%之间,表明基因型对这几个性状有很大影响,适合进行后续的关联分析。2.用355份陆地棉的简化测序数据与8个环境下纤维长度的表型数据进行全基因组关联分析（GWAS）,共筛选到14个与纤维长度显着关联的SNP位点,分别分布在6条染色体（A03、D02、D03、D04、D09和D11）上。其中,位于D03染色体上的两个显着SNP位点（D0341720764和D0341721072）与纤维长度关联最显着,表型变异解释率介于13.13%～14.37%之间。单倍型分析发现这两个SNPs都存在AA和TT两种单倍型,在8个环境的表型数据中发现携带AA单倍型的材料的纤维长度均显着短于携带TT单倍型的材料。在纤维长度相关的家系群体中进行连锁作图分析,发现在F2和F2:3群体中均检测到2个显着的QTL（qFL-D03-1/2和qFL-D08-1/2）。根据SNP的物理位置,我们发现GWAS和连锁作图在D03染色体上都检测到一个可以解释相对较高表型变异的重叠区域,表型变异解释率分别为13.75%和19.28%,这表明该区域很可能存在控制纤维长度性状的主效位点,并结合基因组注释信息筛选到候选基因GhD03G1338（F2KP）进行后续的功能验证。3.从开花前3天到开花后20天的材料中进行qRT-PCR实验发现,GhF2KP在陆地棉标准系TM-1和长短纤维材料中有明显的表达量差异;同时在拟南芥中过表达该基因,发现GhF2KP可促使拟南芥的叶片表皮毛密度显着增加,主根显着增长。利用VIGS技术沉默该基因,发现在不同材料中抑制GhF2KP的表达后,其纤维长度存在不同程度的变短,且在长纤维材料中这一现象更为明显。综合以上结果推测GhF2KP可能参与棉花纤维细胞伸长的正向调控。4.利用355份陆地棉的全基因组重测序数据与11个环境下的纤维品质和产量性状进行全基因组关联分析,得到与相关性状显着关联的标记位点,发现阈值（-logP>5）以上的标记数目为1,825个,阈值（-logP>6）以上的标记数目为361个。其中10个SNP位点同时在多个纤维性状里被显着关联到,说明了控制纤维品质的基因具有多效性。位于A10染色体上的SNP标记GhirA10114618736在多个环境中同时与纤维长度和强度两个性状显着关联。绘制LD block并结合基因组注释、基因表达量等数据,在距该标记78.7 kb范围内定位到与之紧密连锁的基因GhTBL38,将其作为候选基因进行后续功能验证。5.GhTBL38在棉纤维伸长阶段（5 DPA）优势表达,且长纤维材料中GhTBL38的表达量显着高于在短纤维材料中的表达量。在拟南芥中过表达该基因,发现相比于野生型,过表达株系叶片绒毛明显变密。在棉花中进行基因编辑后,在T1代植株中观察株系发生不同程度的变异,其中一个株系出现晚花表型且在胚珠的5 DPA时期纤维突起呈塌陷状,但更加密集,这些证据表明GhTBL38参与了陆地棉纤维长度的调控。本研究利用GWAS、简化基因组测序等第二代高通量测序手段,在自然群体和遗传群体中分别鉴定到155和434个与纤维长度、强度相关的位点,结合基因表达量和功能注释,筛选到2个纤维长度相关的候选基因（GhF2PK和GhTBL38）,进一步通过拟南芥转化、棉花VIGS、基因敲除等手段验证基因GhF2PK和GhTBL38对纤维长度有正向调控作用。本研究为解析棉花纤维发育的遗传机理提供了研究基础,为明确GhF2PK和GhTBL38基因的分子调控机制提供了试验依据,为棉花的高产优质育种提供了理论支持。
刘慧[7]（2020）在《“成花素-抗成花素”调控棉花开花转变和株型发育的功能研究》文中研究指明植物成花素蛋白FLOWERING LOCUS T（FT）促进开花,调控植株顶端分生组织的有限生长;抗成花素蛋白CENTRORADIALIS/TERMINAL FLOWER1/SELF-PRUNING（CETS）抑制植物开花,调控植株无限生长。二者在植物的顶端分生组织中,竞争与b ZIP转录因子FD蛋白的相互作用,分别形成“成花素激活复合物（florigen activation complex,FAC）”和“抗成花素复合物”,协同调控植物的营养生长和生殖生长,最终决定植物的开花时间和株型结构。在一些作物中,“成花素-抗成花素”系统相关基因的突变或表达量变化,导致作物花期、生育期和株型的改变,为作物的理想株型育种提供了重要的遗传资源,同时也为作物栽培模式的改良和机械化生产做出了重要贡献。棉花作为重要经济作物,株型和生育期是影响棉花种植密度、栽培模式和机械采摘的重要因素。对棉花“成花素-抗成花素”系统进行定向改良,能够塑造棉花的理想株型,调节棉花生育期进程,进而达到提高棉花产量和机械生产效率的目的。本研究旨在通过对棉花成花素GhFT、成花素受体Gh14-3-3、b ZIP转录因子GhFD蛋白以及抗成花素GhCETS蛋白功能的逐个研究,揭示棉花“成花素-抗成花素”系统调控棉花开花转变和株型发育潜在的分子机理,为棉花株型定向改良提供理论依据和基因元件。此外,本研究进一步探索了“成花素-抗成花素”系统相关基因对植物根系发育和氮肥利用效率的影响,旨在为基因新功能的挖掘和利用提供参考依据。本研究主要内容与研究结果如下:1.棉花FAC功能研究棉花基因组中仅存在1个GhFT基因,能够促进开花。通过酵母文库筛选鉴定了一个与GhFT互作的成花素受体Gh14-3-3,二者在植物细胞的细胞质和细胞核中均存在互作。在棉花中共存在5个b ZIP转录因子GhFD,在进化中分为2个亚类,GhFD1/2与模式植物拟南芥FD同源基因具有较高的相似性,GhFD3/4/5为锦葵属植物所特有。GhFT、Gh14-3-3和5个GhFD蛋白均能够在细胞核中互作,形成三复合体。根据GhFD的不同,分别参与调控棉花的开花时间和根系发育。一方面,在地上部分茎尖分生组织中GhFT–Gh14-3-3–GhFD1/2复合体能够激活棉花花身份同源基因APETALA1表达,从而促进棉花开花转变;另一方面在根中GhFT–Gh14-3-3–GhFD3/4/5复合体激活植物侧根发育关键基因AUXIN RESPONSE FACTOR 19的表达,进而促进棉花侧根发育。GhFT–Gh14-3-3–GhFDs复合物调控模块的解析,从分子水平上揭示了棉花开花转变的内在机理以及FAC复合体功能的多样性。2.棉花抗成花素相关基因的功能研究全基因组分析发现在棉花基因组中存在3个抗成花素同源基因,分别命名为Gh SP、Gh TFL1-1和Gh TFL1-2,三者在棉花的根、茎以及花器官相关组织中表达量较高,其他组织中几乎不表达。三者异源过表达均能够促进拟南芥的营养生长,抑制开花转变;基因沉默后都能促进棉花开花。除了促进早花,Gh SP基因沉默终止茎秆的无限生长,导致棉花主茎自封顶。在四倍体棉花中,GoSP等位基因的自然变异,会导致果枝缩短,在海岛棉中Gbsp113Ser突变类型产生零式果枝,在陆地棉中Ghsp73Asn突变产生丛生铃,但是植株顶端仍然保持无限生长状态。Gh SP、Gh TFL1-1和Gh TFL1-2均能与GhFD1、Gh14-3-3在植物细胞体内互作,但是Ghsp73Asn和Gbsp113Ser突变蛋白不与GhFD1互作。3.抗成花素蛋白调控植物根系发育,增加氮肥利用的研究。在拟南芥中,高氮能够诱导抗成花素基因TFL1基因上调表达,同时增加TFL1蛋白的积累和蛋白稳定性。相比于野生型,tfl1突变体对低氮更加敏感,会产生更长的主根和侧根。TFL1过量表达能够同时增加植株地上和地下部分的生物量,增加根系的硝酸盐吸收速率和硝酸还原酶的活性,但是严重推迟植物开花。通过在根中特异性表达TFL1基因,在不影响植株开花时间的同时,能够维持植物在低肥条件下的生物量和籽粒产量。综上所述,棉花中虽然只有1个成花素蛋白,但5个FD蛋白功能的不同,能够实现棉花FAC功能的多样性。棉花中存在3个CETS基因,能够分工调控棉花的开花时间,无限生长以及果枝发育,说明“成花素-抗成花素”系统分子模块能够精密调控棉花多方面的生长发育。此外,在模式植物拟南芥中,抗成花基因AtTFL1还能够增加氮肥利用效率,增加植物生物量,这也为棉花“少投入、多产出”新品种的培育,提供了借鉴和新基因资源。
曹志林[8]（2020）在《水稻高分辨率三维基因组结构与转录调控研究》文中研究表明真核生物的线性基因组在细胞核内折叠包装成特定的三维结构,参与了DNA复制、DNA修复以及基因转录调控等一系列生物学过程,对于细胞分化、个体发育和生物进化具有重要意义。但是,植物的三维基因组结构及其对生命过程的调控研究还处在起步阶段。水稻是单子叶植物研究的模式,养活了全球近一半的人口,揭示水稻的三维基因组结构及其调控基因转录的机理具有重要的科学意义。近年来,利用Hi-C技术,人们在水稻三维基因组研究中取得了多项重要发现,鉴定了A/B区室结构、拓扑结构域等比较大的基因组空间结构。然而,受限于分辨率不高等因素,利用Hi-C技术,人们很难精确地检测到基因启动子-启动子交互等染色质环的精细三维基因组结构。本研究利用Long-read Ch IA-PET技术,构建了组蛋白修饰H3K9me2介导的水稻珍汕97（ZS97）中的异染色质交互图谱,比较了其与RNA聚合酶II（RNAPII）以及H3K4me3介导的活跃基因的染色质交互之间的关系,并结合水稻的表观基因组数据、转录组数据、遗传变异数据等,来揭示水稻三维基因组结构的特征以及遗传变异对水稻三维基因组结构和基因表达调控的影响。具体研究结果如下:（1）构建了水稻单基因分辨率的三维基因组图谱,可以观察到染色质环等精细基因组空间结构。H3K9me2修饰区域（主要是异染色质区）参与了12,517个染色质相互作用,H3K4me3修饰区域（主要是活跃基因的启动子区）参与了12,887个染色质相互作用,RNAPII介导了26,570个染色质相互作用,其中异染色质交互主要位于着丝粒周边区域,而后两种活跃基因的交互主要位于染色体臂上。（2）通过整合表观基因组和转录组数据,系统分析了三种交互的基本特征。与不参与交互的H3K9me2修饰基因相比,参与交互的H3K9me2修饰基因的表达水平无显着差别,两者表达均很低,同时具有更高TE密度和更宽的H3K9me2结合位点更倾向于参与异染色质交互。而对于活跃基因参与的交互,与没有参与交互的BP基因相比,参与交互的锚定基因几乎都是看家基因,拥有更高比例的水稻种质核心基因和更高的的表达水平,且参与交互的锚定基因对倾向于共表达。（3）提出了水稻染色质空间结构的区室模型,将水稻基因组划分为具有不同转录潜力的5种染色质交互结构域模块（CID）,即:AID（活跃模块）、HID和间隔区（非活跃/弱转录模块）、MID（活跃模块,AID和HID之间的转换模块）以及TID（中等转录模块）。这些CID是比拓扑结构域（TAD）更精细的结构,类似于亚拓扑结构域（sub-TAD）,转录活性的不同取决于参与活跃染色质环形成的锚定基因的比例。这些模块间隔分布在水稻染色体上,覆盖了84%的水稻ZS97的基因组,并组织成相对独立的具有不同生物学功能的转录空间区域。（4）基于水稻ZS97和MH63两个品种间的遗传变异数据,揭示了遗传变异对水稻染色质拓扑结构及基因转录调控的影响。（5）建立了水稻三维基因组显微成像体系。利用三维免疫荧光（3D-IF）以及改进的荧光原位杂交（HCR-FISH）实验,验证了水稻细胞核中发生的高频染色质交互以及交互结构域的存在。
党聪[9]（2020）在《Bt水稻对天敌的长期生态效应及基于RNAi转基因水稻安全性的评价探索》文中进行了进一步梳理在转基因作物开始商业化种植之前,严格的环境安全性和食用安全性评价十分必要。转基因作物对非靶标生物的安全性评价是其环境安全性评价中的一项重要内容,本论文围绕不同类型的转基因水稻对非靶标生物影响的安全性评价开展研究。选取Bt（Bacillus thuringiensis）水稻和基于RNA干扰的转miRNA或ds RNA水稻为对象,结合生态学、分子生物学、生物信息学等手段综合评价其对非靶标生物（尤其是天敌）的安全性,一方面为推动Bt水稻产业化进程提供安全性数据支撑,另一方面也为基于RNAi的新型转基因水稻安全性评价体系的构建提供理论依据和技术储备。主要研究结果如下:1.Cry1Ab水稻对稻田天敌群落的长期生态效应的评价通过分析转cry1Ab基因抗虫水稻（Cry1Ab水稻）持续十年的稻田节肢动物群落调查数据,发现Cry1Ab水稻田中天敌群落与非转基因对照相比没有显着差异。进一步对稻田重要捕食性天敌蜘蛛亚群落进行分析,证实Cry1Ab水稻对该亚群落没有显着影响,而化学农药处理则对其有显着的负面影响;同时也发现稻田蜘蛛对稻飞虱的自然控制能力并未受到Cry1Ab水稻的影响。综合评价认为,Cry1Ab水稻对稻田天敌群落无显着影响,可作为稻田害虫综合治理的一项重要技术。2.转二化螟miR-14水稻对其非靶标天敌二化螟盘绒茧蜂影响的评价借鉴Bt作物对非靶标生物安全性评价中第一层级（Tier-1）的方法,评价了高浓度二化螟miRNA直接暴露对其非靶标天敌二化螟盘绒茧蜂的影响。结果表明二化螟盘绒茧蜂可以通过直接取食和二化螟血淋巴获取外源miRNA;二化螟miR-14注射被寄生的二化螟幼虫后可能会影响二化螟盘绒茧蜂的发育历期,但高浓度的二化螟miR-14直接饲喂并未对二化螟盘绒茧蜂的生物学参数产生显着影响。结合田间实际情况,综合推断认为转二化螟miR-14水稻对其重要非靶标寄生蜂天敌二化螟盘绒茧蜂不会有明显的负面影响。3.褐飞虱靶标ds RNA对三种非靶标生物影响的评价首先构建褐飞虱人工饲料喂食ds RNA的方法,对体外转录合成的36条不同褐飞虱ds RNA片段进行饲喂试验,共有25个ds RNA片段对褐飞虱存活率有显着影响。选取具有较高致死效率的ds Nl Na、ds Nlsft、ds Nlvatp和ds Nlaup四个ds RNA片段评价其对三种非靶标生物（赤拟谷盗、黑肩绿盲蝽和麦蛾柔茧蜂）的影响。结合序列相似性、生物学参数、基因转录水平等结果,ds Nl Na与三种非靶标生物的同源基因序列的相似性相对较低,然而其对赤拟谷盗和麦蛾柔茧蜂均可能产生非靶标效应。ds Nlvatp与三种非靶标生物均存在连续19-23nt的完全匹配情况,但是其只有在高浓度饲喂时会对赤拟谷盗可能存在非靶标效应。此外,ds Nlaup连续饲喂赤拟谷盗显着影响其存活率;而ds Nlsft无论是高浓度饲喂还是以LC50的浓度连续饲喂,对三种非靶标生物的生物学参数及相关基因转录水平均没有显着影响。总的来说,褐飞虱靶标ds RNA对非靶标生物的影响并不完全取决于ds RNA的连续21nt序列与非靶标生物同源基因的匹配情况,与非靶标生物的分类地位及ds RNA的基因类别也有关系,因此在开展ds RNA对非靶标生物影响的评价时需要结合具体基因及非靶标生物进行具体评价。综合上述结果,ds Nlsft对褐飞虱具有相对较好的防控效果,且对已评价的三种非靶标生物相对安全,其可能具有一定的应用价值。
焦裕冰[10]（2020）在《PMMoV侵染对辣椒小RNA表达的影响以及诱导细胞自噬机制的研究》文中进行了进一步梳理辣椒是我国重要的园艺作物,种植面积达150万160万公顷,约占全国蔬菜种植总面积的10%。辣椒病毒病是危害辣椒生产的重要病害,目前世界上已发现近40种病毒可以侵染辣椒。辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus,PMMoV）属于烟草花叶病毒属（Tobamovirus）成员,可侵染不同品种的辣椒,主要引起叶片皱缩、花叶和果实扁平、变小、畸形等症状,对辣椒的生产造成了严重损失。本文对PMMoV与寄主之间的互作关系进行了深入研究,探索了vsiRNA、miRNA和相关寄主因子在PMMoV与辣椒互作中的功能,并揭示了PMMoV侵染诱导的细胞自噬是寄主抗病毒的重要机制之一,主要研究结果如下:本文针对侵染辣椒的两种病毒PMMoV和辣椒脉斑驳病毒（chilli venial mottle virus,ChiVMV）建立了一种快速RT-RPA检测技术。该技术仅需一对特异性引物,在38℃条件下反应30 min即可完成扩增;具有良好的特异性,检测过程中与其他相关病毒无交叉反应;检测灵敏度是普通RT-PCR技术的10倍;可用于田间样品快速检测。本文通过高通量测序研究了PMMoV侵染辣椒后vsiRNA的表达特征,探索了小RNA在病毒与寄主互作中的重要功能。PMMoV侵染后辣椒中vsiRNA的长度主要是21-nt和22-nt,5’末端碱基以U为主,vsiRNA来源于PMMoV基因组的正负链,但其在正负链上分布却表现出明显的不均匀分布,来源于PMMoV正链的vsiRNA及热点（hotspot）比来源于负链的多,并且在RdRp编码区和CP编码区位置热点数较其他区域多。对vsiRNA的靶标预测表明42个特异的vsiRNA靶向辣椒中的66个注释基因,并且在特定条件下,正义链中的大多数vsiRNA有多个靶点,而反义的大多数vsiRNA只有一个靶点。对这些靶标进行Gene Ontology（GO）分析,结果表明许多注释的靶标参与了应激反应、细胞调节和新陈代谢相关的生理途径。另外,PMMoV侵染能显着诱导辣椒中CaAGO1a/1b/2,CaDCL2和CaRDR1的表达。进一步分析测序结果表明,PMMoV侵染影响了辣椒中内源小RNA的表达。本研究共鉴定到88个辣椒中已知miRNA,其中包括20个辣椒中特异的miRNA,并预测得到198个新miRNA。利用生物信息学软件预测了miRNA的靶标,并进行功能分析,GO分析显示大部分靶标在辣椒生长发育和防御信号过程中发挥重要作用,这些结果为研究病毒侵染对辣椒miRNA调控网络的影响奠定了基础。为了进一步了解辣椒与PMMoV的互作情况,本研究借助高通量测序技术从转录水平上对未感染PMMoV和感染PMMoV的辣椒植株进行了基因表达分析。共获得24,227个基因,得到了197个差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,其中172个基因较对照组显着上调,25个基因显着下调,这些DEGs参与了病毒侵染后辣椒中信号通路的差异调节以及防御相关因子的表达。对这些DEGs进行GO和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome（KEGG）通路富集进一步分析,分别得到53条显着富集的GO terms和6条显着富集的KEGG途径。另外,通过鉴定明确了PMMoV侵染影响多个辣椒细胞自噬相关基因（autophagy-related genes,ATGs）的表达,暗示细胞自噬可能在PMMoV侵染过程中发挥重要功能。自噬与植物病毒之间的直接相互作用成为最近研究的热点。在本研究中,以模式植物本氏烟为材料,利用透射电子显微镜观察、自噬marker GFP-ATG8a荧光和免疫印迹观察以及实时荧光定量PCR分别检测PMMoV侵染后烟草叶片细胞内自噬结构的形成和细胞自噬相关基因NbVPS15、NbATG3、NbATG5、NbBeclin1、NbATG7、NbATG8a、NbATG9的表达特征,明确了PMMoV侵染能够诱导寄主的细胞自噬反应。利用VIGS技术分别沉默NbATG3、NbATG5、NbBeclin1、NbATG7和NbATG8a等几个自噬关键基因,可增加PMMoV的积累并加快症状的产生,与此同时,使用细胞自噬抑制剂3-MA和E64d处理也会增加病毒的积累。酵母双杂交结果显示,PMMoV编码的P126能够与NbATG8f互作,其中解旋酶区域Hel是互作的关键结构域,暗示P126可能通过与NbATG8f结合而成为自噬降解的靶点。这些结果进一步表明自噬在PMMoV侵染过程中发挥抗病毒作用。
二、Development of Gene Expression and Gene Silencing Vectors Based onCotton Leaf Curl Virus for Functional Genomics in Cotton（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Development of Gene Expression and Gene Silencing Vectors Based onCotton Leaf Curl Virus for Functional Genomics in Cotton（论文提纲范文）
（1）VIGS基因沉默技术在作物基因功能研究中的应用与展望（论文提纲范文）
| 1 VIGS技术原理 |
| 2 VIGS的发展 |
| 2.1 病毒沉默载体的发展 |
| 2.2 VIGS技术的拓展 |
| 2.2.1 小RNA介导的VIGS |
| 2.2.2 寄主诱导的基因沉默 |
| 2.3 VIGS接种方式的发展 |
| 3 VIGS在作物中的应用 |
| 3.1 VIGS在单子叶作物中的应用 |
| 3.2 VIGS在棉花中的应用 |
| 3.3 VIGS在蔬菜中的应用 |
| 3.4 VIGS在果树中的应用 |
| 3.5 VIGS在药用植物中的应用 |
| 4 影响VIGS效率的因素 |
| 4.1 环境因素 |
| 4.2 病毒载体 |
| 4.3 插入基因片段 |
| 4.4 侵染方式 |
| 5 VIGS的检测 |
| 6 VIGS存在的问题及解决方法 |
| 7 展望 |
（2）桑树中与桑脉带相关病毒N蛋白互作的蛋白筛选、鉴定及其表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 桑脉带相关病毒 |
| 1.2 正番茄斑萎病毒属核外壳蛋白的功能及其互作蛋白 |
| 1.3 植物相关蛋白及其功能 |
| 1.3.1 乳胶蛋白 |
| 1.3.2 结瘤素相关蛋白1 |
| 1.3.3 果胶酯酶 |
| 1.3.4 烯醇化酶 |
| 1.3.5 14-3-3 蛋白 |
| 1.3.6 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶 |
| 1.3.7 核糖体再循环因子 |
| 1.3.8 丝氨酸羟甲基转移酶 |
| 1.3.9 腺苷高半胱氨酸水解酶 |
| 1.3.10 丙二烯氧化物合酶 |
| 1.4 植物激素及其在植物病毒与寄主互作中的作用 |
| 1.5 病毒与寄主蛋白互作研究技术 |
| 1.5.1 免疫共沉淀技术 |
| 1.5.2 双分子荧光互补技术 |
| 1.5.3 酵母双杂交系统 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌种与质粒来源 |
| 2.1.3 酶及试剂 |
| 2.1.4 所用仪器 |
| 2.1.5 实验相关引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 植物材料的种植与管理 |
| 2.2.2 总RNA的提取 |
| 2.2.3 RNA的反转录 |
| 2.2.4 PCR反应体系与条件 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.6 产物纯化与回收 |
| 2.2.7 目的片段与载体连接 |
| 2.2.8 化学转化 |
| 2.2.9 大肠杆菌质粒小量提取 |
| 2.2.10 限制性内切酶切割DNA片段 |
| 2.2.11 Western blot |
| 2.2.12 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.2.12.1 提取桑的非变性蛋白 |
| 2.2.12.2 Co-IP |
| 2.2.13 蛋白质的质谱鉴定 |
| 2.2.14 电转化农杆菌感受态制备及转化 |
| 2.2.14.1 制备感受态 |
| 2.2.14.2 转化 |
| 2.2.14.3 农杆菌侵染烟草 |
| 2.2.15 转化酵母NMY51 |
| 2.2.16 相对荧光定量PCR |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 MVBaV N多克隆抗体的灵敏度和特异性检测 |
| 3.2 Co-IP联合质谱分析 |
| 3.3 候选蛋白基因ORF的扩增及序列分析 |
| 3.3.1 候选蛋白基因ORF的扩增 |
| 3.3.2 生物信息学分析 |
| 3.4 MVBaV N蛋白候选互作蛋白的验证 |
| 3.4.1 双分子荧光互补实验验证 |
| 3.4.1.1 双分子荧光表达载体的构建 |
| 3.4.1.2 共注射烟草显微观察N蛋白与候选蛋白的互作 |
| 3.4.2 酵母双杂验证MVBaV N蛋白与候选蛋白的互作 |
| 3.4.2.1 猎物质粒的构建 |
| 3.4.2.2 酵母双杂交实验验证N蛋白与候选蛋白的互作 |
| 3.5 互作蛋白基因的表达分析 |
| 3.5.1 生物胁迫下14-3-3LPB、PECT、RRF、SAHH的表达分析 |
| 3.5.1.1 MVBaV对14-3-3LPB的表达影响 |
| 3.5.1.2 MVBaV对 PECT的表达影响 |
| 3.5.1.3 MVBaV对 RRF的表达影响 |
| 3.5.1.4 MVBaV对 SAHH的表达影响 |
| 3.5.2 幼苗不同组织14-3-3LPB、PECT、RRF、SAHH的表达分析 |
| 3.5.3 外源激素处理下14-3-3LPB、PECT、RRF、SAHH的表达分析 |
| 3.5.3.1 外源激素对14-3-3LPB的表达影响 |
| 3.5.3.2 外源激素对PECT的表达影响 |
| 3.5.3.3 外源激素对RRF的表达影响 |
| 3.5.3.4 外源激素对SAHH的表达影响 |
| 3.5.4 非生物胁迫下14-3-3LPB、PECT、RRF、SAHH的表达分析 |
| 3.5.4.1 非生物胁迫下14-3-3LPB的表达影响 |
| 3.5.4.2 非生物胁迫下PECT的表达影响 |
| 3.5.4.3 非生物胁迫下RRF的表达影响 |
| 3.5.4.4 非生物胁迫下SAHH的表达影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 MVBaV N蛋白的互作蛋白 |
| 4.1.1 与MVBaV N蛋白互作的病毒蛋白 |
| 4.1.2 与MVBaV N蛋白互作的寄主蛋白 |
| 4.1.2.1 MLP类蛋白 |
| 4.1.2.2 NRP1 蛋白 |
| 4.1.2.3 果胶酯酶 |
| 4.1.2.4 14-3-3LPB蛋白 |
| 4.1.2.5 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶 |
| 4.1.2.6 核糖体再循环因子 |
| 4.1.2.7 腺苷高半胱氨酸水解酶 |
| 4.2 互作基因的表达模式 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 蛋白质的质谱鉴定方法与步骤 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（3）棉花高效CRISPR/Cas9基因编辑体系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 CRISPR/Cas基因组编辑技术概括 |
| 1.1.1 CRISPR/Cas的起源及发展 |
| 1.1.2 CRISPR/Cas系统的分类 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas系统在植物中应用 |
| 1.1.4 CRISPR/Cas9 系统在棉花中的应用及存在问题 |
| 1.1.5 组织特异性CRISPR/Cas9 系统应用的研究 |
| 1.1.6 病毒诱导的基因编辑(VIGE)应用的研究 |
| 1.2 本研究目的、意义及研究内容 |
| 1.2.1 研究目的与意义 |
| 1.2.2 研究内容 |
| 1.2.3 技术路线 |
| 第2章 利用花粉表达基因GhPLIMP2b和 GhMYB24 启动子进行棉花花粉CRISPR/Cas9 基因编辑的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 棉花各个组织RNA及基因组DNA的提取 |
| 2.1.3 棉花GhPLIM2b和 GhMYB24 基因组织特异性表达检测 |
| 2.1.4 GhPLIM2b P::GUS-P1300和GhMYB24P::GUS-P1300 表达载体构建 |
| 2.1.5 农杆菌真空渗透转化棉花花粉及瞬时表达分析 |
| 2.1.6 CRISPR/Cas9 基因编辑载体构建 |
| 2.1.7 棉花CLA1、ERA1和GGB基因突变检测 |
| 2.1.8 脱靶率分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 GhPLIM2b和 GhMYB24 基因在棉花不同组织表达量分析 |
| 2.2.2 花粉活力检测 |
| 2.2.3 GhPLIM2b和 GhMYB24 启动子在棉花花粉中的瞬时表达分析 |
| 2.2.4 CRISPR/Cas9 编辑载体构建 |
| 2.2.5 CRISPR/Cas9 介导的棉花CLA1、ERA1和GGB突变检测 |
| 2.2.6 脱靶分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 利用可移动FT-sgRNA和 DNA病毒进行可遗传基因编辑的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 载体构建 |
| 3.1.3 RT-PCR分析Cas9 表达量 |
| 3.1.4 CLCrV投送sgRNA瞬时转化Cas9-OE拟南芥 |
| 3.1.5 GUS染色及定量分析 |
| 3.1.6 突变检测 |
| 3.1.7 统计分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 基于CLCrV的 sgRNA传递系统设计 |
| 3.2.2 CLCrV介导靶向敲除拟南芥内源基因 |
| 3.2.3 组织特异性Cas9 系统提高基因编辑效率 |
| 3.2.4 利用移动FT-sgRNA实现可遗传基因编辑的研究 |
| 3.2.5 突变后代(M1)病毒检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 利用DNA病毒在棉花中实现可遗传基因编辑的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 载体构建 |
| 4.1.3 CLCrV投送sgRNA瞬时转化Cas9-OE棉花 |
| 4.1.4 突变检测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 CLCrV介导靶向敲除棉花GhCLA1和GhPDS基因 |
| 4.2.2 CLCrV介导靶向编辑棉花多个基因 |
| 4.2.3 利用FT-sgRNA在棉花中进行基因编辑的研究 |
| 4.2.4 GhPDS和 GhCLA1 基因突变后代胚珠检测 |
| 4.2.5 M1 代棉花胚珠病毒检测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.1.1 利用花粉表达基因GhPLIMP2b和 GhMYB24 启动子进行棉花花粉CRISPR/Cas9 基因编辑的研究 |
| 5.1.2 利用可移动FT-sgRNA和 DNA病毒进行可遗传基因编辑的研究 |
| 5.1.3 利用DNA病毒在棉花中实现可遗传基因编辑的研究 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）全基因组关联分析解析棉花代谢产物的遗传和生化基础（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 代谢组学概述 |
| 1.1.1 代谢组学的含义 |
| 1.1.2 代谢组学研究的技术手段 |
| 1.1.3 非靶向代谢组学的数据预处理 |
| 1.1.4 代谢物鉴定策略 |
| 1.2 植物代谢组学研究 |
| 1.2.1 代谢谱分析 |
| 1.2.2 代谢物的驯化分析 |
| 1.2.3 基于代谢性状的全基因组关联分析 |
| 1.2.4 基于代谢组学解析植物复杂性状 |
| 1.2.5 多组学整合促进功能基因组学发展 |
| 1.3 棉花代谢组学的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 棉花材料来源和取样 |
| 2.1.1 棉花材料的来源 |
| 2.1.2 关联群体材料的种植和取样 |
| 2.2 样品准备与提取 |
| 2.2.1 化学试剂及仪器 |
| 2.2.2 昆虫口腔分泌物收集和处理 |
| 2.2.3 棉花DNA提取 |
| 2.2.4 棉花RNA提取与目的基因表达量检测 |
| 2.2.5 棉花半极性代谢物提取 |
| 2.3 UPLC-QTOF-MS条件和参数 |
| 2.4 数据处理和分析 |
| 2.4.1 代谢数据预处理 |
| 2.4.2 代谢物驯化分析 |
| 2.4.3 关联群体基因型检测 |
| 2.4.4 群体特征分析 |
| 2.4.5 全基因组关联分析 |
| 2.4.6 转录组分析 |
| 2.4.7 e QTL分析 |
| 2.4.8 进化树分析 |
| 2.4.9 基因表达分析 |
| 2.4.10 统计分析 |
| 2.5 载体构建与转化 |
| 2.5.1 病毒诱导的基因沉默载体构建及转化 |
| 2.5.2 超表达载体构建及转化 |
| 2.5.3 体外表达载体构建及原核表达 |
| 2.5.4 Western Blot |
| 2.5.5 体外活性检测 |
| 2.6 棉花干旱处理 |
| 2.7 ABA-GE检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 棉花代谢组学研究方法的建立 |
| 3.1.1 棉花代谢组学检测方法 |
| 3.1.2 代谢产物的鉴定和注释 |
| 3.2 棉花代谢谱研究 |
| 3.2.1 模拟昆虫取食下陆地棉代谢谱研究 |
| 3.2.2 不同棉种的代谢谱差异研究 |
| 3.2.3 陆地棉代谢产物的驯化研究 |
| 3.3 棉花代谢产物遗传基础解析 |
| 3.3.1 陆地棉栽培种中代谢产物的自然变异 |
| 3.3.2 自然群体的基因组遗传变异分析 |
| 3.3.3 棉花自然群体的m GWAS分析 |
| 3.4 候选基因的功能验证 |
| 3.4.1 一个代谢热点区域的功能解析 |
| 3.4.2 多组学分析验证候选基因 |
| 3.4.3 糖基转移酶对ABA-GE合成的调控 |
| 3.5 抗虫相关代谢产物的发掘 |
| 4 讨论 |
| 4.1 多种平台的结合促进代谢物检测和鉴定 |
| 4.2 非靶向代谢组学的挑战和机遇 |
| 4.3 多组学分析促进候选基因鉴定 |
| 4.4 代谢组学促进棉花功能基因组学研究 |
| 5 棉花代谢组学研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 关联群体中棉花材料的信息及数据源 |
| 附录2 用于代谢驯化分析的棉花材料详情 |
| 附录3 RNA-Seq数据来源 |
| 附录4 试剂配制 |
| 附录5 本研究所用部分引物 |
| 附录6 作者简介 |
| 已发表和待发表的论文 |
| 已申请专利 |
| 致谢 |
（5）基于田间表型和表型组平台图像指标解析棉花响应干旱的遗传基础（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 植物抗旱性鉴定的主要指标 |
| 1.2.1.1 抗旱性鉴定的形态指标 |
| 1.2.1.2 抗旱性鉴定的生理生化指标 |
| 1.2.1.3 综合指标 |
| 1.2.2 关联分析及其在植物抗旱中的应用 |
| 1.2.2.1 关联分析概念及其优势 |
| 1.2.2.2 关联分析理论基础:连锁不平衡 |
| 1.2.2.3 关联分析在粮食作物抗旱中的研究进展 |
| 1.2.2.4 关联分析在棉花抗旱中的研究进展 |
| 1.2.3 植物表型组学的发展和应用 |
| 1.2.3.1 表型组学的概念及优势 |
| 1.2.3.2 植物表型组学的研究策略 |
| 1.2.3.3 国外表型平台及国际组织的发展 |
| 1.2.3.4 我国植物表型平台的发展及应用 |
| 1.2.3.5 植物表型组学解析遗传基础的研究进展与趋势 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 田间棉花的多指标综合性抗旱研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验设计与干旱处理 |
| 2.1.2 性状考察 |
| 2.1.3 遗传力分析和方差分析 |
| 2.1.4 抗旱系数与综合抗旱指数 |
| 2.1.5 材料重测序及数据分析 |
| 2.1.6 全基因组关联分析及干旱相关(DR)候选基因鉴定 |
| 2.1.7 qRT-PCR验证候选基因 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 表型变异结果分析 |
| 2.2.2 正常给水条件下性状之间的相关性分析 |
| 2.2.3 不同灌水条件下棉花产量、纤维品质及相关性状表现 |
| 2.2.4 基因型数据分析和变异鉴定 |
| 2.2.5 群体结构和主成分分析 |
| 2.2.6 全基因组关联分析和DR位点鉴定 |
| 2.2.7 转录组分析和q RT-PCR检测DR候选基因 |
| 2.3 讨论与结论 |
| 2.3.1 限制给水影响棉花的发育和形态发生 |
| 2.3.2 限制给水影响棉花籽棉产量 |
| 2.3.3 全基因组关联分析有助于棉花DR基因的发掘 |
| 2.3.4 结论 |
| 第三章 表型组学与基因组学联合解析棉花苗期响应干旱的遗传基础 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验设计和干旱处理 |
| 3.1.3 图像数据收集及数字化特征(i-traits)提取 |
| 3.1.3.1 颜色分量提取 |
| 3.1.3.2 i-traits的定义 |
| 3.1.4 i-traits表型数据分析 |
| 3.1.5 材料重测序及全基因组关联分析 |
| 3.1.6 转录组测序 |
| 3.1.7 差异表达基因分析 |
| 3.1.8 病毒介导的基因沉默(VIGS)实验 |
| 3.1.9 VIGS材料的干旱处理及表型考察 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 高通量自动表型平台测定棉花表型数据 |
| 3.2.2 干旱条件下的i-traits变异 |
| 3.2.3 新型的i-traits抗旱指标 |
| 3.2.4 基因型数据分析 |
| 3.2.5 群体结构和主成分分析 |
| 3.2.6 全基因组关联分析和DR位点鉴定 |
| 3.2.7 干旱负调控基因Gh DNRs的鉴定 |
| 3.3 讨论与结论 |
| 3.3.1 表型组学可以为棉花抗旱研究提供新型表型指标 |
| 3.3.2 表型组学结合GWAS有利于鉴定DR基因 |
| 3.3.3 植物表型组学研究展望 |
| 3.3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 I |
| 附录 II |
| 一、攻读学位期间已发表论文 |
| 二、参加国际会议 |
| 致谢 |
（6）陆地棉纤维品质和产量性状的全基因组关联分析及候选基因的功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 棉花的起源和驯化 |
| 1.1.1 棉属的起源与分类 |
| 1.1.2 陆地棉的驯化与分布 |
| 1.2 棉花纤维品质和产量的研究概述 |
| 1.2.1 纤维品质和产量性状的遗传特点 |
| 1.2.2 纤维品质的指标和影响因素 |
| 1.2.3 产量的构成及影响因素 |
| 1.3 棉纤维伸长的研究进展 |
| 1.3.1 棉纤维细胞的发育 |
| 1.3.2 棉纤维细胞伸长的机制 |
| 1.3.3 影响棉纤维细胞发育的因素 |
| 1.3.4 与棉纤维细胞发育相关的基因 |
| 1.4 棉花基因组学研究的发展及应用 |
| 1.4.1 棉花基因组学研究的发展 |
| 1.4.2 棉花基因组学的应用 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 基于简化测序定位纤维长度的关键基因 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 作图群体和田间试验 |
| 2.1.2 表型数据和统计分析 |
| 2.1.3 基因提取及SNP基因分型 |
| 2.1.4 全基因组关联及候选基因鉴定 |
| 2.1.5 遗传图谱构建及QTL定位 |
| 2.1.6 基因表达水平分析 |
| 2.1.7 候选基因在自然群体中的单倍型 |
| 2.2 结果分析 |
| 2.2.1 自然群体和分离群体中纤维长度的表型变异 |
| 2.2.2 基于355份种质材料的纤维长度全基因组关联研究 |
| 2.2.3 构建遗传图谱并对家系群体中纤维长度进行QTL分析 |
| 2.2.4 D03染色体上潜在纤维长度候选基因鉴定 |
| 2.2.5 候选基因在自然群体中的单倍型分析 |
| 2.3 总结与讨论 |
| 第三章 候选基因GhF2KP的功能验证 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料种植与取样 |
| 3.1.2 基因组DNA的提取 |
| 3.1.3 总RNA的提取与检测 |
| 3.1.4 反转录合成cDNA |
| 3.1.5 基因的克隆 |
| 3.1.6 过表达载体的构建 |
| 3.1.7 表达载体转化农杆菌 |
| 3.1.8 拟南芥的遗传转化 |
| 3.1.9 棉花的瞬时沉默(VIGS) |
| 3.1.10 荧光定量PCR |
| 3.1.11 电镜样品制备与观察 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 基因GhF2KP的克隆与序列分析 |
| 3.2.2 转基因拟南芥根长变长 |
| 3.2.3 pCLCrVA-GhF2KP浸染不同棉花受体 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 基于重测序的全基因组关联分析定位纤维品质和产量性状 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料与田间种植 |
| 4.1.2 表型收集与数据分析 |
| 4.1.3 全基因组关联分析 |
| 4.1.4 候选基因的筛选 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 纤维品质和产量性状的表型分析 |
| 4.2.2 纤维品质性状的关联分析 |
| 4.2.3 纤维产量性状的关联分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 候选基因的功能验证 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料种植与取样 |
| 5.1.2 基因组DNA的提取 |
| 5.1.3 总RNA的提取与检测 |
| 5.1.4 反转录合成cDNA |
| 5.1.5 基因的克隆 |
| 5.1.6 构建过表达载体并侵染拟南芥 |
| 5.1.7 棉花的瞬时沉默(VIGS) |
| 5.1.8 棉花的基因编辑 |
| 5.1.9 荧光定量PCR |
| 5.1.10 电镜样品制备与观察 |
| 5.2 结果分析 |
| 5.2.1 基因的克隆与序列分析 |
| 5.2.2 过表达转基因拟南芥的表型观察与表达量分析 |
| 5.2.3 在长短纤维材料中的表达模式分析 |
| 5.2.4 基因敲除对棉花纤维发育的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）“成花素-抗成花素”调控棉花开花转变和株型发育的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1 引言 |
| 2 研究背景 |
| 2.1 植物开花途径 |
| 2.1.1 光周期途径 |
| 2.1.2 春化途径和温度途径 |
| 2.1.3 自主途径 |
| 2.1.4 赤霉素途径 |
| 2.1.5 年龄途径 |
| 2.2 成花素调控植物开花转变的分子机理 |
| 2.2.1 成花素假说和成花素的本质 |
| 2.2.2 成花素激活复合物 |
| 2.3 抗成花素的功能与分子机理研究进展 |
| 2.3.1 抗成花素蛋白CETS的发现 |
| 2.3.2 植物CETS同源基因的功能 |
| 2.3.3 植物CETS基因调控植物花序结构的分子机理 |
| 2.4 “成花素-抗成花素”系统在作物株型育种上的贡献 |
| 2.5 “成花素-抗成花素”平衡假说 |
| 2.6 植物FD同源基因的功能研究进展 |
| 2.7 氮对植物植物的根系发育的影响 |
| 2.7.1 植物的侧根发育 |
| 2.7.2 氮对根系形态构型的调控 |
| 2.8 氮吸收与代谢的研究进展 |
| 2.8.1 植物根系氮吸收的研究进展 |
| 2.8.2 氮同化的研究进展 |
| 2.9 FT/CETS基因调控棉花株型的研究现状 |
| 2.9.1 棉花株型与早熟 |
| 2.9.2 棉花FT/CETS基因家族的研究进展 |
| 3 研究意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 植物材料及来源 |
| 1.2 实验所用菌株 |
| 1.3 实验所用载体 |
| 1.4 常用生物试剂、试剂盒和蛋白抗体 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 棉花FT、FD和 CETS基因的全基因组查找 |
| 2.2 植物RNA的提取和反转录合成cDNA反应 |
| 2.3 qRT-PCR实验 |
| 2.4 目的片段的扩增和回收 |
| 2.5 载体的构建 |
| 2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 |
| 2.7 细菌质粒DNA的提取 |
| 2.8 农杆菌GV3101 感受态细胞的制备与转化 |
| 2.9 棉花TRV-VIGS |
| 2.10 拟南芥的种植,遗传转化及阳性苗的筛选 |
| 2.11 酵母感受态制备及其转化 |
| 2.12 烟草SFLC和 BiFC实验 |
| 2.13 拟南芥原生质体的制备 |
| 2.14 拟南芥原生质体转录激活实验 |
| 2.15 拟南芥总蛋白的提取 |
| 2.16 细菌原核蛋白的表达与纯化 |
| 2.17 GST pull-down实验 |
| 2.18 配制SDS-PAGE凝胶的制备 |
| 2.19 Western-Blot |
| 2.20 Cell-Free System检测蛋白稳定性 |
| 2.21 拟南芥GUS染色 |
| 2.22 拟南芥不同浓度硝酸盐处理 |
| 2.23 拟南芥氮吸收速率测定 |
| 2.24 硝酸还原酶(Nitrate Reductase)活性的测定 |
| 第三章 棉花成花素激活复合物的功能分析 |
| 1 结果与分析 |
| 1.1 Gh14-3-3和GhFT蛋白的相互作用关系 |
| 1.2 GhFDs,GhFT,Gh14-3-3 蛋白三者之间的相互作用关系 |
| 1.2.1 棉花FD基因的查找,进化分析和氨基酸比对 |
| 1.2.2 GhFD的亚细胞定位 |
| 1.2.3 GhFDs与 Gh14-3-3、GhFT在细胞核中互作 |
| 1.3 GhFDs基因的组织表达分析 |
| 1.4 GhFDs基因的功能分析 |
| 1.4.1 GhFDs基因调控开花转变 |
| 1.4.2 GhFDs基因调控棉花侧根发育 |
| 1.4.3 GhFDs基因调控棉花调控棉花MADS和 ARF基因的表达 |
| 2 讨论 |
| 2.1 GhFT、Gh14-3-3和GhFD是棉花FAC的重要组分 |
| 2.2 棉花FD的进化 |
| 2.3 GhFD同源基因表达模式和氨基酸的多样性 |
| 2.4 GhFD的功能多样性丰富了棉花FAC的功能 |
| 3 小结 |
| 第四章 棉花抗成花素基因的功能研究 |
| 1 结果与分析 |
| 1.1 棉花CETS基因的查找、进化分析与氨基酸比对 |
| 1.2 GhCETS基因表达分析与功能分析 |
| 1.2.1 GhCETS基因的时空表达分析 |
| 1.2.2 GhCETS互补tfl1-1 突变体拟南芥表型、促进营养生长 |
| 1.2.3 GhCETS过量表达导致拟南芥花序结构异常 |
| 1.2.4 干扰GhCETS基因表达促进棉花早花和降低株高 |
| 1.3 棉花CETS与 Gh14-3-3、GhFD的互作关系 |
| 1.3.1 GhCETS-GFP融合蛋白的亚细胞定位 |
| 1.3.2 GhCETS与 GhFD1、14-3-3-3 蛋白均存在互作 |
| 1.4 GoSP调控棉花零式果枝和丛生铃的功能研究 |
| 1.4.1 GoSP是控制棉花零式果枝和丛生铃的关键基因 |
| 1.4.2 Ghsp~(73Asn)和Gbsp~(113Ser)不能互补tfl1-1 突变体拟南芥的表型 |
| 1.4.3 Ghsp~(73Asn)和Gbsp~(113Ser)不改变蛋白的亚细胞定位 |
| 1.4.4 Ghsp~(73Asn)和Gbsp~(113Ser)突变影响与GhFD蛋白的互作 |
| 2 讨论 |
| 2.1 棉花CETS-like调控棉花生长习性和开花时间 |
| 2.2 GoSP的自然等位基因变异创造了棉花的短果枝株型 |
| 2.3 Ghsp~(73Asn)和Gbsp~(73Asn)造成棉花短果枝可能的分子机制 |
| 3 小结 |
| 第五章 TFL1 基因调控植物根系发育,增加氮肥利用 |
| 1 结果与分析 |
| 1.1 AtTFL1 基因促进拟南芥的根系发育 |
| 1.2 AtTFL1 参与NO_3~-途径,调控侧根发育 |
| 1.2.1 tfl1-1 突变体对NO_3~-敏感性分析 |
| 1.2.2 AtTFL1 转录水平受高氮诱导 |
| 1.2.3 AtTFL1 转录水平受高氮诱导依赖于NRT基因家族 |
| 1.2.4 高氮增加AtTFL1 蛋白含量和蛋白稳定性 |
| 1.3 AtTFL1 增加拟南芥的氮吸收能力和NR酶活 |
| 1.4 AtTFL1 根中特异性表达增加拟南芥的生物量 |
| 1.4.1 根特异性启动子驱动AtTFL1 载体的构建 |
| 1.4.2 根中特异性表达AtTFL1,不推迟植物的开花时间 |
| 1.4.3 根中特异性表达AtTFL1 促进分枝、增加生物量 |
| 2 讨论 |
| 2.1 TFL1 是参与植物NO_3~-响应的关键基因 |
| 2.2 根特异性表达TFL1 基因能够提高植物的氮利用效率 |
| 3 小结 |
| 第六章 研究结论、创新点和展望 |
| 1 研究结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（8）水稻高分辨率三维基因组结构与转录调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTACT |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 表观遗传学 |
| 1.2.1 DNA甲基化的分布及功能 |
| 1.2.2 组蛋白修饰的分布及功能 |
| 1.3 三维基因组学研究 |
| 1.3.1 染色体疆域 |
| 1.3.2 区室 |
| 1.3.3 拓扑结构域 |
| 1.3.4 染色质环 |
| 1.4 三维基因组学研究方法 |
| 1.4.1 染色质显微成像技术 |
| 1.4.2 基于接近连接的方法 |
| 1.4.3 不依赖于接近连接的方法 |
| 1.5 植物三维基因组学 |
| 1.5.1 植物染色体疆域 |
| 1.5.2 植物染色体区室 |
| 1.5.3 植物拓扑结构域 |
| 1.5.4 植物染色质环 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 水稻材料 |
| 2.1.2 抗体 |
| 2.1.3 菌株和载体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 水稻种植 |
| 2.2.2 染色质免疫共沉淀 |
| 2.2.3 配对末端标签分析染色质交互技术(Ch IA-PET) |
| 2.2.4 免疫荧光 |
| 2.2.5 水稻高质量基因组DNA的提取 |
| 2.2.6 水稻Cot1 DNA的制备 |
| 2.2.7 BAC文库DNA的制备 |
| 2.2.8 荧光原位杂交 |
| 2.2.9 HCR-FISH |
| 2.2.10 水稻原生质体的制备和瞬时转化 |
| 2.2.11 双荧光素酶分析系统 |
| 2.2.12 其它数据 |
| 2.2.13 三维基因组数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 水稻ZS97中异染色质交互的基本特征 |
| 3.2 ZS97中活跃基因参与的染色质交互数据的可靠性 |
| 3.3 活跃基因启动子-启动子交互的基本特征 |
| 3.4 参与空间交互的活跃基因共表达 |
| 3.5 启动子-启动子交互环区域的表观基因组特征 |
| 3.6 RNAPII相关的染色质交互的基本特征 |
| 3.7 活跃基因参与的交互协同转录调控 |
| 3.8 多尺度的ZS97三维基因组图谱的构建 |
| 3.9 染色质交互结构域的分布及相互关系 |
| 3.10 染色质交互结构域的特征 |
| 3.11 水稻染色质空间结构的区室模型 |
| 3.12 CID是较TAD更为精细的基因组空间结构 |
| 3.13 增强子类启动子的实验验证 |
| 3.13.1 DLR载体的构建 |
| 3.13.2 增强子类启动子的双荧光素酶系统实验验证 |
| 3.14 三维基因组显微成像体系的建立 |
| 3.14.1 基于免疫荧光实验鉴定染色质交互结构域 |
| 3.14.2 基于FISH实验检测重复序列之间的交互 |
| 3.14.3 基于BAC FISH检测单拷贝基因之间的交互 |
| 3.14.4 基于HCR FISH检测单拷贝基因之间的交互 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录 Ⅰ 附图 |
| 附录 Ⅱ 附表 |
| 附录 Ⅲ 部分实验详细方法步骤 |
| 附录 Ⅳ 研究成果 |
| 致谢 |
（9）Bt水稻对天敌的长期生态效应及基于RNAi转基因水稻安全性的评价探索（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 转基因作物研究现状 |
| 1.1 全球转基因作物的应用概况 |
| 1.2 新型转基因作物的发展概况 |
| 2 转基因作物对非靶标生物安全性评价的研究进展 |
| 2.1 安全性评价的原理及程序 |
| 2.2 Bt作物对非靶标生物安全性评价的新进展 |
| 2.3 新型转基因作物对非靶标生物安全性评价的研究进展 |
| 3 RNA干扰的原理及其在害虫防治中的应用 |
| 3.1 RNA干扰的原理 |
| 3.2 昆虫RNA干扰的导入方法 |
| 3.3 RNA干扰在害虫防治中的应用 |
| 3.4 RNA干扰技术的安全性 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 5 本研究的技术路线 |
| 第二章 Cry1Ab水稻对稻田天敌长期生态效应的评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试水稻 |
| 1.2 田间种植及试验设计 |
| 1.3 取样及鉴定 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Cry1Ab水稻对稻田节肢动物总群落影响的评价 |
| 2.2 Cry1Ab水稻对稻田天敌群落影响的评价 |
| 2.3 Cry1Ab水稻对稻田蜘蛛亚群落及其生态功能影响的评价 |
| 3 讨论 |
| 第三章 转二化螟miR-14水稻对其非靶标天敌二化螟盘绒茧蜂影响的评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫及水稻 |
| 1.2 转二化螟miR-14 水稻中miRNA含量的测定 |
| 1.3 二化螟miR-14直接饲喂二化螟盘绒茧蜂成虫 |
| 1.4 二化螟miR-14注射已被二化螟盘绒茧蜂寄生的二化螟幼虫 |
| 1.5 二化螟miR-14在二化螟盘绒茧蜂中的靶标预测 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 新型转二化螟miR-14 水稻不同组织中miR-14 表达量 |
| 2.2 二化螟miR-14直接喂食对二化螟盘绒茧蜂的影响 |
| 2.3 二化螟miR-14注射被寄生的二化螟幼虫对二化螟盘绒茧蜂的影响 |
| 2.4 二化螟miR-14在二化螟盘绒茧蜂中的靶标预测 |
| 3 讨论 |
| 第四章 褐飞虱靶标dsRNA对三种非靶标生物影响的评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 基因选择和引物设计 |
| 1.3 dsRNA的合成 |
| 1.4 dsRNA的喂食 |
| 1.5 dsRNA的稳定性 |
| 1.6 荧光定量PCR |
| 1.7 序列比对 |
| 1.8 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 褐飞虱dsRNA喂食体系的建立 |
| 2.2 褐飞虱防控靶标基因dsRNA的筛选及致死效率评价 |
| 2.3 不同靶标dsRNA片段对赤拟谷盗影响的评价 |
| 2.4 不同靶标dsRNA片段对黑肩绿盲蝽影响的评价 |
| 2.5 不同靶标dsRNA片段对麦蛾柔茧蜂影响的评价 |
| 3 讨论 |
| 第五章 总结 |
| 1 总讨论 |
| 2 本论文的特色和创新点 |
| 3 本论文的不足之处 |
| 4 今后有待继续开展的工作 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ基于转录组分析的Cry2Aa水稻对非靶标天敌黑肩绿盲蝽影响的评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 黑肩绿盲蝽喂食Cry2Aa蛋白 |
| 1.3 黑肩绿盲蝽体内Bt蛋白含量的测定 |
| 1.4 转录组测序及分析 |
| 1.5 荧光定量PCR |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Cry2Aa蛋白直接饲喂对黑肩绿盲蝽存活率的影响 |
| 2.2 Cry2Aa蛋白对黑肩绿盲蝽影响的转录组分析 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 附录 Ⅱ作者简历 |
（10）PMMoV侵染对辣椒小RNA表达的影响以及诱导细胞自噬机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 辣椒轻斑驳病毒的研究进展 |
| 1.1.1 辣椒轻斑驳病毒的发生及危害 |
| 1.1.2 辣椒轻斑驳病毒的基因组结构与致病型 |
| 1.1.3 辣椒轻斑驳病毒对生态环境及人体健康的影响 |
| 1.2 RNA沉默机制的核心组分 |
| 1.2.1 DCL蛋白 |
| 1.2.2 AGO蛋白 |
| 1.2.3 RDR蛋白 |
| 1.3 植物内源小RNA的生物合成与调控 |
| 1.3.1 microRNA的来源与生物合成 |
| 1.3.2 siRNA的来源与生物合成 |
| 1.3.3 tasiRNA与 phasiRNA的生物合成 |
| 1.3.4 RNA剪接与RNA降解 |
| 1.4 植物中的抗病毒RNA沉默机制 |
| 1.4.1 病毒诱导的siRNA的来源与生物合成 |
| 1.4.2 DCL蛋白在vsiRNA产生中的作用 |
| 1.4.3 AGO和 RDR蛋白在vsiRNA产生中的作用 |
| 1.4.4 病毒对RNA沉默的抑制和植物的反抑制 |
| 1.5 细胞自噬与植物病毒侵染的研究进展 |
| 1.5.1 植物中的细胞自噬 |
| 1.5.2 植物病毒与自噬的关系 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 重组酶聚合酶扩增技术快速检测方法的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试病毒 |
| 2.1.2 主要仪器与试剂 |
| 2.1.3 病毒接种 |
| 2.1.4 植物叶片总RNA提取 |
| 2.1.5 反转录反应 |
| 2.1.6 PCR反应 |
| 2.1.7 RPA反应 |
| 2.1.8 RPA产物试剂盒纯化 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 RT-RPA反应条件优化 |
| 2.2.2 RT-RPA反应特异性检测 |
| 2.2.3 RT-RPA反应灵敏度检测 |
| 2.2.4 RT-RPA反应田间样品检测 |
| 2.3 结论与讨论 |
| 第三章 PMMoV侵染辣椒产生的vsiRNA的特征分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒和载体 |
| 3.1.2 植物材料 |
| 3.1.3 主要仪器和试剂 |
| 3.1.4 病毒接种 |
| 3.1.5 植物总RNA提取 |
| 3.1.6 反转录反应(用于qPCR) |
| 3.1.7 实时荧光定量RT-PCR |
| 3.1.8 miRNA提取 |
| 3.1.9 PCR反应 |
| 3.1.10 PCR产物回收 |
| 3.1.11 连接和转化 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 高通量测序的流程 |
| 3.2.2 vsiRNA的尺寸分布 |
| 3.2.3 vsiRNA5'末端碱基偏好性和正负链偏好性 |
| 3.2.4 vsiRNA在 PMMoV基因组上的分布 |
| 3.2.5 vsiRNA靶标的预测和分析 |
| 3.2.6 PMMoV侵染辣椒后主要RNA沉默途径组分的差异表达 |
| 3.3 结论与讨论 |
| 第四章 PMMoV侵染辣椒后miRNA的表达分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 辣椒小RNA的高通量测序 |
| 4.2.2 辣椒中已知miRNA的表达 |
| 4.2.3 测序文库中新miRNA的预测 |
| 4.2.4 新miRNA靶标的预测及功能分析 |
| 4.3 结论与讨论 |
| 第五章 PMMoV侵染辣椒后的转录组学分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 毒源和植物材料 |
| 5.1.2 主要仪器及试剂 |
| 5.1.3 转录组测序 |
| 5.1.4 转录组数据分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 转录组测序总体分析 |
| 5.2.2 基因差异表达分析 |
| 5.2.3 差异表达基因GO分类富集分析 |
| 5.2.4 KEGG富集分析 |
| 5.2.5 qRT-PCR对转录组数据的验证 |
| 5.3 结论与讨论 |
| 第六章 细胞自噬抑制PMMoV侵染的分子机制研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 质粒载体与菌种 |
| 6.1.3 主要仪器与试剂 |
| 6.1.4 PCR反应 |
| 6.1.5 酶切反应 |
| 6.1.6 PCR及酶切产物回收 |
| 6.1.7 目的片段与载体的连接 |
| 6.1.8 质粒DNA的提取 |
| 6.1.9 农杆菌感受态的转化 |
| 6.1.10 农杆菌浸润介导的瞬时表达 |
| 6.1.11 Western blot检测 |
| 6.1.12 激光共聚焦显微镜观察 |
| 6.1.13 酵母双杂交实验 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 表达载体的构建 |
| 6.2.2 PMMoV侵染诱导辣椒中自噬基因的上调表达 |
| 6.2.3 PMMoV侵染诱导本生烟的自噬途径 |
| 6.2.4 抑制自噬可以增加PMMoV RNA的积累 |
| 6.2.5 沉默自噬基因的表达增强了PMMoV的侵染 |
| 6.2.6 PMMoV与自噬途径互作蛋白的筛选 |
| 6.3 结论与讨论 |
| 第七章 全文总结及创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
四、Development of Gene Expression and Gene Silencing Vectors Based onCotton Leaf Curl Virus for Functional Genomics in Cotton（论文参考文献）
- [1]VIGS基因沉默技术在作物基因功能研究中的应用与展望[J]. 郝梦媛,杭琦,师恭曜. 中国农业科技导报, 2022(01)
- [2]桑树中与桑脉带相关病毒N蛋白互作的蛋白筛选、鉴定及其表达分析[D]. 李雨珈. 广西大学, 2021(12)
- [3]棉花高效CRISPR/Cas9基因编辑体系的研究[D]. 雷建峰. 新疆农业大学, 2021
- [4]全基因组关联分析解析棉花代谢产物的遗传和生化基础[D]. 斯欢. 华中农业大学, 2021
- [5]基于田间表型和表型组平台图像指标解析棉花响应干旱的遗传基础[D]. 李保奇. 华中农业大学, 2020
- [6]陆地棉纤维品质和产量性状的全基因组关联分析及候选基因的功能验证[D]. 张驰. 西北农林科技大学, 2020(03)
- [7]“成花素-抗成花素”调控棉花开花转变和株型发育的功能研究[D]. 刘慧. 石河子大学, 2020(01)
- [8]水稻高分辨率三维基因组结构与转录调控研究[D]. 曹志林. 华中农业大学, 2020(01)
- [9]Bt水稻对天敌的长期生态效应及基于RNAi转基因水稻安全性的评价探索[D]. 党聪. 浙江大学, 2020(07)
- [10]PMMoV侵染对辣椒小RNA表达的影响以及诱导细胞自噬机制的研究[D]. 焦裕冰. 沈阳农业大学, 2020(08)