一、Muscarinic stimulation rescues β_1-adrenergic response in transgenic mouse heart overexpressing β_2-adrenoceptor（论文文献综述）
王亚晗[1]（2020）在《参枝苓口服液对拟SAD小鼠的髓鞘保护作用机制研究》文中指出目的伴随社会老龄化,阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）发病率逐年飙升,其中散发性阿尔茨海默病（Sporadic Alzheimer’s Disease,SAD）占95%以上,且病因病机复杂。SAD患者存在中枢神经系统胰岛素抵抗和葡萄糖代谢异常,且不伴外周血糖升高,又被称为“Ⅲ型糖尿病”。“从心论治”代表方参枝苓口服液具有益气温阳,化痰安神的功效,对早中期AD有一定疗效,但机制有待探讨。白质损伤存在于AD全过程,早于淀粉样蛋白（amyloid P-protein,Aβ）沉积和神经纤维缠结（neurofibirilary tangles,NFTs）引起的早期认知障碍。PI3 K/Akt-mTOR信号通路是调控髓鞘相关蛋白,维护髓鞘完整的重要通路。为了从动物整体水平研究参枝苓口服液对SAD的髓鞘保护作用机制,本研究通过双侧侧脑室注射链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）（icv-STZ）拟SAD模型,观察参枝苓口服液对SAD小鼠学习和记忆保持能力的影响,并基于PI3K/Akt-mTOR通路,在髓鞘厚度、形态完整性和髓鞘相关蛋白形成的功能性脑回路中,探讨参枝苓口服液对于SAD早期的认知保护作用,从中医药角度为阿尔茨海默病早期干预提供实验基础。方法1.30只雄性3月龄C57BL/6J野生型小鼠随机选取15只双侧侧脑室注射人工脑脊液作为对照组,另外15只双侧icv-STZ制备SAD模型。分别于造模1、2、3、4个月后对两组小鼠进行跳台实验,观察小鼠学习和记忆保持能力变化;免疫组化和Western-blot观察AD特征性病理相关蛋白（Aβ42、phospho-tau）以及中枢糖代谢相关蛋白（IR、IRS-1、GSK3β、p-GSK3β、GLUT1、GLUT3）的表达水平,评价AD相关病理改变;透射电镜观察髓鞘超微结构,免疫组化和Western-blot观察髓鞘碱性蛋白（MBP）表达水平,评价模型的髓鞘损伤情况。2.90只雄性3月龄C57BL/6J野生型小鼠随机抽取15只双侧侧脑室注射人工脑脊液作为对照组,另外75只双侧icv-STZ制备SAD模型,适应性饲养一个月后随机分为模型组（蒸馏水）,多奈哌齐组（0.92mg/kg/d）,参枝苓大、中、小剂量组（49.67g/kg/d、24.83 g/kg/d、12.42g/kg/d）每组15只,所有小鼠按0.1ml/10g小鼠体重给药,每日灌胃1次,连续灌胃3个月。3.Morris水迷宫观察干预3个月后各组小鼠行为学表现,评价参枝苓口服液对SAD小鼠学习和记忆保持能力的影响。4.以牢固蓝（Luxol Fast Blue,LFB）染色法和透射电镜观察灌胃后各组小鼠的髓鞘超微结构和形态;免疫组化、Western-blot和RT-PCR观察髓鞘特异性蛋白MAG、MBP、MOG、PLP的蛋白表达和基因调控水平,评价参枝苓口服液对SAD小鼠的髓鞘保护作用。5.以免疫组化、Western-blot和RT-PCR观察PI3K/Akt-mTOR通路相关蛋白表达和基因调控水平,评价参枝苓口服液在髓鞘形成相关通路中发挥的作用。结果1.双侧icv-STZ拟SAD小鼠模型的AD相关病理改变跳台实验示:造模1、2、3、4个月后,双侧icv-STZ小鼠平均潜伏期较对照组缩短、平均错误次数较对照组增加（P<0.05,P<0.01）。免疫组化和Western-blot示:双侧icv-STZ小鼠Aβ42和p-tau表达较对照组增加（P<0.05,P<0.01）;双侧icv-STZ小鼠IR表达较对照组减少（P<0.05）,而IRS-1表达较对照组增加（P<0.01）,GSK-3β表达较对照组增加,而p-GSK-3β表达较对照组减少（P<0.05）;双侧icv-STZ小鼠GLUT1、GLUT3表达均较对照组减少（P<0.05,P<0.01）。透射电镜观察两组小鼠海马CA1区髓鞘超微结构,对照组髓鞘板层结构清晰完整,少突胶质细胞形态基本正常,双侧icv-STZ小鼠髓鞘崩解或严重膨出,少突胶质细胞形态不规则,染色质可见浓缩、边集（×2.5k）;对照组髓鞘和突触数量较多,双侧icv-STZ小鼠髓鞘和突触数量减少（×2.0k）;免疫组化和Western-blot与电镜结果一致,双侧icv-STZ小鼠MBP表达较对照组减少（P<0.05,P<0.01）。2.参枝苓口服液对拟SAD小鼠行为学的影响Morris 水迷宫示:第2～5天,各组小鼠平均潜伏期均缩短、平均游泳距离均减少,模型组平均潜伏期较对照组持续延长（P<0.01）、平均游泳距离较对照组增加（P<0.01）;第4天,多奈哌齐组和参枝苓大、中剂量组平均潜伏期较模型组缩短、平均游泳距离较模型组减少（P<0.05,P<0.01）;第5天,各治疗组小鼠平均潜伏期较模型组均缩短（P<0.05）,仅参枝苓大剂量组平均游泳距离较模型组减少（P<0.05）;撤台后,模型组较对照组穿越平台次数减少（P<0.01）,目标象限停留时间缩短（P<0.05）,多奈哌齐组和参枝苓大、中剂量组的穿越平台次数较模型组增加（P<0.05）,多奈哌齐组和参枝苓大、中剂量组的目标象限停留时间较模型组增加（P<0.05,P<0.01）。3.参枝苓口服液对拟SAD小鼠髓鞘结构和轴突直径/有髓纤维直径（g-ratio）的影响LFB染色示:对照组可见髓鞘纤维分布稠密,呈深蓝染色;模型组髓鞘纤维明显脱失,染色浅;各药物治疗组髓鞘纤维分布较模型组更紧密,蓝染色加深。透射电镜观察各组小鼠海马CA1区髓鞘板层结构,对照组髓鞘结构清晰完整,模型组髓鞘严重崩解,各治疗组的髓鞘结构较模型组明显修复（×12.0k）;随机选取5个视野计算g-ratio,模型组小鼠g-ratio较对照组增加（P<0.01）,各治疗组（参枝苓小剂量组除外）g-ratio值较模型组均减少（P<0.01）（×1.2k）;观察各组单个髓鞘,对照组轴突直径小,髓鞘较厚,模型组轴突直径较对照组增大,髓鞘变薄,多奈哌齐和参枝苓大、中剂量组轴突直径较模型组均减小,髓鞘厚度增加（×8.0k）。Western-blot示:模型组MAG表达较对照组降低（P<0.05）,各治疗组（除参枝苓小剂量组）MAG表达较模型组增加（P<0.05）。免疫组化示:除模型组外,各组均见MAG 阳性染色,其中对照组和参枝苓大剂量组MAG染色较深且分布稠密,模型组偶见MAG 阳性染色。Western-blot示:模型组MBP表达较对照组降低（P<0.05）,多奈哌齐组和参枝苓大、中剂量组MBP表达较模型组增加（P<0.01）;模型组MOG表达较对照组降低（P<0.01）,参枝苓大、小剂量组MOG表达较模型组增加（P<0.05）;模型组PLP表达较对照组降低（P<0.01）,除参枝苓小剂量组外的各治疗组PLP表达较模型组均增高（P<0.05）。4.参枝苓口服液对拟SAD小鼠MAG、MBP、MOG、PLP mRNA表达的影响RT-PCR显示,模型组MAG、MBP、MOG、PLP mRNA表达较对照组减少（P<0.05,P<0.01）,多奈哌齐和参枝苓大剂量组MAG、MBP、MOG mRNA表达较模型组增加（P<0.05,P<0.01）,各药物治疗组PLP mRNA表达较模型组均增加（P<0.05）。5.参枝苓口服液对拟SAD小鼠PI3K/Akt-mTOR通路相关蛋白表达的影响免疫组化示:模型组PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR阳性细胞数较对照组均减少（P<0.05,P<0.01）;与模型组相比,多奈哌齐组和参枝苓大、中剂量组PI3K、p-Akt阳性细胞数增加（P<0.05）,多奈哌齐组和参枝苓大剂量组Akt、mTOR和p-mTOR阳性细胞数增加（P<0.05,P<0.01）。PI3K和p-PI3K Westen-blot示:模型组PI3K表达较对照组降低（P<0.05）,参枝苓大、中剂量组PI3K表达较模型组均增加（P<0.05,P<0.01）;模型组p-PI3K表达较对照组降低（P<0.01）,多奈哌齐和参枝苓大剂量组p-P13K表达较模型组均增加（P<0.05）。Akt和p-Akt Westen-blot示:模型组Akt、p-Akt表达较对照组降低（P<0.05）,多奈哌齐和参枝苓大剂量组Akt、p-Akt表达较模型组增加（P<0.05）。mTOR和p-mTORWesten-blot示:模型组mTOR表达较对照组降低（P<0.01）,各治疗组mTOR表达较模型组均增加（P<0.05,P<0.01）;模型组p-mTOR表达较对照组降低（P<0.05）,多奈哌齐和参枝苓大剂量组p-mTOR表达较模型组增高（P<0.05,P<0.01）。p-S6K1 Westen-blot示:模型组p-S6K1表达较对照组降低（P<0.01）,多奈哌齐和参枝苓大剂量组p-S6K1表达较模型组增高（P<0.05）。6.参枝苓口服液对拟SAD小鼠PI3K/Akt-mTOR通路及下游S6K mRNA表达的影响模型组PI3K mRNA表达较对照组减少,无统计学差异（P>0.05）;各治疗组PI3K mRNA表达较模型组增加,无统计学差异（P>0.05）。模型组Akt、mTOR mRNA表达较对照组减少（P<0.05）;多奈哌齐和参枝苓大剂量组Akt、mTOR mRNA表达较模型组增加（P<0.05,P<0.01）,参枝苓中剂量组Akt mRNA表达较模型组增加（P<0.05）。模型组S6K mRNA表达较对照组减少（P<0.01）;多奈哌齐和参枝苓大剂量组S6K mRNA表达较模型组增加（P<0.05）。结论1.双侧icv-STZ拟SAD小鼠不仅行为学认知障碍持续存在4个月,并存在AD相应病理改变及髓鞘损伤;2.参枝苓口服液改善拟SAD小鼠早期认知损伤,与其促进髓鞘损伤后修复、增加髓鞘特异性蛋白表达,调节PI3K/Akt-mTOR通路相关蛋白表达有关。
肇炜博[2]（2019）在《Hippo信号通路在异丙肾上腺素所致心肌损伤中的调控作用研究》文中认为研究背景交感神经系统-β肾上腺素能受体（β-adrenoceptor,β-AR）激活是心肌损伤和心力衰竭的重要病理生理机制之一。β-AR激活可通过提高心肌收缩功能和心率起到功能代偿作用;然而,病理情况下长期、过度的β-AR活化则可导致心肌细胞凋亡和心肌纤维化。目前对β-AR过度活化诱导心肌损伤机制的了解还十分有限。近几年研究者们开始关注Hippo信号通路在心肌损伤和心力衰竭中的作用,但具体机制目前仍不清楚。Hippo通路是调节细胞凋亡和增殖的重要信号途径之一,其主要成员包括哺乳动物不育系20-样激酶1/2（mammalian sterile 20-like kinase 1/2,Mst1/2）、大肿瘤抑制因子同源物1/2（large tumour suppressor homolog 1/2,Lats1/2）、转录共调节因子Yes-相关蛋白（yes-associated protein,YAP）以及YAP的平行同源因子TAZ（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif,具有PDZ结合基序的转录共激活因子）。Hippo信号通路的激活可引起Mst1表达和磷酸化水平增加,通过促进YAP/TAZ磷酸化,抑制下游细胞增殖相关基因表达,同时促进细胞凋亡相关基因的表达。最近研究发现,心肌梗死时,抑制Hippo信号通路具有心脏保护作用。但目前尚不清楚心脏β-AR过度活化是否可通过激活Hippo信号通路导致心肌细胞凋亡和心肌纤维化。本人博士联合培养指导老师,澳大利亚Baker心脏和糖尿病研究所杜晓军教授课题组前期研究发现,在β-AR激动剂异丙肾上腺素（Isoprenaline,ISO）诱导的小鼠心肌损伤模型和心肌细胞特异性β2-AR过表达小鼠心肌组织中,促凋亡蛋白Bcl-2相互作用的细胞死亡介导因子（Bcl-2 interacting mediator of cell death,BIM）和促纤维化蛋白半乳糖凝集素-3（Galectin-3,Gal-3）的表达均升高。BIM是Bcl-2家族中仅含一个BH3结构域的小分子促凋亡蛋白。作为细胞凋亡的上游启动蛋白,BIM能够激活促凋亡的Bcl-2家族蛋白（如Bax,Bak）表达,同时下调抗凋亡的Bcl-2家族蛋白（如Bcl-2,Mcl-1）表达。Gal-3是一种与细胞内外糖蛋白有高亲和力的半乳糖凝集素,具有促进组织纤维化和炎症反应的作用。既往研究发现,敲除BIM基因能够抑制ISO诱导的心肌细胞凋亡、心肌肥大和心功能异常,但Gal-3是否介导了ISO诱导的心肌纤维化和心功能异常目前仍不清楚。此外,目前对于β-AR活化调控心肌细胞中BIM和Gal-3表达的信号转导机制仍不明确。既往研究发现,心肌细胞特异性Mst1过表达小鼠的心肌细胞中Gal-3的表达升高了约40-50倍,提示Mst1-Hippo信号通路可能参与了Gal-3的表达调控。因此,我们推测:β-AR过度活化可激活心肌细胞Hippo信号通路,进而上调BIM和Gal-3的表达,导致心肌细胞凋亡和心肌纤维化。研究方法1.以C57BL/6J小鼠和心肌细胞特异性β2受体转基因小鼠（β2-TG）作为研究对象,其中C57BL/6J小鼠给予不同剂量和不同时间的ISO治疗,采用Western-Blot检测心肌组织中Mst1,YAP,磷酸化YAP（p-YAP）和BIM的表达水平,ELISA检测Gal-3表达,并检测β-AR阻滞剂对YAP,p-YAP,BIM和Gal-3表达的影响。2.以Gal-3基因敲除（Gal-3 KO）小鼠作为研究对象,并给予ISO治疗,心脏超声检测小鼠心功能,羟脯氨酸浓度测定法检测小鼠心肌组织胶原含量,ELISA检测心肌组织中Gal-3水平,RT-q PCR检测心肌纤维化和炎症相关基因,以及心肌组织中YAP靶基因（CTGF、Ankrd1和Birc5）的表达水平。3.以心肌细胞特异性Mst1转基因小鼠（Mst1-TG）和Mst1显性失活突变体转基因小鼠（dn Mst1-TG）作为研究对象,并给予ISO治疗,Western-Blot检测心肌组织中YAP,p-YAP和BIM的表达,ELISA检测心肌组织中Gal-3水平;采用生物信息学方法分析Mst1-TG小鼠心肌组织中YAP靶基因的表达,并采用RT-q PCR检测Gal-3敲除对YAP靶基因的调控作用。4.体外培养H9c2细胞（大鼠心肌细胞株）,并给予si RNA-YAP治疗,Western-Blot检测YAP、BIM和Gal-3的表达水平,明确YAP敲低对心肌细胞中BIM和Gal-3蛋白表达的影响;H9c2细胞分别给予ISO、PKA抑制剂H89或PKI 14-22、腺苷酸环化酶激活剂Forskolin治疗,研究c AMP/PKA信号转导对ISO诱导的YAP磷酸化以及BIM、Gal-3表达的影响。研究结果1.ISO通过上调心肌组织中BIM和Gal-3表达诱导心肌损伤1)ISO能够时间和剂量依赖性的上调C57BL/6J小鼠心肌组织中BIM和Gal-3表达;2)非选择性β-AR阻滞剂普萘洛尔或卡维地洛能够显着抑制ISO诱导的小鼠心肌组织中BIM和Gal-3表达;选择性β1-AR阻滞剂阿替洛尔（AT）和β2-AR阻滞剂ICI-118551（ICI）也可有效抑制ISO诱导的Gal-3表达,当联合使用AT和ICI时,Gal-3表达有进一步降低的趋势;3)β2-TG小鼠心肌组织中BIM和Gal-3水平均显着上调,其中Gal-3的表达呈年龄依赖性增加;4)正常野生型小鼠给予ISO治疗后,心肌组织中Gal-3水平显着增加,左室短轴缩短率降低40%,心肌胶原含量升高55%,纤维化和炎症相关因子m RNA水平均上调。敲除Gal-3基因后,左室短轴缩短率回升,心肌胶原含量降低,纤维化和炎症相关因子m RNA水平降低。2.ISO可激活小鼠Hippo信号通路,促进心肌组织中Mst1表达和YAP磷酸化1)ISO能够上调C57BL/6J小鼠心肌组织中Mst1,YAP和YAP Ser127位点的磷酸化水平;2)非选择性β-AR阻滞剂普萘洛尔和卡维地洛能够显着抑制ISO诱导的小鼠心肌组织中YAP的表达和磷酸化水平;3)ISO可同时上调心肌细胞核YAP（n YAP）与细胞浆YAP（c YAP）表达,其中细胞浆YAP蛋白（c YAP）的增加更明显,n YAP与c YAP的比值（n YAP/c YAP）显着降低;4)β2-TG小鼠心肌组织中Mst1表达和YAP磷酸化水平呈年龄依赖性增加。3.ISO通过激活Hippo信号通路促进BIM和Gal-3表达1)Mst1-TG小鼠心肌组织中YAP,p-YAP,BIM和Gal-3表达均显着增加,给予ISO治疗后,Gal-3表达进一步增加;2)Mst1失活突变（dn Mst1-TG）后,ISO诱导的心肌组织中YAP,p-YAP,BIM和Gal-3表达均显着抑制;3)生物信息学分析发现Mst1-TG小鼠心肌组织中存在8,619个差异表达基因,其中4,080个基因上调,4,539个基因下调。比对Cistrome DB中已发表的YAP Ch IP-seq数据,Mst1-TG小鼠心肌组织中共发现666个YAP靶基因,其中262个上调,179个下调。基因集富集分析结果表明Mst1-TG小鼠心肌组织中YAP靶基因集上调;4)降低H9c2细胞（大鼠心肌细胞株）中的YAP水平,可显着上调BIM和Gal-3表达;5)ISO治疗或心肌细胞特异性Mst1过表达（Mst1-TG）均可上调小鼠心肌组织中三种YAP靶基因（CTGF、Ankrd1和Birc5）的表达。Gal-3基因敲除可显着抑制ISO诱导的YAP靶基因表达;在Mst1-TG背景下敲除Gal-3后,Birc5表达无明显改变,而CTGF和Ankrd1却显着下调。4.ISO通过c AMP/PKA激活Hippo通路,促进BIM和Gal-3表达1)PKA抑制剂H89和PKI 14-22均可显着抑制ISO诱导的H9c2细胞中p-YAP,BIM和Gal-3的表达;2)腺苷酸环化酶激活剂Forskolin可显着上调H9c2细胞中Mst1,p-YAP,BIM和Gal-3的表达水平。研究结论心肌β肾上腺素能受体过度活化可通过c AMP/PKA信号转导激活Hippo通路,诱导Mst1表达和YAP磷酸化,通过上调BIM和Gal-3表达,促进心肌细胞凋亡和心肌纤维化。本研究首次揭示β-AR可与Hippo信号通路相偶联,并通过调节下游的促凋亡蛋白BIM和促纤维化蛋白Gal-3表达,最终导致心肌损伤和心功能异常。本研究提示β-AR/Hippo/BIM-Gal-3信号通路可能成为心肌损伤防治的新靶点。
张紫森[3]（2019）在《周细胞对脓毒症大鼠血管舒缩和屏障功能的协同保护作用及机制》文中研究表明脓毒症是ICU中常见的危重病症,其发生率和死亡率均很高。据统计,我国每年有300万脓毒症患者,约100万人死于脓毒症。脓毒症和脓毒性休克的后期会出现血管功能障碍,即血管低反应性和血管渗漏,最终导致多器官功能衰竭,ICU中30%-40%的病人死亡与血管低反应性和血管渗漏有关。针对脓毒症血管低反应性和血管渗漏的发生机制,提出了一系列的治疗措施,但这些措施在纠正血管低反应性和血管渗漏过程中存在矛盾现象,如用缩血管药物增加血管反应性的同时,会导致血管内皮细胞骨架蛋白收缩,加重血管渗漏。目前临床上缺乏协同治疗血管低反应性和血管渗漏的措施。周细胞（Pericyte,PC）是位于小血管、微血管和毛细血管内皮细胞周围、基底膜内的一群具有收缩、分泌和多项分化潜能的细胞。近年来研究发现,周细胞参与炎症、免疫紊乱、血管异常增生等病理生理过程,在多种疾病如癫痫、阿尔兹海默症、糖尿病、心肌缺血、肺纤维化的发生发展过程中发挥重要作用。而周细胞能否协同调控和保护脓毒症后血管舒缩和屏障功能,及其主要作用机制是什么,目前尚不清楚。据此,本研究利用盲肠结扎穿孔（Cecal Ligation and Puncture,CLP）及静脉注射LPS复制SD大鼠和转基因小鼠脓毒症模型,以及LPS刺激血管平滑肌细胞（VSMC）和血管内皮细胞（VEC）,分别从整体及离体水平研究了周细胞对脓毒症血管反应性和血管通透性的协同保护作用及机制。研究内容:第一部分脓毒症周细胞结构和功能的变化及与血管反应性和血管通透性的关系利用CLP及静脉注射LPS复制脓毒症大鼠及小鼠（周细胞荧光标记）模型,观察脓毒症后不同时相点（6h、12h、24h）肠系膜血管周细胞数量和结构的变化;观察肠系膜血管舒缩反应性和血管通透性的变化,及其相关调节蛋白表达的变化,分析脓毒症后周细胞结构和功能的变化与血管反应性和血管通透性间的关系。第二部分输注外源性周细胞对脓毒症大鼠血管低反应性和血管渗漏的协同保护作用利用脓毒症大鼠模型,输注外源性周细胞和功能增强的周细胞（poly（i:C）预刺激）,观察周细胞在肠系膜微静脉上的定植情况,以及输注周细胞后对脓毒症大鼠肠系膜血管舒缩反应性、血管通透性及存活率的影响,以明确周细胞对脓毒症大鼠血管舒缩功能和屏障功能的协同保护作用。第三部分周细胞敲减大鼠血管反应性和血管通透性的变化及输注外源性周细胞对血管舒缩功能和屏障功能的回复作用用CP-673451（PDGFR-β抑制剂）建立周细胞敲减大鼠模型（药物敲减模型）,观察周细胞敲减大鼠在脓毒症后血管反应性和血管通透性的变化情况,以及输注外源性周细胞对血管反应性和血管通透性的回复作用,以进一步明确周细胞对脓毒症大鼠血管反应性和血管通透性的协同保护作用。第四部分周细胞协同调节血管反应性和血管通透性的作用及机制1.周细胞调节血管平滑肌细胞舒缩功能和血管内皮细胞屏障功能的直接作用利用培养的VSMC和VEC,观察正常和LPS刺激下周细胞与VSMC和VEC间直接接触的情况,以及对VSMC舒缩功能和VEC屏障功能的直接调节作用。2.周细胞微囊泡（PCMV）协同调节血管反应性和血管通透性的作用及机制利用培养的周细胞:（1）观察周细胞和功能增强周细胞分泌微囊泡数量的变化;（2）观察PCMV在VSMC和VEC中的吸收情况;（3）观察PCMV对整体动物和离体细胞血管反应性和血管通透性的影响;（4）观察PCMV及Poly（i:C）PCMV所含生长因子、microRNA的数量、种类的变化,观察这些活性物质对VSMC收缩功能和VEC屏障功能的影响。主要研究结果:第一部分脓毒症周细胞结构和功能的变化及与血管反应性和血管通透性的关系1.大鼠CLP和LPS致脓毒症后,肠系膜微血管周细胞数量明显减少、脱落;肠系膜微动脉舒缩反应性降低、血流速度逐渐减慢、肠系膜上动脉p-MLC20表达降低,肠系膜微静脉血管通透性增加、血管内皮细胞明显肿胀、内皮连续性结构破坏、紧密连接明显开放同时伴有红细胞渗出、肠系膜上静脉ZO-1和VE-cadherin表达降低。结果提示脓毒症后周细胞的脱落与血管低反应性和血管渗漏密切相关。2.周细胞荧光标记的小鼠脓毒症后,肠系膜微静脉及毛细血管PDGFR-β荧光表达降低,微血管周细胞脱落;肠系膜微动脉舒缩反应性降低,血管渗漏增加、血管内皮细胞明显肿胀、血管内皮结构破坏。上述结果进一步证实脓毒症后周细胞的脱落与血管低反应性和血管渗漏密切相关。第二部分输注外源性周细胞对脓毒症大鼠血管低反应性和血管渗漏的协同保护作用输注周细胞可定植于肠系膜微静脉上,在输注后24h定植最多。周细胞输注后可明显提升脓毒症大鼠72h的存活率和存活时间,明显改善脓毒症大鼠血管反应性、血管流速及肠系膜上动脉p-MLC20的表达;改善肠系膜血管屏障功能、改善血管内皮细胞结构和增加连接蛋白表达,功能增强（Poly（i:c）预处理）的周细胞效果更好。提示外源性周细胞对脓毒症血管反应性和血管通透性具有协同保护作用。第三部分周细胞敲减大鼠血管反应性和血管通透性的变化及输注外源性周细胞对血管舒缩功能和屏障功能的回复作用周细胞敲减大鼠肠系膜微血管周细胞数量减少、覆盖率明显降低,血管舒缩反应性明显降低,血管通透性明显增加、血管内皮紧密连接明显开放、血管内皮连接蛋白表达明显降低,周细胞输注后可恢复周细胞减少导致的血管舒缩功能和屏障功能的破坏。脓毒症会加重周细胞敲减大鼠的血管低反应性和血管渗漏,输注外源性周细胞可明显改善周细胞敲减大鼠脓毒症后血管反应性、血流速度和肠系膜上动脉p-MLC20表达,改善血管通透性,增加连接蛋白的表达;功能增强（Poly（i:c）预处理）的周细胞效果更好。提示输注外源性周细胞对周细胞敲减大鼠的血管反应性和血管通透性具有回复作用。第四部分周细胞协同调节血管反应性和血管通透性的作用及机制1.周细胞调节血管平滑肌细胞舒缩功能和血管内皮细胞屏障功能的直接作用周细胞与VSMC和VEC可直接接触形成连接,直接调节VSMC的收缩功能和VEC的屏障功能。2.周细胞微囊泡协同调节血管反应性和血管通透性的作用及机制周细胞可通过产生微囊泡（PCMV）协同改善VSMC舒缩功能和VEC屏障功能。机制研究发现,PCMV可通过携带Ang-1、miR-145和miR-132来发挥对VSMC收缩功能和VEC屏障功能的协同保护作用。miR-145主要作用于VSMC,抑制Sphk2和S1PR1表达,增加S1PR2和p-MLC20的表达,改善血管平滑肌细胞舒缩功能;miR-132主要作用于VEC,抑制Sphk2和S1PR2的表达,增加S1PR1、ZO-1和VE-cadherin的表达,改善血管内皮细胞屏障功能。提示周细胞主要通过分泌微囊泡携带Ang-1、miR-145和miR-132作用于血管平滑肌细胞和血管内皮细胞,实现对脓毒症血管反应性和血管通透性的协同调控和保护作用。结论:1.脓毒症后肠系膜微血管周细胞结构破坏、数量减少、覆盖率降低,在血管低反应性和血管渗漏中发挥重要作用。2.输注外源性周细胞可协同改善脓毒症血管低反应性和血管渗漏。3.周细胞敲减大鼠肠系膜微动脉收缩和舒张反应性明显下降,血管通透性明显增加,输注周细胞后可明显恢复周细胞减少导致的血管舒缩功能和内皮屏障功能损伤。4.周细胞可通过直接接触和分泌微囊泡协同保护脓毒症血管反应性和血管通透性。直接作用主要是周细胞与VSMC和VEC直接接触形成紧密和缝隙连接,产生物理覆盖和调节作用。旁分泌作用主要是周细胞分泌内含多种活性物质的微囊泡来发挥作用,如Ang-1、miR-145和miR-132。一方面周细胞分泌携带Ang-1的微囊泡,传递至VSMC和VEC,增加血管平滑肌细胞舒缩功能和血管内皮细胞屏障功能。另一方面,周细胞通过分泌携带miR-145和miR-132的微囊泡来发挥协同保护作用,其中miR-145主要在血管平滑肌细胞中起作用,它主要是通过降低Sphk2和S1PR1的表达,增加S1PR2和p-MLC20的表达来发挥作用;miR-132主要在血管内皮细胞中起作用,它主要是通过降低Sphk2和S1PR2的表达,增加S1PR1、ZO-1和VE-cadherin的表达来发挥作用。
侯晓鸿[4]（2019）在《Epac1参与β1-肾上腺素受体自身抗体诱导的心肌细胞自噬水平下降及受体机制研究》文中研究指明心功能不全在全世界的发病率与死亡率越来越高。心肌细胞是具有有限再生能力的终末分化细胞,心肌细胞大量丢失可引起心功能障碍,进而导致心功能不全。有研究报道,自噬调节的细胞死亡是心功能不全中细胞死亡的最常见形式。而心功能不全中自噬水平降低的机制尚不十分清楚。以往大量研究发现,在多种心血管疾病患者血清中β1肾上腺素受体自身抗体（β1-adrenergic receptor autoantibody,β1-AA）的阳性率比正常人高。我们前期研究发现,β1-AA诱导心肌自噬水平降低,并且这种自噬抑制参与β1-AA诱导的心肌细胞死亡乃至心功能不全。进一步研究发现,β1-AA通过激活β1-AR-cAMP进而活化蛋白激酶A（Protein kinase A,PKA）可降低心肌自噬水平,然而拮抗PKA并不能完全逆转β1-AA诱导的心肌自噬水平下降,提示还有其他因素参与β1-AA诱导的心肌自噬抑制。Epac1是cAMP新近发现的另一下游信号通路,那么Epac1是否参与β1-AA诱导的自噬水平降低及其相关机制目前尚不清楚。因此,本研究采用β1-AR-ECII抗原肽段,主动免疫8周龄雄性SD大鼠2 w,4 w,6 w,8 w,用SA-ELISA法检测大鼠血清中β1-AA的OD值以鉴定大鼠模型是否建立成功。用亲和层析法提纯大鼠血清中的β1-AA,用于离体实验。本研究运用ELISA检测心肌组织cAMP含量,Western Blot检测心肌组织PKA活性,运用Western blot及RT-PCR方法检测自噬相关基因LC3、Beclin1、P62的蛋白和mRNA表达水平。利用亲和层析法纯化的β1-AA对H9c2心肌细胞进行处理,观察β1-AA对cAMP,p-PKA表达的影响及自噬水平的变化,进一步给予PKA抑制剂H89观察自噬的变化情况。结果发现,β1-AA长期刺激引起心肌组织cAMP,p-PKA表达显着增加,自噬水平明显下降,而抑制PKA可明显拮抗β1-AA诱导的心肌自噬水平降低,然而,抑制PKA并不能完全逆转β1-AA诱导的心肌自噬降低。因此,我们进一步采用Western blot检测主动免疫大鼠心肌组织和β1-AA刺激H9c2心肌细胞的Epac1表达情况,结果显示,β1-AA诱导心肌Epac1表达增加。采用Epac1抑制剂ESI-09处理H9c2心肌细胞,观察抑制Epac1的表达对心肌细胞自噬的影响,结果发现抑制Epac1可明显改善β1-AA诱导的心肌自噬水平下降。接下来,我们重点探究β1-AA诱导心肌Epac1表达增加的可能机制。β1-AA是针对β1-AR细胞外第二环产生的自身抗体,可特异性激活β1-AR发挥效应,慢性长期β1-AR刺激可引发左心室扩张,心功能不全。另有研究表明,β2-AR可以与β1-AR形成异源二聚体,增强β1-AR的生物学效应。我们课题组已有研究发现,β2-AR不与β1-AA直接结合,但可以增强β1-AA与β1-AR结合引起的心肌成纤维细胞增殖。因此,我们推测β1-AR和β2-AR可能都参与β1-AA诱导的心肌细胞Epac1表达上调进而抑制心肌细胞自噬。为了探讨β1-AR和β2-AR在β1-AA导致心肌Epac1表达增加中的作用,我们选取β1-AR KO鼠和β2-AR KO鼠,用β1-AR-ECII抗原肽段建立主免模型,检测心肌组织Epac1的表达及自噬的变化情况。结果显示,β1-AR和β2-AR均参与β1-AA诱导的心肌组织Epac1表达增加及自噬水平下降。进一步,我们试图探讨β2-AR如何影响β1-AA诱导的Epac1表达增加。众所周知,与β1-AR只偶联Gs蛋白不同,β2-AR可以偶联Gs和Gi两种蛋白。有研究表明,过表达β2-AR可以显着抑制β1-AR的功能损伤,使用β2-AR反向激动剂ICI 118551偏向激活Gi信号通路也可减轻这种损害,提示β2-AR/Gi信号通路在β1-AR的功能发挥过程中起着重要作用。为了探讨β2-AR/Gi信号通路在β1-AA诱导的心肌细胞Epac1表达增加中的作用。我们选择ICI 118551预处理H9c2心肌细胞,再加β1-AA处理,结果显示,ICI 118551明显逆转β1-AA引起的心肌细胞Epac1表达增加,自噬水平降低及细胞存活率降低,提示β1-AA通过抑制β2-AR/Gi信号通路导致心肌细胞Epac1表达上调。第一部分Epac1参与β1-AA诱导的心肌自噬水平降低目的:本研究采用β1-AR-ECII抗原肽段主动免疫SD大鼠建立模型,同时用血清中提纯的β1-AA作用于H9c2心肌细胞,探讨Epac1是否参与β1-AA诱导的心肌自噬水平降低。方法:（1）使用β1-AR细胞外第二环肽段作为抗原肽段去免疫8周龄的SD大鼠,分别在主免2 w,4 w,6 w,8 w,采用ELISA检测血清中β1-AA的OD值,以检测模型是否建立成功;（2）用亲和层析法提纯血清中的β1-AA,并用BCA法检测其浓度,用于细胞实验;（3）采用ELISA检测β1-AA主免大鼠心脏组织2 w,4 w,8 w及β1-AA作用于心肌细胞12 h,24 h,36 h cAMP的浓度变化情况;（4）Western blot检测β1-AA作用不同时间心肌组织p-PKA、Epac1蛋白的表达,Western blot和RT-PCR检测自噬相关蛋白和基因的表达。结果:（1）β1-AR-ECII抗原肽段主动免疫大鼠血清中β1-AA的OD值随着免疫时间延长显着升高。（2）β1-AA可以引起心肌组织及H9c2心肌细胞cAMP含量累积、PKA活性增加。（3）β1-AA诱导心肌组织及H9c2心肌细胞自噬水平显着降低。（4）抑制PKA可以部分逆转β1-AA诱导的心肌自噬水平明显下降。（5）Epac1参与β1-AA诱导的心肌自噬降低。（6）Epac1可能通过促进IP3表达参与β1-AA诱导的心肌自噬水平降低。结论:β1-AA通过cAMP-PKA/Epac1诱导心肌自噬水平下降,Epac1促进IP3表达抑制心肌自噬水平。第二部分β1-AR和β2-AR参与β1-AA诱导的心肌细胞Epac1表达增加目的:本研究采用β1-AR-ECII抗原肽段主动免疫C57BL/6小鼠,β1-AR KO鼠,β2-AR KO鼠建立模型,同时用β1-AA作用于H9c2心肌细胞,研究β1-AA促进心肌细胞Epac1表达升高的受体机制。方法:（1）采用琼脂糖凝胶电泳检测基因鼠类型;（2）使用β1-AR细胞外第二环肽段作为主动免疫的抗原肽段去分别免疫C57BL/6小鼠、β1-AR KO鼠、β2-AR KO鼠各4周,采用ELISA检测血清中β1-AA的OD值,以检测模型是否建立成功;（3）Western blot和RT-PCR检测β1-AR KO鼠、β2-AR KO鼠心肌组织及atenolol和ICI 118551预处理,再加β1-AA干预H9c2心肌细胞,Epac1及自噬相关蛋白和基因表达;（4）采用免疫组化检测心肌组织Epac1的原位表达情况;（5）使用CCK-8进行检测atenolol和ICI 118551预处理后,再加β1-AA刺激H9c2心肌细胞对存活率的影响。结果:（1）β1-AR KO鼠和β2-AR KO鼠的基因型鉴定。（2）β1-AR-ECII主动免疫小鼠模型建立。（3）β1-AR参与β1-AA诱导的心肌组织Epac1表达增加及自噬水平下降。（4）β1-AR参与β1-AA诱导的H9c2心肌细胞Epac1表达增加、自噬水平降低及存活率降低。（5）β2-AR参与β1-AA所致心肌组织Epac1表达增加及自噬水平降低。（6）β2-AR/Gi信号通路拮抗β1-AA诱导的H9c2心肌细胞Epac1表达增加、自噬水平降低及存活率降低。结论:β1-AR和β2-AR均参与β1-AA引起的心肌组织Epac1表达增加,进而诱导心肌自噬水平下降及存活率降低。
秦小腾[5]（2019）在《Gsα在平滑肌功能障碍疾病中的作用和机制研究》文中研究指明1研究背景腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm,AAA）是较为常见的大动脉慢性退行性病变,由于腹主动脉管壁发生损伤或病变而造成正常结构的破坏,在血流冲击下腹主动脉局部膨出,如腹主动脉直径超过正常值的1.5倍或超过3cm时,即可诊断为AAA。AAA的年发病率大约为20-40/10万人,在美国每年大约有1 1000人死于AAA。性别、年龄、吸烟和遗传因素等是AAA的主要危险因素,在74岁-84岁年龄段的人群中,约有12.5%的男性与5.2%的女性患有AAA。超过50%的AAA患者因腹背撕裂样疼痛而就医诊断为AAA破裂,此类患者的死亡率超过80%。目前AAA的治疗以手术和介入治疗为主,缺乏有效的药物治疗。因此深入探索AAA发病的分子机制,是寻找有效的药物治疗靶点的关键。AAA的主要病理学特征包括腹主动脉中层弹力板断裂或缺失、血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）数量减少或功能异常、炎症细胞浸润等。AAA的主要分子机制包括细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）（主要是弹力蛋白和胶原蛋白）合成/降解失衡、氧化应激、血管新生、炎症因素以及VSMCs的凋亡、坏死和表型转化等。与其他终末分化的细胞不同,平滑肌细胞具有很强的可塑性。成熟的VSMCs主要表现为收缩表型,表达多种收缩型蛋白如平滑肌肌动蛋白α（alpha smooth muscle Actin,α-SMA）、平滑肌肌球蛋白重链（smooth Muscle myosin heavy chain,SMMHC）、SM22等。当血管遭受损伤刺激时,收缩型的VSMCs会激活其增殖、迁移和合成的能力,表达上调多种合成型蛋白如波形蛋白（Vimentin）、骨桥蛋白（Osteopontin）等,同时收缩型蛋白的表达显着下降,我们将VSMCs的上述改变称为平滑肌细胞表型转化（smooth muscle cell phenotypic swtich）。平滑肌细胞表型转化与AAA密切相关,例如,编码α-SMA蛋白的ACTA2基因的突变会引起人类家族性胸主动脉瘤的形成和破裂;利用ACTA2敲基因小鼠进一步证实这一结果可能与NF-κB依赖的AngⅡ敏感性增高有关;另有研究分别利用AngⅡ和CaC12诱导小鼠AAA模型,结果显示平滑肌细胞特异性敲除SM22α会显着增大AAA的最大直径及动脉中层弹力板的降解程度,而过表达SM22α则与之相反。由此可见,VSMCs的收缩表型对于维持血管正常功能有重要意义。多种信号分子如KLF4、SRF、SP1、TGF-β1参与调控平滑肌细胞的表型,其中KLF4作为调控平滑肌细胞表型转化的关键分子受到广泛关注。一方面KLF4能够直接抑制α-SMA、SM22α和SMMHC启动子的转录活性;另一方面,KLF4可以竞争性抑制SRF与平滑肌细胞α-SMA、SM22α和SMMHC的基因启动子结合,并抑制SRF的辅助因子心肌素（Myocardin）的表达,从而参与平滑肌细胞表型转化的调控。KLF4通过调控平滑肌细胞表型转化广泛参与了 AAA、动脉粥样硬化、动脉钙化、血管内膜增生等众多疾病进程。KLF4与AAA关系十分密切,在小鼠和人AAA的平滑肌组织中,KLF4的表达含量均明显增高;动物实验研究发现KLF4能够通过调控平滑肌细胞表型转化,促进AAA的形成;而小鼠平滑肌细胞特异性敲除KLF4后,AAA的最大直径和弹力板的断裂程度均明显下降。Gsα是指G蛋白s家族的α亚基,广泛表达于多种细胞类型。Gsα主要通过激活腺苷酸环化酶（Adenylate cyclase,AC）,增加第二信使环磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate,cAMP）的水平,从而激活PKA信号通路发挥其生理功能。Gsα功能失调与许多疾病密切相关,例如脂肪细胞特异性Gsα敲除小鼠表现为纤瘦的表型,耐寒性受损并且饮食诱导的产热增加;心肌细胞过表达Gsα的转基因小鼠表现为心肌收缩力显着增强,然而该小鼠随着年龄增长表现为心肌肥厚。我们的前期研究发现,平滑肌细胞特异性敲除Gsα能够导致小鼠慢性假性肠梗阻（Chronic intestinal pseudo-obstruction,CIP）的表型,小鼠肠道平滑肌α-SMA,SMMHC蛋白表达水平下降。然而Gsα调控平滑肌细胞表型转化的研究十分有限,Gsα是否通过影响平滑肌细胞表型调控的关键分子KLF4,进而调节平滑肌细胞表型转化和影响小鼠AAA进程尚不清楚。综上本研究提出如下假说:小鼠平滑肌细胞特异性敲除Gsα后,通过上调KLF4信号通路导致主动脉VSMCs从收缩表型向合成表型转化,从而加剧AngⅡ诱导的AAA的形成。本研究将通过构建平滑肌细胞特异性敲除Gsα的敲基因小鼠,利用皮下泵入AngⅡ的方法构建小鼠AAA模型,探究Gsα敲除对小鼠VSMCs表型转化和AAA的作用及机制,为临床上寻找AAA可能的药物治疗靶点提供实验数据支持。2研究目的（1）探讨Gsα在调控小鼠主动脉平滑肌细胞收缩表型中的作用及机制;（2）探究主动脉平滑肌Gsα在AngⅡ诱导的小鼠AAA模型中的作用及机制。3研究方法3.1构建平滑肌细胞特异性Gsα敲除小鼠将Gsαflox/flox小鼠与SM22-CreERT2小鼠交配,F1代相互杂交得到Gsαflox/floxSM22-CreERT2小鼠。该小鼠连续5天腹腔注射Tamoxifen（1mg/d）,即可在平滑肌细胞中特异性敲除Gsα,该小鼠命名为GsαSMKO小鼠。将Gsαflox/floxSM22-CreERT2小鼠与ApoE-/-小鼠交配,F1代相互杂交得到ApoE-/-/Gsαflox/floxSM22-CreERT2小鼠。该小鼠连续5天腹腔注射Tamoxifen（1mg/d）,即可在平滑肌细胞中特异性敲除Gsα,该小鼠命名为ApoE-/-/GsαSMKO双敲小鼠。使用Bimake鼠尾直接PCR试剂盒提取小鼠基因组DNA,PCR扩增Gsα、Cre和ApoE序列,琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型。3.2细胞实验采用贴块法提取小鼠原代主动脉平滑肌细胞,选用4-6代细胞进行实验。（1）KLF4 mRNA稳定性实验:原代主动脉平滑肌细胞分别转染GFP腺病毒和HuR过表达腺病毒,加入放线菌素D抑制转录,检测Oh、0.5h、1h和1.5h KLF4 mRNA含量,绘制曲线计算半衰期。（2）使用HuR的抑制剂CMLD-2刺激原代主动脉平滑肌细胞。（3）HuR siRNA转染:对照组和GsαSMKO小鼠的原代主动脉平滑肌细胞,分别转染CTR siRNA和HuR siRNA。（4）KLF4 siRNA转染:对照组和GsαSMKO小鼠的原代主动脉平滑肌细胞,分别转染CTR siRNA和KLF4 siRNA。（5）对照组和GsαSMKO小鼠的原代主动脉平滑肌细胞分别用PBS和AngⅡ（0.5μM）刺激25min。（6）RIP实验:在小鼠原代主动脉平滑肌细胞中验证HuR蛋白与KLF4 mRNA结合。3.3建立小鼠AAA模型10周龄ApoE-/-/Gsαflox/flox和ApoE-/-/GsαSMKO雄性小鼠分为以下四组:1)ApoE-/-/Gsαflox/flox+Saline组;2)ApoE-/-/Gsαflox/flox+AngⅡ组a;3)ApoE-/-/GsαSMKO+Saline组;4)ApoE-/-/GsαSMKO+AngⅡ组。其中,2)和4)组小鼠以皮下植入微量泵的方式泵入AngⅡ（1.44mg/kg/d）;1)和3)组皮下泵入生理盐水。所有小鼠从埋泵前两周进行高脂饲养,直至取材。3.4 Western blot检测 Gsα、HuR、KLF4、α-SMA、SM22、SMMHC、Calponin、Vimentin、Osteopontin、MMP2、Fibronectin、Collagen Ⅰ、CollagenⅢ、P65、p-P65、GAPDH和β-actin蛋白水平的表达。3.5 RT-PCR检测Gsα HuR、KLF4、α-SMA、SMMHC、Vimentin、Osteopontin、TGF-βl、E-selectin、IL-6、IL-17C、ICAM-1、TNF-α、CCL-2、GAPDH和β-actin的mRNA表达水平。3.6组织病理学检测（1）取材对照小鼠和GsαSMKO小鼠的主动脉。HE染色观察血管结构;免疫荧光检测小鼠主动脉中Gsα和a-SMA的表达;免疫组化检测KLF4、HuR、α-SMA、Vimentin、SMMHC、Osteopontin的表达。（2）免疫组化检测对照组与AAA小鼠主动脉中Gsα的表达。（3）取材AAA实验中的四组小鼠,拍照大体主动脉照片。HE染色观察血管结构;VVG染色观察弹力板断裂并进行评分;免疫组化检测CD68、4-HNE、MMP2、Vimentin、Osteopontin的表达。3.7检测cAMP水平使用Enzo Life Science公司的Direct cAMP ELISA kit检测主动脉组织中cAMP水平。3.8临床AAA标本患者AAA标本来自于需要手术治疗的患者术中切除的AAA组织,对照组来自于同一患者术中切除的病变部位临近的非AAA主动脉组织。免疫组化检测对照组与AAA患者主动脉平滑肌中Gsα、α-SMA、KLF4和HuR的蛋白表达。3.9统计学分析统计数据采用均数±标准误（mean±SEM）表示,首先对数据进行正态分布检验,两组间均数比较采用独立样本t检验,多组间两两均数比较采用单因素方差分析。P<0.05认为统计数据有显着性差异。4实验结果4.1构建平滑肌细胞特异性敲除Gsα的敲基因小鼠并检验其敲除效率我们将Gsαflox/flox小鼠与SM22-CreERT2小鼠杂交以产生F1代Gsαflox+/Cre+小鼠,Fl代相互杂交得到Gsαflox/flox/Cre+小鼠。该小鼠连续5天腹腔注射Tamoxifen,即可在平滑肌细胞中特异性敲除Gsα,该小鼠命名为GsαSMKO小鼠。同窝出生的Gsαflox/flox/Cre-小鼠注射等量Tamoxifen后,作为对照小鼠使用。免疫荧光、Western blot和RT-PCR结果均显示GsαSMKO小鼠的主动脉平滑肌中Gsα敲除效果良好,同时GSαSMKO小鼠主动脉组织中cAMP含量显着低于对照小鼠;而GSαSMKO小鼠和对照小鼠的巨噬细胞和成纤维细胞中Gsα表达水平无显着差异,说明平滑肌特异性敲除Gsα的敲基因小鼠构建成功。GsαSMKO小鼠与对照小鼠相比,体重、心率、左室射血分数明显下降,收缩压、舒张压无显着性差异。4.2敲除Gsα导致小鼠平滑肌细胞表型转化免疫组化、Western blot和RT-PCR结果均显示,与对照小鼠相比,GsαSMKO小鼠主动脉平滑肌中收缩型蛋白α-SMA、SMMHC表达下降,合成型蛋白Vimentin、Osteopontin表达升高。RT-PCR结果显示,与对照小鼠相比,GsαSMKO小鼠的主动脉组织中平滑肌细胞来源的细胞因子如TGF-β1、IL-6、E-selectin、IL-17C、ICAM-1、TNF-α和CCL-2的mRNA表达水平显着升高。Western blot结果显示,敲除Gsα导致小鼠主动脉平滑肌细胞对Ang Ⅱ的敏感性增加。HE结果显示,对照小鼠和GsαSMKO小鼠的主动脉直径、中膜厚度、平滑肌细胞核数目均无显着差异。4.3平滑肌细胞敲除Gsα可使HuR和KLF4表达水平增高Western blot和RT-PCR结果均显示,与对照小鼠相比,GsαSMKO小鼠的主动脉平滑肌组织中KLF4和HuR表达水平显着增加。4.4 KLF4是HuR的靶基因RIP实验结果显示,HuR蛋白能够与KLF4的mRNA结合;KLF4 mRNA稳定性实验结果表明,HuR蛋白能够增加KLF4 mRNA的稳定性,延长KLF4 mRNA的半衰期;使用HuR的抑制剂CMLD-2刺激平滑肌细胞能够显着降低KLF4蛋白的表达。4.5平滑肌细胞敲除Gsα后,可通过上调HuR/KLF4信号通路,而导致平滑肌细胞表型转化Western blot结果显示,与对照组相比,GsαSMKO细胞中KLF4、HuR和Vimentin表达上调,α-SMA表达下调;对照组和GsαSMKO组的平滑肌细胞转染HuR siRNA后均能显着抑制KLF4和Vimentin的表达,增加α-SMA的表达;对照组和GsαSMKO组的平滑肌细胞转染KLF4 siRNA后,均能显着降低Vimentin的表达并增加α-SMA的表达。以上结果说明,平滑肌细胞敲除Gsα能够通过上调HuR/KLF4信号通路,而导致平滑肌细胞表型转化;抑制HuR或KLF4能够一定程度逆转平滑肌细胞表型转化。4.6平滑肌细胞敲除Gsα可显着加重AngⅡ导致的AAA我们将Gsαflox/floxSM22-CreERT2小鼠杂交至ApoE-/-背景,得到ApoE-/-/GsαSMKO双敲小鼠,同窝出生的ApoE-/-/Gsαflox/flox小鼠作为对照,皮下泵入AngⅡ诱导AAA模型。与ApoE-/-/Gsαflox/flox小鼠相比,ApoE-/-/GsαSMKO小鼠的AAA成瘤率、瘤体最大直径和死亡率均明显增加,腹主动脉管壁结构破坏更明显,弹力板断裂更严重,AAA组织中CD68、MMP2、Vimentin和Osteopontin表达显着增高,而4-HNE表达无明显差异。4.9患者AAA组织中Gsα和α-SMA表达降低,HuR和KLF4表达升高免疫组化结果显示,与对照组相比,患者AAA平滑肌组织中Gsα和α-SMA的表达显着降低,HuR和KLF4的表达显着升高。5结论（1）敲除Gsα会导致小鼠主动脉平滑肌细胞发生表型转化;（2）平滑肌细胞敲除Gsα后,可通过上调HuR/KLF4信号通路,而导致平滑肌细胞表型转化;（3）平滑肌细胞敲除Gsα可显着加重Ang Ⅱ导致的AAA;（4）人类AAA的发生可能与Gsα/HuR/KLF4调控的主动脉平滑肌细胞表型转化相关。1研究背景慢性假性肠梗阻（Chronic intestinal pseudo-obstruction,CIP）是一种罕见的致残性肠动力障碍疾病。日本最近的一项全国性调查显示,每100万新生儿中约有3.7名CIP患儿,在15岁以下儿童中的发病率约为1/270000。CIP患者一般具有腹胀、呕吐、便秘及腹部疼痛等肠梗阻症状,与机械性肠梗阻相区别的是,CIP患者肠管内外并无实体性梗阻物存在,肠管亦无闭塞性病变。CIP病因多样,通常受遗传因素、药物毒副作用等因素影响,或者继发于其他疾病。目前临床中最常见的CIP病变形式是肠壁中的神经元和/或平滑肌病变,然而其分子机制尚不明确。由于消化系统长期功能失调,CIP患者常需要全胃肠外营养,因此患者生存质量差,有研究报告显示,CIP患者的生存率仅有19.7%。目前CIP患者常需手术治疗,严重者可能需要全胃肠移植。平滑肌细胞（smooth muscle cells,SMCs）参与构成人体许多重要的脏器系统,主要发挥其收缩和舒张功能。平滑肌收缩功能异常与许多人类疾病的发生发展密切相关,如CIP、高血压、哮喘等,这些疾病在发病机制上都存在平滑肌收缩蛋白表达异常的特点。因此,研究SMCs收缩蛋白的表达调控机制,对于理解平滑肌收缩异常相关疾病的发生发展机制有重要作用,同时对于寻找这些疾病的新的有效治疗靶点有重要价值。目前研究发现,许多转录因子如血清反应因子（serum response factor,SRF）、心肌素（myocardin,Myocd）、Foxf1 等参与调控SMCs收缩蛋白的表达。SRF是一种普遍表达的转录因子,能够识别并结合目的基因的CArG[CC（A/T）6GG]盒,激活多种平滑肌收缩相关蛋白的表达。SRF对胃肠道平滑肌的生长、分化至关重要,成年小鼠SMCs特异性敲除SRF能够导致小鼠小肠α-SMA、SM22、SMMHC表达降低,小鼠出现CIP症状。Myocd是SRF的转录共激活因子,它能够与SRF结合形成Myocd/SRF蛋白复合体,增强SRF的功能。Foxf1对于维持SMCs的正常分化非常必需。以往研究发现Foxf1基因位点的杂合缺失和点突变存在于40%的肺泡毛细血管发育不良伴肺静脉错位（ACD/MPV）患者中,该疾病表现为严重的胆囊、肺和胃肠道的发育不良。平滑肌特异性敲除Foxf1的新生小鼠表现为食管平滑肌层明显变薄,平滑肌收缩蛋白表达降低;而成年杂合子smFoxf1-/+小鼠的结肠表现为环形肌层变薄收缩功能减退。Foxf1调控SMCs生长、分化的机制尚不明确,一方面Foxf1能够直接结合并激活Telokin蛋白的启动子序列,直接调控其表达;另一方面,Foxf1可以结合SRF、Myocd或心肌素相关转录因子（myocardin related transcription factors,MRTFs）,与这些蛋白协同作用,共同调控Telokin的蛋白表达。结合小鼠平滑肌敲除Foxf1后所引起的胃肠道发育与功能障碍的表型,我们推测Foxf1极有可能与CIP密切相关。异源三聚体G蛋白,是动植物细胞内一种非常保守的蛋白家族,主要发挥跨膜信号传导的功能。G蛋白由α β、γ三个亚基构成,根据α亚基的不同G蛋白分为Gs、Gi、Gq、G12/13等类型。其中Gs蛋白的α亚基,即Gsα,能够接收G蛋白偶联受体传递的胞外信号,激活胞内的腺苷酸环化酶（adenylate cyclase,AC）,产生第二信使环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）,进而激活下游蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）信号通路,PKA通过磷酸化下游多种目的分子发挥不同效应。PKA能够磷酸化激活cAMP反应元件结合蛋白 1（cAMP response elements binding Protein 1,CREB1）的丝氨酸 133位点,调节SMCs生长、增殖、迁移等功能。Gsα缺失或功能异常通常会导致众多器官组织的功能障碍,Gsα组织特异性敲基因小鼠表现为相应组织器官功能失调,严重的可在胚胎期或出生后死亡。目前针对Gsα蛋白的研究较多的集中于代谢性疾病、内分泌疾病和肿瘤相关疾病等,尚未有利用平滑肌特异性的Gsα缺陷小鼠进行疾病研究的报道。本研究中首次构建了 SMCs特异性Gsα敲除小鼠,在前期观察中发现该敲基因小鼠表现为胃肠食物潴留、小肠肿胀的现象,可能是CIP的表现。本研究提出如下科学假说:小鼠SMCs特异性敲除Gsα后,通过影响Foxf1信号通路,下调小肠平滑肌收缩相关蛋白如SMMHC、α-SMA、SM22,从而导致SMCs收缩功能障碍,引起CIP。本实验将首次对SMCs敲除Gsα后小鼠的表型特征进行详细描述,检测小鼠小肠的收缩功能障碍情况,探讨引起CIP的可能的信号通路,为进一步从分子机制水平理解CIP提供参考。2研究目的（1）研究小鼠平滑肌中敲除Gsα对小肠功能的影响;（2）探讨Gsα对小肠平滑肌收缩蛋白的调控机制;3研究方法3.1构建平滑肌特异性Gsα敲除小鼠将Gsαflox/flox小鼠与Acta2-Cre小鼠杂交,得到的F1代小鼠相互杂交获得Gsαflox/floxActa2-Cre小鼠。该小鼠从胚胎期开始即特异性的在SMCs中敲除Gsα,该小鼠命名为GsααSMKO小鼠。将Gsαflox/flox小鼠与SM22-CreERT2小鼠交配,得到的F1代小鼠相互杂交获得Gsαflox/floxSM22-CreERT2小鼠。小鼠成年后连续5天腹腔注射Tamoxifen（1mg/d）即可在SMCs中特异性的敲除Gsα,该小鼠命名为Adult GsαSMKO小鼠。提取小鼠基因组DNA,PCR扩增Gsα和Cre序列,琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型。3.2细胞实验贴块法提取小鼠原代小肠SMCs,选用4-8代细胞进行实验。1)毛喉素（Forskolin）分别刺激SMCs 0、24、48h后提取总蛋白;2)染色质免疫共沉淀实验（ChIP）:SMCs加入Forskolin刺激12h,检测CREB1蛋白是否与Foxf1启动子序列结合;3)双荧光素酶报告基因:构建含Foxf1启动子序列的野生型荧光素酶质粒（WT-luc）,接着构建另外一种荧光素酶质粒,该质粒也含有Foxf1的启动子序列,但是将其中能够被CREB1结合的CRE位点的关键序列突变掉,该质粒称为CRE突变型质粒（CRE-mutated-luc）。将上述两种质粒分别转染SMCs,加入Forskolin刺激24h,检测荧光素酶活性。3.3绘制生长曲线和生存曲线1)记录对照小鼠和GsαSMKO小鼠7-28天体重变化,绘制生长曲线;2)绘制对照小鼠和GSαSMKO小鼠从出生至28天的生存曲线;3)雄性对照小鼠和Adult GsαSMKO小鼠从注射Tamoxifen之日起,记录之后70天的体重数据,绘制生长曲线;4)对照小鼠和Adult GsαSMKO小鼠从注射Tamoxifen之日起,绘制之后100天的生存曲线;3.4全肠运输时间测定（Whole-Gut Transit Time Test）给小鼠经口灌胃木炭测试餐,监测小鼠粪便中黑色染料首次出现的时间。3.5小鼠小肠肠段收缩力的检测利用BL-420F生物机能实验系统与张力换能器,记录小肠肠段的自发收缩波形和收缩力;分别用KC1、ACh和电场刺激（EFS）刺激小肠肠段收缩,记录收缩波形,计算收缩力。3.6检测cAMP水平使用Enzo Life Science公司的Direct cAMP ELISA kit检测小肠平滑肌组织中cAMP的水平。1)测量对照小鼠和Adult GSαSMKO小肠平滑肌组织基础状态下cAMP水平;2)测量异丙肾上腺素（ISO）刺激后对照小鼠和Adult GsαSMKO小肠平滑肌组织中cAMP水平。3.7 Western blot提取小肠平滑肌的总蛋白,分别检测Gsα、CREB1、p-CREB1、Foxf1、MYH11、MLCK、ACTA2、CNN1、ADRB1、ADRB2、GAPDH和β-actin蛋白表达水平。3.8 RT-PCR提取小肠平滑肌的总RNA,分别检测ACTA2、MYH11、CNN1、MLCK、SRF、Myocd、Foxf1 和β-actin的mRNA表达水平。3.9组织病理学检测:1)免疫组化检测空肠和回肠组织中ACTA2、Gsα和Cre蛋白的表达;2)免疫组化检测主动脉组织中ACTA2和Gsα蛋白的表达;3)免疫组化检测患者CIP标本和对照组小肠的平滑肌组织中Gsα、Foxf1、CREB1和p-CREB1的蛋白表达情况;3.10 HE染色观察小肠结构、测量小肠直径以及平滑肌层厚度。3.11芯片分析收集对照小鼠和GsαSMKO小鼠的小肠平滑肌、对照组和CIP组患者的回肠平滑肌组织,提取总RNA,由南京Vazyme Biotech公司对转录组序列进行芯片分析。3.12临床CIP标本收集患者CIP标本来自于术中切除的CIP病变组织;对照组病人患有与胃肠动力障碍无关的疾病,选择手术中切除的病变部位临近的正常小肠组织。3.13统计学分析统计数据采用均数±标准误（mean±SEM）表示,先对数据进行正态分布检验,两组间均数比较采用独立样本t检验,多组间两两均数比较采用单因素方差分析。P<0.05认为统计数据有显着性差异。4实验结果4.1平滑肌特异性敲除Gsα的敲基因小鼠构建成功Western blot和免疫组化结果显示,与对照小鼠相比,GsαSMKO小鼠的空肠、回肠和主动脉平滑肌中Gsα蛋白水平均显着下降。免疫组化结果显示,与对照小鼠相比,Adult GsαSMKO小鼠的空肠、回肠平滑肌层中Gsα蛋白水平均显着下降。4.2平滑肌特异性敲除Gsα导致小鼠出生后死亡出生后21天GsαSMKO小鼠体重相比对照小鼠下降34.1%,差异有统计学意义;GsαSMKO小鼠从出生后14天开始出现死亡,至生后28天全部死亡,而对照小鼠全部正常存活。4.3 GsαSMKO小鼠的平滑肌收缩功能异常基础状态下,GsαSMKO小鼠空肠和回肠的收缩张力均明显低于对照小鼠;分别使用KCl、ACh和EFS刺激收缩,GsαSMKO小鼠空肠和回肠的收缩张力均明显低于对照小鼠。4.4成年小鼠的平滑肌特异性敲除Gsα引发严重的肠梗阻与对照小鼠相比,Adult GsαSMKO小鼠的体重、摄食量和粪便排泄量均显着降低。Tamoxifen注射后3个月内,Adult GsαSMKO小鼠死亡率超过80%,对照小鼠全部存活;解剖发现Adult GsαSMKO小鼠回肠有明显的肿胀和食物残渣淤积。小鼠用木炭测试餐灌胃后,adult GsαSMKO小鼠首次出现黑便的时间是对照小鼠的三倍,差异有统计学意义。4.5成年小鼠平滑肌特异性敲除Gsα导致小鼠小肠平滑肌收缩功能受损HE染色分析发现,adult GsαSMKO小鼠的回肠的平均直径较对照组增加了1.6±0.3倍（3566±1011μm vs 2254±562μm）,差异有统计学意义。与对照小鼠相比,adult GsαSMKO小鼠回肠的平滑肌层显着增厚;其中adult GsαSMKO小鼠回肠的纵行肌层增厚2.4±0.5倍,环形肌层增厚2.1±0.4倍,差异有统计学意义。使用KCl刺激肠段收缩时,adult GsαSMKO小鼠的平均收缩力约为对照小鼠的25%,其中adult GsαSMKO小鼠的空肠收缩力约占对照小鼠空肠收缩力的34.3%,回肠的收缩力仅占对照小鼠的15.4%,差异均有统计学意义;使用Ach和EFS刺激也得到了类似的结论。4.6 Gsα敲除可下调平滑肌收缩蛋白的表达和cAMP/CREB1信号通路Western blot和RT-PCR结果显示,adult GsαSMKO小鼠平滑肌中收缩蛋白MYH11、ACTA2、CNN1及MLCK表达显着下降;调控平滑肌收缩蛋白的关键转录因子Myocd和Foxf1的表达显着降低。Gsα敲除后平滑肌中cAMP的基础水平较对照组显着降低;使用ISO刺激后,adult GsαSMKO小鼠的cAMP水平明显低于对照组。Western blot发现,adult GsαSMKO小鼠与对照小鼠相比,基础状态下和ISO刺激后,CREB1的总蛋白水平及其1 33位点丝氨酸的磷酸化水平均显着降低。4.7 CREB1与Foxf1基因的启动子序列结合并调控Foxf1的表达Forskolin能够显着增加SMCs中Foxf1蛋白的表达。利用JASPAR数据库分析发现,Foxf1的启动子序列中存在一个能够被CREB1识别的CRE位点。ChIP结果表明CREB1能够与Foxf1的启动子序列结合。双荧光素酶报告基因结果表明,CREB1能够激活Foxf1启动子。4.8 CIP患者的小肠平滑肌组织中Gsα、Foxf1、p-CREB1和CREB1的蛋白表达均下降转录组芯片测序结果表明,与对照组相比CIP患者的小肠平滑肌组织中Gsα、CREB1、Foxf1表达显着下调。免疫组化结果表明,与对照组相比CIP患者的小肠平滑肌组织中Gsα、Foxf1、p-CREB1和CREB1的表达水平均显着降低。5结论（1）平滑肌敲除Gsα能够导致小鼠生长发育迟缓和出生后1个月内死亡;（2）成年小鼠平滑肌敲除Gsα导致小鼠CIP的表型;（3）CREB1能够结合并激活Foxf1启动子,上调Foxf1蛋白的表达;（4）平滑肌中Gsα通过影响cAMP/CREB1/Foxf1信号通路,调控收缩相关蛋白的表达;（5）Gsα/CREB1/Foxf1信号通路可能参与了人CIP疾病进程。
贾鹏宇[6]（2020）在《BAG3与MALAT1在心肌生理性肥大和心肌病理性肥大中的不同作用及机制研究》文中研究表明背景:多种心脏疾病可以引起心力衰竭,心力衰竭是世界范围内引起死亡的主要原因之一。外界刺激可以使心脏发生生理性肥大反应或病理性肥大反应（又称为生理性重塑或病理性重塑）。生理性肥大是可逆的,有助于维持正常的心脏功能。生理性肥大主要表现为心肌细胞的适应性生长,伴随着心肌肌浆网Ca2+-ATP酶（SERCA2a）等有益蛋白表达上调以及血管生成增加,且不会出现ANP、ACTC以及Myh7等胎儿基因的激活和心肌纤维化。然而,病理性肥大是不可逆的,可以使心脏功能恶化并最终引起心力衰竭。病理性肥大主要表现为心肌细胞的非适应性生长、凋亡增加并伴随有胎儿基因激活和心肌纤维化。在许多心脏疾病的早期,心肌生理性肥大及病理性肥大同时存在。因此,研究影响心脏有益和有害两种肥大的影响因素和机制对于治疗多种心脏疾病,预防心力衰竭具有重要意义。BAG3是一种在心脏、骨骼肌和一些肿瘤中高表达的蛋白质,可以调控包括发育、凋亡、自噬以及肿瘤发生发展等多个生物学过程。越来越多的研究表明BAG3在心脏中也具有重要作用,它可以促进心肌中异常折叠蛋白质及受损细胞器的降解、抑制心肌细胞凋亡、维持心肌Z-盘的结构完整性、调节心肌收缩力以及促进细丝蛋白的转录等。此外在心力衰竭晚期的患者中,BAG3在心肌中的量下降而在血液中的量升高。MALAT1是一种在多种肿瘤和心脏中高表达的lncRNA,通过多种机制对肿瘤的发生发展起到调控作用。近年来,越来越多的研究发现包括MALAT1在内的多种lncRNA也对心脏的许多生物学过程具有重要的影响。MALAT1可以促进缺血状态下的骨骼肌血管再生,也可以通过多种途径激活包括血清反应因子（SRF）、ERK/MAPK通路等在内的多种对心肌病理生理变化具有重要影响的通路。然而,BAG3和MALAT1在心脏的生理性肥大和病理性肥大中是如何被调控的以及发挥什么样的功能目前尚不清除。目的:研究BAG3及MALAT1在心脏生理性肥大和病理性肥大中的调控、功能以及背后的机制。材料与方法:1、第一部分:我们构建了他莫昔芬诱导的心脏特异性BAG3纯合与杂合敲除鼠。我们利用这些小鼠分别通过连续游泳训练三周以及苯肾上腺素皮下缓慢渗透给药两周的方法构建小鼠心脏生理性肥大及病理性肥大模型。通过使用胰岛素样生长因子-1（IGF1）以及苯肾上腺素（PE）给药处理原代大鼠心肌细胞（NRVC）,分别构建了心肌细胞的生理性肥大与病理性肥大模型,用来在体外进行功能和机制研究。分别使用含有3*flag标记的BAG3腺病毒以及含有BAG3特异性shRNA的腺病毒在原代心肌细胞中过表达或敲减BAG3蛋白。使用小鼠心脏超声检测小鼠心脏功能及形态学变化。使用免疫组化H&E染色检测心肌横切面积的变化。使用Masson染色检测心肌纤维化改变。使用Western blot检测两种肥大相关指标及通路的变化。使用免疫荧光检测细胞面积的变化。2、第二部分:通过使用IGF1以及PE给药处理成年人类心肌细胞系（AC16）,分别构建生理性与病理性肥大模型,在体外对MALAT1的功能及机制进行研究。通过Lipofectamine 3000试剂向细胞内转染MALAT1特异性小干扰RNA、miR-26a类似物以及miR-26a抑制物。使用实时定量PCR检测各种RNA的表达水平。使用Western blot检测两种肥大相关指标的变化。使用荧光素酶报告基因技术验证RNA之间的结合。Western blot、免疫荧光、免疫组化图片均由Photoshop 2020处理。Western blot灰度值由image J（Ver 1.8.0）软件测量。免疫荧光及免疫组化细胞面积由image pro plus软件测量。实时定量PCR使用2-ΔΔCt公式计算相对表达量。条形图由Graphpad Prism（Ver 7.0.4）软件制作。所有统计学分析由SPSS（IBM）软件完成,结果展示为:平均值±标准误。统计学方法为单因素方差分析（one-way ANOVA）（使用Bonferroni和S-N-K方法进行事后检验）以及独立样本T检验分析。P<0.05被认为具有统计学意义。结果:1、第一部分:BAG3的表达在体外IGF1诱导的心肌细胞生理性肥大中以及体内游泳训练诱导的小鼠心肌生理性肥大中均上调。同样,BAG3的表达在体外PE诱导的心肌细胞病理性肥大中以及体内PE长期刺激诱导的小鼠心肌病理性肥大中均上调。在NRVC和小鼠中敲减BAG3抑制了心肌生理性肥大。在NRVC中过表达BAG3促进了IGF1诱导的生理性肥大。与之相反,在NRVC和小鼠中敲减BAG3加重了心肌病理性肥大。在NRVC中过表达BAG3抑制了PE诱导的病理性肥大。过表达BAG3促进了IGF1诱导的NRVC中的Akt-mTOR通路的激活,敲减BAG3抑制了该通路的激活。BAG3对心肌细胞生理性肥大的促进作用可以被PI3K或mTOR抑制剂（PF-04691502和Rapamycin）逆转。敲减BAG3促进了PE诱导的NFATc2蛋白的核积累,过表达BAG3抑制了其核积累。敲减BAG3对心肌细胞病理性肥大的促进作用可以被calcineurin抑制剂（Cyclosporin A）逆转。2、第二部分:MALAT1的表达在IGF1诱导的心肌细胞生理性肥大和PE诱导的心肌细胞病理性肥大模型中上调。敲减MALAT1抑制了PE诱导的病理性肥大反应而对IGF1诱导的生理性肥大无影响。MALAT1可以与miR-26a特异性结合并且两者间存在负调控关系。敲减MALAT1抑制了GATA4蛋白的表达,这种抑制可以被miR-26a抑制物逆转。同样,敲减MALAT1对病理性肥大的抑制可以被miR-26a抑制物逆转。结论:BAG3和MALAT1在心肌生理性肥大和心肌病理性肥大中上调。BAG3通过促进Akt-m TOR通路促进心肌生理性肥大。BAG3通过抑制calcineurin–NFATc2通路抑制心肌病理性肥大。MALAT1通过结合并抑制miR-26a对心肌病理性肥大起到促进作用。
王大伟[7]（2017）在《白细胞介素37对天然CD4+CD25+调节性T细胞免疫抑制活性的影响及其机制研究》文中研究说明研究背景天然CD4+CD25+调节性T细胞（Tregs）对于维持适度的免疫耐受和免疫稳态至关重要。CD4+CD25+ Treg细胞结构性表达叉头翼状螺旋转录因子（Foxp3）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原（CTLA）-4。上述关键的免疫调节性分子缺陷时,小鼠表现为致死性淋巴细胞增殖表型。CD4+CD25+ Treg表达Toll样受体4（TLR4）,后者可以被脂多糖（LPS）激活,Treg细胞抑制活性随之增强。Treg细胞还可以分泌抑制性细胞因子,如转化生长因子（TGF）-β和白细胞介素（IL）-10,发挥免疫抑制效应,抑制效应T细胞。Treg细胞自身增殖活性低下,它在体外可以抑制IL-2的产生,进而抑制T细胞活化。Treg细胞还可以通过细胞表面的IL-2受体,消耗效应T细胞赖以生存的IL-2,进而导致效应T细胞凋亡。Treg细胞可以控制Th1和Th2细胞转录因子表达,进而控制Th1和Th2型免疫反应。Treg细胞对于控制脓毒症早期的炎症反应有利。但是Treg细胞增多可以导致淋巴细胞增殖受抑制,进而导致脓毒症免疫麻痹。IL-37（IL-1F7）在人类细胞表达,在小鼠中不表达。但是人重组IL-37对小鼠细胞的效应和人类细胞的效应相似,均表现为下调固有免疫和获得性免疫反应。体内研究显示,IL-37在多种炎症疾病中发挥抗炎效应。IL-37转基因小鼠研究显示,IL-37对内毒素血症、刀豆素A诱导的肝炎、葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎、缺血再灌注损伤均有抗炎保护效应。新近研究显示,IL-37在人Treg细胞表达,基因敲减IL-37可以减弱Treg细胞的抑制活性。研究目的1.研究IL-37对正常小鼠CD4+CD25+ Treg免疫抑制活性的影响;2.体外模拟脓毒症环境,研究IL-37对LPS环境中小鼠CD4+CD25+Treg免疫抑制活性的影响;3.研究IL-37对脓毒症小鼠的生存保护效应。研究方法1.按照说明书要求,用美天妮磁性分离仪从C57BL/6J小鼠脾脏细胞中分选CD4+CD25+Treg细胞和CD4+CD25-T细胞。流式细胞术鉴定CD4+CD25+Treg纯度;2.用重组人IL-37（rhIL-37）（0～250 ng/ml）刺激Treg细胞12～48h。收集细胞上清液,ELISA分析Treg细胞分泌IL-10和TGF-β1变化;部分预处理的Treg细胞,进行免疫荧光染色,流式细胞术分析Treg细胞CTLA-4和Foxp3表达变化;部分预处理的Treg细胞用于抑制活性分析。IL-37预处理的Treg细胞与CFSE标记的CD4+CD25-T细胞共培养,96小时后收集上清液,ELISA检测CD4+CD25-T细胞因子IL-2、IL-4和IFN-y浓度。同时收集细胞,上流式细胞仪检测CFSE稀释度,检测发生CFSE稀释的CD4+CD25-T细胞百分比,借此分析CD4+CD25-T淋巴细胞增殖程度。通过检测上述指标,分析IL-37刺激和Treg细胞免疫抑制活性之间的关系,3.LPS（5 μ g/ml）预处理Treg细胞3天,预处理结束前24h向培养基中加入不同浓度IL-37（0～250 ng/ml）。预处理完毕后分析Treg细胞Foxp3/CTLA-4表达,IL-10/TGF-β分泌;Treg/CD4+CD25-T共培养,收集细胞上流式细胞仪,检测Treg对效应T细胞增殖活性的抑制程度;收集共培养上清液,检测IL-2、IL-4和IFN-y分泌。通过分析上述指标,明确LPS环境中,IL-37能否影响Treg细胞免疫抑制活性。4.建立小鼠盲肠结扎穿孔（CLP）模型,假手术组只分离盲肠,但不予结扎穿刺。给小鼠腹腔注射IL-37（1μg）。IL-37腹腔注射分三种方式:CLP术前2h注射、CLP术后立即注射和CLP术后2h注射。在三个相应时间点腹腔注射PBS(20（μl）作为对照组处理方式。处理完毕后,观察CLP小鼠8天生存率。5.统计学分析:应用SPSS软件统计分析。连续性变量首先进行正态性检验和方差齐性检验。数据用均数±标准差（SD）表示。每个实验重复三次。多组比较应用单因素方差分析和Bonferroni检验。生存率应用Kaplan-Meier生存曲线分析和log rank检验。P<0.05认为有统计学差异。结果1.IL-37对CD4+CD25+ Treg抑制活性的影响:IL-37预处理增强了 CD4+CD25+Treg细胞对效应T细胞的免疫抑制活性,100 ng/ml处理组和24h处理组效应最明显。LPS可以活化小鼠Treg细胞,加强Treg细胞免疫抑制活性。IL-37预处理,可以进一步上调LPS环境中的Treg细胞的免疫抑制活性。2.IL-37对Treg细胞Foxp3/CTLA-4表达的影响:IL-37（40～250ng/ml）预处理Treg细胞24h,可以显着增强Foxp3表达;IL-37（100～250ng/ml）预处理Treg细胞24h,可以显着增强CTLA-4表达。100ng/mlIL-37预处理Treg细胞不同时间,24h组Treg细胞的Foxp3/CTLA-4表达上调最明显。LPS刺激上调Foxp3表达,但是对CTLA-4表达无影响。IL-37联合LPS刺激,可以上调Treg细胞Foxp3/CTLA-4表达。3.IL-37对Treg细胞IL-I0/TGF-β分泌的影响:IL-37促进Treg细胞分泌TGF-β1。LPS刺激也可以加强TGF-β 1分泌。LPS环境中,IL-37刺激可以进一步促进Treg细胞分泌TGF-β。IL-37和LPS单独刺激,或IL-37/LPS联合刺激,对Treg细胞IL-10分泌均无影响。4.IL-37对共培养试验中CD4+CD25-T细胞分泌IL-2、IL-4和IFN-γ的影响:Treg细胞可以抑制IL-2,但是IL-37预处理不影响Treg对IL-2的抑制效应。LPS预处理加强Treg细胞对IL-2的抑制效应,LPS联合IL-37刺激,不能进一步上调Treg细胞对IL-2的抑制效应。Treg细胞有效诱导Th2细胞极化,共培养试验中上清液IL-4/IFN-γ比例增加,提示Th2细胞增多。IL-37刺激或IL-37联合LPS刺激,加强了 Treg细胞极化Th2细胞的效应。5.IL-37对脓毒症动物生存率的影响:IL-37预处理或IL-37术后立即给药,均可以改善动物生存率。然而,IL-37术后2h给药对脓毒症动物没有生存保护效应。结论rhIL-37增强CD4+CD25+ Treg细胞的免疫抑制活性,这为脓毒症免疫调节治疗提供了新思路。
石力[8]（2017）在《β1肾上腺素受体和毒蕈碱M2受体介导电针改善急性心肌缺血效应机制研究》文中研究说明研究背景及目的心肌缺血性疾病以其高发病率、高死亡率,严重威胁人类的生命健康。现代医学的药物及手术治疗对心肌缺血性疾病有显着的疗效,但这些治疗方法仍然存在很多不足之处。针刺治疗是一种安、验、便、廉的治疗方法,在治疗心肌缺血性疾病中起重要的辅助治疗作用。已有大量的临床研究证实,在血运重建和药物治疗的基础上,进行针刺治疗,能够降低心绞痛的发作频率,降低患者的死亡率,改善患者的生活质量。心脏在交感神经和副交感神经的平衡调节下发挥正常的生理功能,β1-肾上腺素能受体（β1AR）和毒蕈碱M2受体（M2AChR）分别是存在于心肌细胞的交感和副交感神经递质受体的主要亚型,而心脏自主神经功能失衡以及其受体表达和功能活性的异常改变在心脏病理改变中起重要的作用。已有大量的研究证实,针刺内关穴能够调节心脏自主神经的兴奋性,对心肌缺血发挥良好的保护效应。而目前对β1AR和M2AchR及其信号转导通路在针刺保护心肌缺血效应机制中的作用尚缺乏系统性的研究。本研究采用无负重力竭游泳（ES）的方式制备急性心肌缺血（MI）模型,以心电图、血清cTnT、组织学改变为指标,观察电针内关穴改善力竭游泳诱发心肌缺血性损伤的效应。并引入特异性β1AR和M2AchR基因敲除（β1AR-/-和M2AchR-/-）小鼠,采用心脏电生理学技术、酶联免疫吸附实验（ELISA）、蛋白印迹法（Western Blot）等技术,检测电针内关穴对β1AR和M2AchR及其受体后信号成分的表达及功能的影响,系统地探讨β1AR和M2AchR及其信号转导通路的变化规律和响应模式。研究方法实验采用C57BL6雄性小鼠42只,β1R-/-和M2AChR-/-雄性小鼠各12只,体重为18-25g。其中18只C57BL6小鼠随机分为正常对照组（n=6）、模型组（n=6）、内关组（n=6）,模型组和内关组分别于实验的第1、3、5、7天进行力竭游泳,模型组不进行其他干预,内关组每日电针内关穴30min,正常对照组不进行力竭游泳和电针,仅每日进行抓握固定30min。正常对照组记录基础、第一天和第七天的心电图（ECG）,模型组和内关组记录基础ECG,并在第一天和第七天力竭游泳后即刻检测ECG。各组小鼠均于实验结束后处死迅速取心脏,储存于-80℃冰箱以备检测。采用ELISA检测心肌组织中环磷酸腺苷（cAMP）和环磷酸鸟苷（cGMP）的含量,用Western Blot法检测心肌组织中β1AR、M2AchR、兴奋性G蛋白（Gs蛋白）和抑制性G蛋白（Gi蛋白）的表达水平。β1R-/-和M2AChR-/-小鼠均分为模型组（n=6）和内关组（n=6）,采用与C57BL6小鼠相同的干预方案,检测基础ECG及实验第1天和第7天力竭游泳后的即刻ECG。另外24只C57BL6小鼠,随机分为正常对照组（n=8）、模型组（n=8）、内关组（n=8）,采用上述相同的干预方法,正常对照组在实验第7天麻醉后取心脏,模型组和内关组均于第7天力竭游泳后即刻麻醉取心脏。将每组中4只小鼠的心脏置于Langendorff灌流装置,分离心肌细胞,分别检测单个心肌细胞在多巴酚丁胺（β1AR激动剂）、Forskolin （腺苷酸环化酶激动剂）、8-Br-cAMP （cAMP的拟似剂）、乙酰甲胆碱（MCh,M2AchR激动剂）和8-Br-cGMP （cGMP的拟似剂）作用下钙瞬变波幅的变化,观察心肌细胞中β1AR、M2AchR的反应性,腺苷酸环化酶（AC）、蛋白激酶A（PKA）和磷酸二酯酶（PDE）的活性变化;并收集血液,以备检测血清中cTnT的含量。每组中另外4只小鼠取心脏置于4%多聚甲醛固定,以备组织学检测。研究结果（1）力竭游泳能够使C57BL6小鼠心电图J点发生显着偏移（模型组P<0.05,内关组P<0.01,与正常对照组比较）,心率显着降低（模型P<0.05,内关组P<0.05,与同组基础心率比较）;血清cTnT含量显着升高（P<0.05）;组织学检测显示左心室心肌组织存在明显的缺血区域,并呈现典型的心肌缺血病理改变。电针内关穴后,可以显着减小心电图J点的偏移量（P<0.01,与同组第1天比较;P<0.05,与模型组第7天比较）,降低血清中cTnT的含量（P<0.01）,组织学检测显示心肌缺血病理改变明显改善,缺血区域明显减小（P<0.01）,缺血程度明显减轻（P<0.01）。但是,电针对力竭游泳所致的心率减慢没有明显的影响,内关组心率仍显着低于基础心率（P<0.05）。（2） β1AR和M2AchR敲除后,电针内关穴改善心肌缺血的效应消失。（3） β1AR信号转导通路在电针保护心肌缺血性损伤中的作用:力竭游泳后,心肌组织中β1AR的表达显着降低（P<0.01）,其对多巴酚丁胺的反应性较正常对照组显着降低（P<0.05）。心肌组织中Gs蛋白的表达没有明显改变,cAMP的含量显着降低（P<0.01）。单个心肌细胞对Forskolin的反应性与正常对照组比较没有明显的改变,而在8-Br-cAMP的作用下心肌细胞钙瞬变的幅值显着降低（P<0.05）。.电针内关穴后,心肌组织中β1AR的表达量较模型组显着增加（P<0.05）,心肌细胞对多巴酚丁胺的反应性显着增强（P<0.05）。心肌组织中Gs蛋白和cAMP的含量与模型组比较没有显着变化（P>0.05）。单个心肌细胞在Forskolin的作用下,其钙瞬变的幅值较模型组显着降低（P<0.05）,心肌细胞在8-Br-cAMP激动下的钙瞬变波幅与模型组比较没有显着改变（P>0.05）。（4） M2AchR信号转导通路在电针保护心肌缺血性损伤中的作用:力竭游泳后,心肌组织中M2AchR的表达显着减低（P<0.01）,心肌组织中Gi蛋白的表达较正常对照组没有明显改变,cGMP的含量显着降低（P<0.01）。单个心肌细胞内钙瞬变波形的幅值在乙酰甲胆碱（P<0.01）和8-Br-cGMP （P<0.01）的作用下较正常对照组显着增加。电针内关穴后,心肌组织中M2AchR的表达显着增加（P<0.01）, Gi蛋白的表达有上调的趋势,而cGMP的含量与模型组比较没有明显变化（P>0.05）。单个心肌细胞内钙瞬变波形的幅值在乙酰甲胆碱（P<0.01）和8-Br-cGMP （P<0.05）的作用下较模型组均显着降低。结论本实验结果提示,电针内关穴能够减轻力竭运动所致的心肌缺血性损伤,β1AR和M2AChR共同参与介导了该效应。电针内关穴能够提高力竭游泳小鼠心肌组织中β1AR的表达水平,并提高β1AR的敏感性。同时,电针内关穴也能够增加力竭游泳小鼠心肌组织中M2AChR的表达,通过增加M2AChR-Gi蛋白的兴奋性,抑制AC的活性,抑制下游cAMP依赖性反应,以保持β1AR信号通路的适度兴奋性。而M2AchR下游的cGMP-PDE信号通路可能并未参与介导电针内关穴保护力竭运动所致心肌缺血效应的机制。电针内关穴可能能够使βi-AR和M2AChR信号转导通路恢复正常水平的兴奋性,并维持两者的平衡,从而恢复交感神经和副交感神经的正常调节作用,发挥对力竭运动所致心肌缺血的保护效应。
姜路路[9]（2016）在《蓝斑核去甲肾上腺素在帕金森病发生发展中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究目的帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是第二大最常见的神经变性疾病,特征表现为进行性运动障碍,包括静止震颤,肌强直,运动迟缓,和步态不稳等症状。当前全球大约有700万人患有帕金森病。在中国,帕金森病的患病率在65岁以上人群中大约是2.05%。帕金森病给社会和患者家庭带来巨大的经济和生活负担。据报导,在美国每名帕金森病患者每年的医疗费用大概在10,000美元。除了经济成本,帕金森病的运动和非运动症状都大大降低PD病人及其照顾者的生活质量。帕金森病的确切病因尚不清楚。帕金森在大多数患者都是特发性的。帕金森病的已知病因包括遗传,环境因素等,或者是两者的共同作用。流行病学研究表明,帕金森病患者中仅有不足10%与家族遗传因素相关,而超过90%的PD患者都是散发的。目前,帕金森病尚缺乏有效的治疗手段。可得的治疗方案大多为对症治疗,包括补充左旋多巴,多巴胺激动剂和MAO-B抑制剂等。但这只能缓解症状,并不能阻断或逆转疾病的发展。帕金森病的主要病理变化包括多巴胺能神经元变性,Lewy体形成和纹状体多巴胺减少等,这些病理变化的共同特征是慢性、渐进性、不可逆的改变。正常人中,大脑黑质区多巴胺能神经元随着人体老化过程也会有少量减少,大约不超过10%-15%,但并不会出现帕金森病症。大部分PD患者被确诊时,多巴胺能神经元的损失已经达到60%以上。对于帕金森病的疾病进展过程的研究,虽然黑质纹状体通路仍然是主要焦点,但随着病人尸检结果和MRI技术应用等,早有研究表明,中脑-皮质,皮质-边缘通路在疾病进程中也发挥了重要作用。除了多巴胺能神经元投射系统,胆碱能神经元,γ-氨基丁酸能神经元,和去甲肾上腺素能神经元投射系统也发生明显病理改变,包括神经元减少、Lewy体形成及神经递质减少等。2003年,德国病理学家Braak博士根据其在病人标本和尸检中α突触核蛋白染色等结果,提出着名的Braak“黑匣子理论”,认为PD不仅是运动障碍疾病,一系列的非运动症状在疾病早期,运动症状出现之前,即已发生,同时伴随有自脑干向中脑、皮质区自下而上发生神经元退行性变。Braak理论一经提出,就引起同行专家的广泛关注,帕金森病的发病起点、疾病进展因素、运动症状前非运动症状（包括嗅觉减退、胃肠功能失调、睡眠紊乱、焦虑-抑郁病症等）成为帕金森病研究新的关注焦点和研究方向。多项研究证实,帕金森病疾病进展中,脑干区域蓝斑核（Locus Coeruleus, LC）的去甲肾上腺素能神经元（Norepinephrine, NE）损失发生明显早于中脑黑质区域（Substantia Nigra, SN）的多巴胺能神经元,时间差大约要早10-15年。而且,蓝斑核神经元的减少很可能与帕金森病人的运动症状前出现的非运动症状有关,包括嗅觉减退、焦虑-抑郁症状、胃肠功能紊乱、睡眠障碍等。然而,对帕金森病早期阶段的病理改变和非运动症状的进一步研究一直停滞不前,原因是缺乏一个可利用的有效的动物模型。我们实验室先前的研究已经建立一个神经炎性诱导的帕金森病模型,该模型可以模拟帕金森病中黑质区多巴胺能神经元的慢性、渐进性病理改变和运动症状的延迟性、进展性出现。该小鼠模型是利用细菌内毒素腹腔注射,引起全身炎性反应,血液中高浓度的肿瘤坏死因子TNF-a被携带进入大脑,引起小胶质细胞的激活和持续性反馈激活,从而引起神经元变性死亡和疾病发生。然而,我们知道,帕金森病的神经元变性和症状改变已经不仅仅限于黑质致密部多巴胺能神经元的变性和运动障碍的出现。确定其他相关脑区,蓝斑核、海马、前皮质区神经元的改变也至关重要。因此,在本研究中,我们不仅观察黑质区多巴胺能神经元的改变,焦点更主要在炎性模型是否能够模拟帕金森病中实际发生的自下而上多个脑区渐进性神经元的变性和死亡。并试图由此揭示最早发生神经元变性的蓝斑核去甲肾上腺素能神经元在疾病进展中所扮演的角色。因此,该课题在细菌内毒素诱导的帕金森病神经炎性模型中,我们最早观察脑干区蓝斑核去甲肾上腺素能神经元的改变,这对于帕金森病的早期诊断和治疗具有重要意义。本项研究的主要目的为,确定炎症介导的啮齿动物帕金森病模型是否可以模拟帕金森病人中发生的自下而上渐进性神经元变性死亡和运动、非运动症状的出现,阐明蓝斑核去甲肾上腺素在疾病进展中的作用,并揭示发生这一慢性渐进性神经元变性的细胞和分子机制。我们的研究假设是,较早发生的蓝斑核去甲肾上腺素能神经元变性死亡启动和促进了帕金森病的发生和进展。我们的研究的目标包括：1)确定炎症介导的啮齿动物PD模型中是否发生自下而上、有序的渐进性神经元的缺失,尤其是蓝斑核去甲肾上腺素能神经元；2)确定较早发生的蓝斑核去甲肾上腺素能神经元死亡和去甲肾上腺素缺失是否与其投射区的神经元变性死亡有关；3)建立一个合适的帕金森病模型能够同时出现帕金森病的运动和非运动症状；4)阐明蓝斑核去甲肾上腺素如何调节炎症介导的神经退行性病变的机制。5)根据以上研究结果,发展新的帕金森病靶向治疗方案。研究方法1.小鼠动物模型：根据不同实验目的设计实验方案,6-8周龄雄性C57BL/6小鼠腹腔注射LPS （5 mg/kg.bw）或DSP-4 （50 mg/kg.bw）或先后联合注射。在设定的时间点（分别在注射之后的第1,2,4,7,10,12个月）,从各组取5-8只小鼠实施安乐死,并取出大脑后固定在4%多聚甲醛中4℃过夜。然后大脑置于30%蔗糖/PBS溶液中4℃保存,直至大脑下沉到容器的底部。作冠状切面冰冻切片,收集含蓝斑核的脑干,含黑质、海马的中脑,以及大脑皮质区的35μm厚度组织切片。2.免疫组织化学染色：用4-10%山羊血清和1%BSA在triton-100/PBS溶液中封闭,然后与多克隆兔抗TH抗体（1：2000-5000稀释）,或NeuN抗体（1：1000稀释度）4℃下作用48小时。使用Vectastain ABC试剂盒和二氨基联苯胺基染色显示细胞或免疫荧光染色共聚焦显微镜观察细胞形态和病理改变。3.细胞计数：在黑质致密部TH免疫反应（THIR）神经元的数目是由立体计数系统软件进行统计。该软件使用系统地随机化的黑质区域定义的边界之内无偏计数帧（100微米×100微米）的光学分馏方法计数估算。经DAB染色的NeuN免疫反应性神经元和Iba-1小胶质细胞或经免疫双荧光染色的神经元或细胞是由ImageJ软件进行自动计数。4.脑组织中神经递质检测：大脑皮质,海马,尾壳核,中脑和脑干中去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺等神经递质及其主要代谢物的含量水平经高效液相色谱（HPLC）进行检测。5.大脑各区炎症因子或标志蛋白：mRNA含量检测：应用实时定量PCR进行冰冻组织中炎症因子或标志蛋白mRNA含量检测,简言之,用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）提取和收集大脑皮质,海马,尾壳核,中脑和脑干组织中mRNA,并经反转录为cDNA,使用SYBR green PCR混合液进行标记,应用7900HT快速实时PCR系统根据制造商的方案进行实时PCR扩增。6.帕金森病小鼠模型中运动和非运动症状行为学改变的检测：在DSP-4/LPS注射后12个月的时间点,从每个组（生理盐水对照,DSP-4单独,DSP-4+LPS,和LPS单独）中随机选出8只小鼠,进行运动和非运动行为学的测试。运动行为学测定包括倒挂网格试验,加速转棒试验,旷场试验,以及步态障碍分析。非运动症状行为学的测试包括嗅觉功能测试,高架十字迷宫焦虑测试,一小时粪便收集便秘测试,惊厥反应测试,以及Morris水迷宫学习记忆功能测试。7.神经-胶质细胞原代培养体系建立：培养体系的建立,简言之,无菌操作下取出胎龄13/14天的Fischer 344大鼠或12/13天C57BL/6J和NADPH氧化酶基因敲除（CYBB）小鼠的胚胎,在解剖显微镜下分离出腹侧中脑,然后轻柔地机械吹打,以破碎组织。4℃离心以除去组织细胞碎片,弃上清液,加入细胞培养液,计数重悬后的细胞并接种到多聚赖氨酸（20mg/ml）预包被的24孔培养板（5×I05/0.5m1培养液/孔）或96孔培养板（1×105/0.2m1培养液/孔）中。细胞培养在含5%二氧化碳和95%空气的饱和湿度的37℃恒温培养箱中。细胞培养7天用于处理时,免疫化学染色定量分析显示神经-胶质细胞混合培养体系的细胞组成应为：10%为小胶质细胞,50%为星形胶质细胞,40%为神经细胞,在总神经细胞中,2.5-3.5%为多巴胺（dopamine, DA）能神经元。8.细胞系：本研究中使用到转染NADPH氧化酶（NADPH oxidase, NOX2）的猴肾COS7-PHOX和COS7细胞系。大鼠小神经胶质细胞系HAPI也在本研究中应用。9.多巴胺能神经元功能检测：[3H]多巴胺摄取测定法用于原代神经胶质细胞培养体系中多巴胺能神经元的功能评价。简言之,将细胞置于含浓度为1μM[3H]多巴胺的Krebs-Ringer缓冲液中37℃温育21分钟。之后将细胞用冰冷的Krebs-Ringer缓冲洗三次,然后收集在1NNaOH中。放射性浓度通过液体闪烁计数定量。10.炎症因子的测定：一氧化氮（NO）含量通过测定上清液与Griess试剂反应产生亚硝酸盐的累积水平决定。细胞上清液中肿瘤坏死因子α （TNF-α）的测定经TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒测定。细胞外超氧化物的测量是采用SOD抑制WST-1还原的原理与方法,简言之,用温的汉克氏平衡盐溶液（HBSS）清洗培养板中的纯小胶质细胞或神经-胶质细胞混合培养体系2次后,每孔加入50 ul溶解在HBSS中的不同处理的药物,37℃孵育30分钟,再分别加入50μl溶解在HBSS中的刺激物（如LPS）,最后加入100μl溶解在HBSS中的160mM WST-1（含或不含SOD,250 U/每孔）。在分光光度仪上（450nm）读取光密度值。超氧化物的产量是30分钟时吸收度的增加值,其结果表示为对照组的百分比。11.胞膜胞浆分离和Western blot分析：小胶质细胞在低渗裂解缓冲液裂解,然后进行匀浆。将裂解物在1600×g转速下离心15分钟,上清液在100000×g离心30分钟。在1%的Nonidet P-40的低渗溶胞缓冲液中重悬,将细胞膜成分和胞浆成分分离,并进行Western blot分析。12.血液分析：氯氮平或氯氮平-N-氧化物的第一次注射后21天,对小鼠进行安乐死,眼球血液收集在1.5ml肝素管。充分混匀后,不同类型的血细胞的数量经由自动血细胞计数器进行计数。13.统计分析：所有的组数据表示为平均值±SEM。统计分析使用单向或双向ANOVA把给药作为独立变量进行比较。当ANOVA呈显着差异时,使用Dunnettpost hoc检验组间差异。统计分析使用GraphPad Prism版本6.00,设定双面α 0.05进行统计分析。研究结果1.LPS注射引起小鼠自脑干至皮质,自下而上发生有序的、渐进性的神经元变性死亡。1.1在LPS诱导的神经炎性帕金森病小鼠模型中,蓝斑核去甲肾上腺素能神经元减少早于黑质致密部多巴胺能神经元减少3-4个月。单次腹腔注射LPS在C57BL/6小鼠后,蓝斑核去甲肾上腺素能神经元最先发生减少,4个月注射LPS后LC-NE神经元损失达30%,神经元减少持续进行,10个月可达52%。随后,中脑黑质区多巴胺能神经元在第7个月时发生明显减少,10个月时减少32%。同样的结果在人类A53T转基因小鼠中得以证实。A53T转基因小鼠在LPS腹腔注射1个月即发生蓝斑核神经元损失,而多巴胺神经元损失发生在3个月以后。这符合帕金森病人实际中发生的,循序渐进性神经元的变性死亡规律。1.2由LPS注射引起小鼠处脑干至皮质,自下而上发生的有序的、渐进性的神经元变性死亡。单次腹腔注射LPS在C57BL/6小鼠后,继蓝斑核去甲肾上腺素能神经元最先发生减少和中脑黑质区多巴胺能神经元减少之后,10个月时,中脑以上的海马、皮质区也相继发生神经元的变性死亡。总之,我们研究结果证明,炎症介导的小鼠帕金森病模型可以模拟帕金森病人表现出的自下而上,从脑干到皮质的神经元渐进性退行性变的病理改变过程。1.3蓝斑核去甲肾上腺素缺失增强LPS炎性反应引起的黑质多巴胺能神经元减少。在C57BL/6小鼠单次腹腔注射LPS 6个月之后,腹腔注射4次DSP-4（50mg/k）,时间间隔为每两周一次。DSP-4诱导蓝斑核去甲肾上腺素缺失,促使LPS炎性反应引起的黑质多巴胺能神经元减少增至50%,与LPS单独组的30%相比增加了20%。2.蓝斑核-去甲肾上腺素耗竭促进肾上腺素能神经元投射区神经元的退行性变和死亡。2.1蓝斑核-去甲肾上腺素耗竭引起投射区发生自下而上有序、渐进性神经元退行性变。蓝斑核-去甲肾上腺素由DSP-4注射耗尽后,首先在黑质致密部发现了延迟性和进展性的多巴胺能神经元减少,4个月时减少32.4%,这种减少持续发展,到第10个月时减少49.9%。另外,通过DSP-4诱导的神经变性随后也延伸到皮质和海马。NeuN免疫组织化学染色显示,在DSP-4给予第10个月时,海马和皮质的神经元减少分别达到30.0%和27.7%。值得注意的是,对于没有去甲肾上腺素能神经元投射的尾壳核进行免疫染色观察神经元是否受到影响,发现整个过程直至第10个月时,该区域的神经元稳定存在,未受DSP-4耗竭去甲肾上腺素的影响。2.2由DSP-4注射引起的去甲肾上腺素耗竭促使蓝斑核去甲肾上腺素能神经元投射区小胶质细胞发生持续活化。为了探索去甲肾上腺素耗竭引起投射区神经元变性死亡的原因,我们分别使用Iba-1和CD11b两个小胶质细胞胞浆和胞膜的特异性标志物抗体检测去甲肾上腺素能神经元投射区（包括黑质、海马、皮质）小胶质细胞的激活情况。结果显示,在所有这些去甲肾上腺素能神经支配的大脑区域,在DSP-4给予后的第7天时,小胶质细胞即表现出明显活化特征,包括阿米巴样肥大形态和Iba1、CDllb染色加深、表达升高,并且小胶质细胞的这些激活状态一直持续至第10个月。DSP-4处理导致的黑质、海马（DG区）、皮质小胶质细胞的激活,表现为CD11b染色密度的升高,以密度定量,与对照相比,第7天时,可增高至153.5%至193.8%,10个月时,升高至-250%。与此不同,对于没有去甲肾上腺素能神经元投射的尾壳核进行免疫染色观察小胶质细胞是否受到影响,发现整个过程直至第10个月时,该区域的小胶质细胞并无激活改变,未受DSP-4耗竭去甲肾上腺素的影响。2.3 dbh基因敲除诱导蓝斑核去甲肾上腺素能神经元投射的大脑区域神经元变性和小胶质细胞激活。为了进一步验证NE缺乏可引起神经功能障碍和神经炎症反应,我们在dbh基因敲除的小鼠中检测神经元和小胶质细胞的改变。dbh是去甲肾上腺素合成的关键酶,dbh基因敲除将完全阻滞NE的合成。结果跟DSP-4耗竭NE引起神经退行性变相似,与野生型相比,dbh基因敲除产生的NE枯竭同样引起蓝斑核投射区（黑质、海马、皮质）神经元的减少和小胶质的持续激活,并且神经元减少和小胶质细胞激活在未有LC-NE投射的尾壳核区并不发生。3.去甲肾上腺素耗竭促进LPS炎性介导的帕金森病小鼠模型同时出现运动和非运动行为学改变。3.1提前注射DSP-4促使去甲肾上腺素耗竭导致LPS炎性帕金森病模型中,黑质、海马和皮质区神经元变性和死亡增多。提前一周给予DSP-4注射以耗竭蓝斑核去加肾上腺素的合成,再给予LPS引起帕金森病炎性模型,可发现,在注射12月以后,与单独给予LPS的组别相比,DSP-4和LPS双重打击可增加蓝斑核投射区神经元的变性死亡（包括黑质、海马、皮质区）。3.2去甲肾上腺素提前耗竭促使LPS诱导的神经炎性帕金森病模型中出现多种符合帕金森病人中运动症状出现之前的多种非运动症状。与盐水对照或LPS单独给予组相比,DSP-4和LPS双重打击可以诱导小鼠帕金森病炎性模型中出现多种类似帕金森病人运动前症状的行为学改变,包括埋藏食物探索实验得出的嗅觉减退,梯形十字架迷宫实验得出的焦虑抑郁症状,一小时粪便试验中表现出的便秘胃肠功能紊乱等。3.3去甲肾上腺素提前耗竭促使LPS诱导的神经炎性帕金森病模型中出现多种帕金森病相关运动行为学改变。与生理盐水对照组相比,DSP-4或/和LPS注射小鼠在倒挂网格试验、加速转棒实验中表现出潜伏期明显缩短,旷场试验中边缘移动时间和距离明显减少。在自主行动步态检测中,DSP-4和LPS双重打击小鼠出现步态紊乱症状,表现为步幅缩短、后肢间距拉大,步态角度变宽、足外翻、拖步行动、自由活动受限等。3.4去甲肾上腺素提前耗竭促使LPS诱导的神经炎性帕金森病模型中出现小鼠惊恐反应。在DSP-4和LPS注射12个月之后,与生理盐水对照组相比较,小鼠表现出明显前脉冲抑制和惊恐反应增强。而在LPS或DSP-4单独暴露组,并无此反应。结果表明,DSP-4和LPS合并暴露促进帕金森病人中易出现的惊恐反应的发生。3.5去甲肾上腺素提前耗竭促使LPS诱导的神经炎性帕金森病模型中小鼠认知能力下降。在DSP-4和LPS注射12月之后,行Morris水迷宫实验发现,与生理盐水对照组相比较,DSP-4,LPS或DSP-4+LPS处理小鼠出现认知障碍以及学习记忆能力下降。4.突触外旁分泌的低浓度去甲肾上腺素通过调节小胶质细胞免疫活性发挥抗炎和神经保护作用。4.1在原代培养的神经胶质混合培养体系中,亚微摩尔浓度水平去甲肾上腺素保护多巴胺能神经元免受LPS诱导的神经毒性损伤。[3H]多巴胺摄取试验表明,去甲肾上腺素预处理可以重塑多巴胺能神经元的功能,并在10-6-10-9浓度范围内呈现剂量反应关系。多巴胺能神经元经THIR抗体免疫组织化学染色细胞计数的结果进一步证明,去甲肾上腺素预处理可以逆转LPS诱导的多巴胺能神经元毒性损伤和数量减少,在10-6-10-9浓度范围内呈现剂量反应关系。除了恢复多巴胺能神经元的数量,NE减少了炎症介导的神经毒性相关的多巴胺能神经突起退缩和退化。两者合计表明,去甲肾上腺素对LPS诱导的多巴胺能神经毒性具有保护作用。4.2小胶质细胞在低浓度去甲肾上腺素保护多巴胺能神经元免受炎性损伤中必不可少。在神经胶质细胞的混合培养体系中,NE（10-7M）有效逆转MPP+诱导的[3H]DA摄取减少,可恢复20%,但当去除该体系中的小胶质细胞时,这一保护作用消失。这表明,去甲肾上腺素介导的多巴胺神经保护需要小胶质细胞的存在,提示去甲肾上腺素可能是通过抑制小神经胶质细胞的激活而发挥作用。4.3低浓度去甲肾上腺素可以降低LPS诱导的小胶质细胞活化,并减少促炎因子的释放。经Iba-1抗体对小胶质细胞的特异性免疫细胞化学染色结果表明,LPS暴露后24小时,与对照组相比,小胶质细胞明显激活,表现为胞体肥大、分枝和凸起增多,Iba-1表达升高,但是去甲肾上腺素预处理组小胶质细胞的激活明显受到抑制（与LPS组相比）,小胶质细胞多处于胞体小、凸起少的静息状态。Iba-1染色的细胞计数结果也进一步证实激活状态的小胶质细胞明显少于LPS组。除了形态学观察,去甲肾上腺素预处理抑制了活化的小胶质细胞促炎因子的释放,表现为与LPS相比,TNF-α,一氧化氮和超氧化物的产生均明显降低和减少,并在10-6-10-9浓度范围内呈现剂量反应关系。4.4β2去甲肾上腺素能受体部分参与介导低浓度去甲肾上腺素的抗炎和神经保护作用。与野生型（wild type,WT）相比,p2去甲肾上腺素能受体基因敲除（β 2-AR-/-）可以部分逆转去甲肾上腺素对LPS诱导的TNF-α释放的抑制作用,但不能完全逆转,这提示可能另有其他信号通路同时参与介导了去甲肾上腺素的抗炎作用。与此同时,中脑神经胶质细胞混合培养体系中,[3H]多巴胺摄取量的测定也证实,去甲肾上腺素的神经保护作用仅部分受β2去甲肾上腺素能受体基因敲除的抑制。LPS引起[3H]多巴胺摄取量在WT和β2-AR-/-中都降低为50%,但在WT中,去甲肾上腺素预处理可以逆转至80%,而β2-AR-/-中只有65%。4.5低浓度去甲肾上腺素依赖于NOX2抑制LPS诱导的超氧化物的产生,并不受p2去甲肾上腺素能受体影响。在LPS处理的混合胶质细胞培养体系中,（+）-NE和（-）-NE两种形式的去甲肾上腺素可同等程度抑制LPS诱导的超氧化物的产生。因为（+）-NE与受体的亲和力远低于（-）-NE,这提示去甲肾上腺素抑制超氧化物的产生并不通过作用于受体的途径。在COS7-PHOX细胞系中,这一结果被进一步证实,（+）-NE和（-）-NE两个异构体可以同等程度抑制佛波脂（phorbol myristate acetate,PMA）诱导COS7-PHOX细胞系产生超氧化物。此外,在WT和β2-AR-/-的混合胶质细胞培养体系中,（+）-NE和（-）-NE两个异构体去甲肾上腺素对LPS引起的超氧化物的抑制作用相当。提前将去甲肾上腺素其他非特异性G蛋白偶联受体α1或β1受体分别经酚妥拉明和普萘洛尔阻断,对NE抑制LPS诱导超氧化物产生也无影响。综合表明肾上腺素的所有特异性和非特异性的G蛋白偶联受体,均没有参与调解NE抑制超氧化物产生的作用。4.6低浓度去甲肾上腺素抑制LPS诱导p47phox蛋白由胞浆到胞膜的转运。HAPI小胶质细胞系的Western blot分析结果表明,LPS处理可以显着降低p47phox蛋白在胞浆的含量,同时其在胞膜的含量增加,但是去甲肾上腺素预处理可以有效的抑制p47phox蛋白这种由胞浆到胞膜的转运,p47phox胞浆到胞膜转运是NOX2活化的必须反应步骤,这一结果提示去甲肾上腺素可以抑制NOX2的活化,从而抑制超氧化物的产生。4.7 NOX2介导低浓度去甲肾上腺素独立于β2肾上腺素受体的抗炎/神经保护作用。为了确定NOX2是否为除β2肾上腺素受体之外,介导低浓度去甲肾上腺素抗炎/神经保护效应的作用靶点,我们将NE对NOX2的抑制作用与NOX2的特异性抑制剂DPI相对比,发现NE与DPI相同程度抑制TNF-α产生和提升[3H]多巴胺摄取能力的作用,而且两者同时存在时没有叠加效应而是相互竞争。除此之外,在NOX2基因敲除的神经胶质细胞培养体系中同时经ICI-118,551完全阻断去甲肾上腺素能受体的作用时,去甲肾上腺素的抗炎和神经保护作用就完全被阻滞。这些数据表明,NOX2是除β2肾上腺素受体之外,介导低浓度去甲肾上腺素抗炎和神经保护作用的另一唯一靶点。4.8 NOX2特异性抑制剂（DPI）干预可以减少小鼠大脑中由于去甲肾上腺素耗竭引起的小胶质细胞活化。C57BL/6小鼠在给予DSP-4阻滞蓝斑核分泌去甲肾上腺素后,第4天可以明显观察到蓝斑核去甲肾上腺素能神经元的投射区（包括黑质区）小胶质细胞的活化,但是NOX2特异性抑制剂DPI干预可以抑制小胶质细胞的活化,表现为与DSP-4组相比,小胶质细胞的特异性CD11b抗体染色密度降低。5.氯氮平代谢产物（CNO和NDC）通过作用于小胶质细胞NOX2抑制其活化保护多巴胺能神经元免受炎性损伤。5.1在神经胶质细胞的混合培养体系中,氯氮平代谢产物（CNO和NDC）保护多巴胺神经元免受LPS诱导的神经毒性损伤。CNO或NDC预处理保护多巴胺神经元免受LPS诱导神经元损伤,表现为对[3H]多巴胺摄取能力的重塑和降低多巴胺能神经元数量的减少,并呈现凸形剂量反应关系。CNO和NDC最有效的浓度分别为0.01μm和0.1μm。5.2小胶质细胞在CNO和NDC的神经保护作用中至关重要。在神经胶质细胞的完全混合培养体系中,CNO和NDC都对神经炎性诱导的多巴胺能神经元损伤具有明显的保护作用,但当在培养体系中撤除小胶质细胞时,这些保护作用也随之消失,说明小胶质细胞是CNO和NDC发挥有效神经保护作用的靶点细胞。对小胶质细胞的免疫组织化学特异性抗体Iba-1和CD11b染色和Western bot定量结果表明,CNO和NDC可以有效抑制小胶质细胞的活化。进一步对TNF-α和NO等炎性因子的检测表明,CNO和NDC可以有效抑制小胶质细胞活化产生的炎性因子的释放。5.3 CNO和NDC的抗炎和神经保护作用的关键靶点是小胶质的NOX2。来源于NOX2基因敲除的小鼠的神经胶质细胞混合培养体系中,CNO和NDC的抑制炎症因子产生和重塑神经元[3H]多巴胺摄取能力的作用均被阻滞。在HAPI小胶质细胞系的Western blot分析中,CNO和NDC可以有效抑制LPS诱导的p47phox蛋白从胞浆到胞膜的转运。综合结果表明,CNO和NDC可以通过作用于NOX2抑制小胶质细胞的激活。5.4 CNO减弱MPTP诱发的多巴胺能神经元的损伤和运动障碍,且不显示中性粒细胞毒性。MPTP注射诱导的小鼠帕金森病模型中,在第14天时,小鼠出现明显的运动障碍,表现为加速转棒实验潜伏期的缩短43%。同时实验结束,第21天时对多巴胺神元的染色和计数结果表明,多巴胺神经元大约减少50%。但是CNO与氯氮平治疗可以明显改善小鼠的运动障碍和多巴胺能神将元的减少,表现为使转棒潜伏期恢复到85%,多巴胺能神经元的减少降到28%。氯氮平的临床应用因为其中性粒细胞毒性而受到限制,因此在体实验中,我们同时检测氯氮平和CNO是否引起中性粒细胞减少,结果显示与母体化合物氯氮平相比,CNO长达连续21天的治疗对嗜中性粒细胞无任何毒性,表现为全血样品中白细胞的数量没有改变。5.5 CNO抑制MPTP诱导的小胶质细胞反应性激活。在MPTP处理的小鼠,小胶质发生活化,特征表现为胞体肥大、分枝增多,黑质区CDllb染色密度增加。与MPTP单独组相比,氯氮平和CNO治疗可以显着抑制小胶质细胞活化,降低CD11b染色的密度。结论1.在炎性介导的小鼠帕金森病模型中,蓝斑核的去甲肾上腺素能神经元减少相比黑质致密部多巴胺能神经元的减少要早3-4个月。2.蓝斑核去甲肾上腺素耗竭引起大脑中肾上腺素能神经元投射区神经元发生自下而上有序的、渐进性、慢性进行性神经退行性变。3.较早发生的蓝斑核去甲肾上腺素耗竭促使炎性介导的帕金森病小鼠模型中出现帕金森病人中的多种运动和非运动症状的神经行为学改变。4.突触外旁分泌的去甲肾上腺素通过作用于小胶质细胞起到神经免疫调节作用。5.突触外旁分泌的去甲肾上腺素发挥抗炎和神经保护作用时,除传统的G蛋白偶联受体β2-AR外,发现有一个全新的作用靶点,即小胶质细胞的NOX2。6.通过作用于小胶质细胞NOX2抑制其激活,氯氮平代谢产物CNO和NDC可以有效保护多巴胺神经元免受炎症毒性损伤。
成康[10]（2016）在《不同肾上腺肿瘤周围棕色脂肪组织的表达及其意义的研究》文中研究指明目的:本研究的目的在于评估不同肾上腺肿瘤患者的肾上腺周围脂肪中棕色脂肪组织的表达情况,并分析这些棕色脂肪组织的表达和肾上腺肿瘤患者的代谢风险是否具有相关性。方法:一共62例经肾上腺切除术治疗的良性肾上腺瘤患者被纳入本研究。其中包括13例库欣腺瘤,25例原醛腺瘤,15例无功能腺瘤,9例嗜铬细胞瘤患者。通过免疫组化实验和westernblot实验来测定棕色脂肪组织的标志性蛋白UCP1表达量,并以此定量的分析不同肾上腺肿瘤患者肾上腺周围的棕色脂肪组织的表达情况。收集整理患者的人体测量学数据,脂肪分布（内脏脂肪含量,皮下脂肪含量）,生化数据（空腹血糖,血脂等）,肾上腺源激素（24好尿皮质醇,血醛固酮,甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素）。结果:嗜铬细胞瘤组患者的棕色脂肪组织表达量明显高于库兴腺瘤组和无功能腺瘤组（P<0.001和P=0.010）。库兴腺瘤组患者的棕色脂肪组织表达量明显低于原醛腺瘤组患者的（P=0.001）。棕色脂肪组织表达量和患者年龄和性别无相关性。棕色脂肪组织表达量和MNs（甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的数值总和）呈正相关（R=0.286,P=0.031）,而和尿24h皮质醇呈负相关（R=-0.325,P=0.029）。血脂（甘油三酯,低密度脂蛋白,高密度脂蛋白,胆固醇）和棕色脂肪组织的表达量均无相关性。空腹血糖水平和棕色脂肪组织的表达量呈负相关（R=-0.282,P=0.026）。对所有和棕色脂肪组织的表达量具有相关性的因素进行多元分析后发现腹部脂肪（R=-0.422,P=0.004）和肾上腺肿瘤类型（R=0.318,P=0.024）是影响棕色脂肪组织表达的独立影响因素。结论:棕色脂肪组织在不同肾上腺肿瘤患者中的表达量不尽相同。棕色脂肪组织在库兴综合征患者和无功能腺瘤患者体内的表达降低可能其中央型肥胖,糖尿病及其他代谢风险的发生有密切的关系。
二、Muscarinic stimulation rescues β_1-adrenergic response in transgenic mouse heart overexpressing β_2-adrenoceptor（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Muscarinic stimulation rescues β_1-adrenergic response in transgenic mouse heart overexpressing β_2-adrenoceptor（论文提纲范文）
（1）参枝苓口服液对拟SAD小鼠的髓鞘保护作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 综述一 阿尔茨海默病啮齿类动物模型研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 PI3K/Akt-mTOR通路参与髓鞘维护的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一 双侧侧脑室注射STZ拟SAD小鼠模型的AD相关病理变化和髓鞘改变 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1.双侧icv-STZ对拟SAD小鼠模型认知能力影响的时效关系 |
| 2.双侧icv-STZ对拟SAD小鼠造模后4个月Aβ_(42)表达水平的影响 |
| 3.双侧icv-STZ对拟SAD小鼠造模后4个月p-tau蛋白表达水平的影响 |
| 4.双侧icv-STZ对拟SAD小鼠造模后4个月糖代谢相关蛋白的影响 |
| 5.双侧icv-STZ对拟SAD小鼠造模后4个月髓鞘超微结构的影响 |
| 6.双侧icv-STZ对拟SAD小鼠造模后4个月髓鞘相关蛋白的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 参枝苓口服液对拟SAD模型认知能力的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠Morris水迷宫平均潜伏期的影响 |
| 2.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠Morris水迷宫平均游泳距离的影响 |
| 3.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠空间探索和记忆保持能力的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 参枝苓口服液对拟SAD模型髓鞘损伤的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠髓鞘LFB染色的影响 |
| 2.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠髓鞘超微结构的影响 |
| 3.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠g-ratio的影响 |
| 4.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠髓鞘相关糖蛋白(MAG)表达的影响 |
| 5.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠髓鞘碱性蛋白(MBP)表达的影响 |
| 6.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)表达的影响 |
| 7.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠髓鞘蛋白脂质蛋白(PLP)表达的影响 |
| 8.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠MAG、MBP、MOG、PLP mRNA的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 参枝苓口服液对拟SAD模型PI3K/Akt-mTOR通路相关蛋白的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠PI3K表达的影响 |
| 2.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠p-PI3K表达的影响 |
| 3.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠Akt表达的影响 |
| 4.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠p-Akt表达的影响 |
| 5.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠mTOR表达的影响 |
| 6.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠p-mTOR表达的影响 |
| 7.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠p-S6K1表达的影响 |
| 8.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠PI3K mRNA的影响 |
| 9.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠Akt mRNA表达的影响 |
| 10.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠mTOR mRNA表达的影响 |
| 11.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠S6K mRNA表达的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（2）Hippo信号通路在异丙肾上腺素所致心肌损伤中的调控作用研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 异丙肾上腺素通过上调BIM和 Gal-3 表达诱导心肌损伤的作用研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 异丙肾上腺素激活Hippo信号通路的作用研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 异丙肾上腺素通过Hippo信号通路促进BIM和 Gal-3 表达的机制研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 异丙肾上腺素通过cAMP/PKA激活Hippo通路的机制研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Mst1在心肌细胞凋亡中的作用 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（3）周细胞对脓毒症大鼠血管舒缩和屏障功能的协同保护作用及机制（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 周细胞对脓毒症大鼠血管舒缩和屏障功能的协同保护作用及机制 |
| 2.1 材料和实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 白藜芦醇对脓毒症大鼠血管舒张功能的保护作用及机制 |
| 3.1 材料和实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 周细胞在血管相关疾病中的作用及调控研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（4）Epac1参与β1-肾上腺素受体自身抗体诱导的心肌细胞自噬水平下降及受体机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 Epac1 参与β_1-AA诱导的心肌自噬水平降低 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第一部分附图 |
| 第二部分 β_1-AR和β_2-AR参与β_1-AA诱导的心肌细胞Epac1 表达增加 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果 |
| 个人简历 |
（5）Gsα在平滑肌功能障碍疾病中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ血管平滑肌Gsα在腹主动脉瘤小鼠模型中的作用和机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文ⅡGsα在小肠平滑肌收缩功能中的作用和机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的SCI论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
（6）BAG3与MALAT1在心肌生理性肥大和心肌病理性肥大中的不同作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :BAG3在心肌生理性肥大和心肌病理性肥大中的作用及机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 心脏特异性BAG3纯合与杂合鼠的构建 |
| 2.2 小鼠游泳训练 |
| 2.3 小鼠皮下埋泵(持续泵入苯肾上腺素) |
| 2.4 超声心动图 |
| 2.5 苏木素-伊红(H&E)染色 |
| 2.6 Masson染色 |
| 2.7 原代心肌细胞分离、培养及处理 |
| 2.7.1 原代心肌细胞分离与纯化 |
| 2.7.2 原代心肌细胞的接种与培养 |
| 2.7.3 原代心肌细胞处理 |
| 2.8 原代心肌细胞转染 |
| 2.9 细胞核组分与细胞浆组分的分离 |
| 2.10 Western blot |
| 2.10.1 总蛋白提取 |
| 2.10.2 蛋白定量 |
| 2.10.3 蛋白配置及准备 |
| 2.10.4 SDS-PAGE电泳及转膜 |
| 2.10.5 封闭及抗体孵育 |
| 2.10.6 发光 |
| 2.10.7 使用到的抗体 |
| 2.11 免疫荧光 |
| 2.12 数据处理及统计学方法 |
| 2.13 常用试剂配置、使用仪器及耗材清单 |
| 3 结果 |
| 3.1 心肌细胞生理性肥大和病理性肥大的表现 |
| 3.2 小鼠心脏生理性肥大和病理性肥大的表现 |
| 3.3 BAG3的表达在体内和体外的生理性肥大与病理性肥大中上调 |
| 3.4 心脏特异性BAG3纯合与杂合敲除鼠的构建 |
| 3.5 心脏特异性BAG3纯合与杂合敲除鼠的心脏表现特点 |
| 3.6 BAG3可以在体外促进心肌生理性肥大 |
| 3.7 BAG3可以在体内促进心肌生理性肥大 |
| 3.8 BAG3可以在体外抑制心肌病理性肥大 |
| 3.9 BAG3可以在体内抑制心肌病理性肥大 |
| 3.10 BAG3 通过Akt-mTOR通路介导心肌生理性肥大 |
| 3.11 BAG3 通过calcineurin-NFAT通路抑制心肌病理性肥大 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 :MALAT1在心肌生理性肥大和心肌病理性肥大中的作用及机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 细胞培养与处理 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 实时定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.3.1 提取总RNA |
| 2.3.2 RNA浓度及纯度测定 |
| 2.3.3 逆转录 |
| 2.3.4 实时定量PCR |
| 2.4 Western blot |
| 2.4.1 总蛋白提取 |
| 2.4.2 蛋白定量 |
| 2.4.3 蛋白配置及准备 |
| 2.4.4 SDS-PAGE电泳及转膜 |
| 2.4.5 封闭及抗体孵育 |
| 2.4.6 发光 |
| 2.4.7 使用到的抗体 |
| 2.5 荧光素酶报告基因 |
| 2.6 数据处理及统计学方法 |
| 2.7 常用试剂配置 |
| 3 结果 |
| 3.1 MALAT1的表达在生理性肥大和病理性肥大的细胞中升高 |
| 3.2 敲减MALAT1抑制了心肌病理性肥大,而对生理性肥大无明显作用 |
| 3.3 MALAT1与microRNA-26a之间的相互作用 |
| 3.4 敲减MALAT1 通过mi R-26a抑制了GATA4 蛋白的表达 |
| 3.5 MALAT1对PE诱导的心肌病理性肥大的影响是通过mi R-26a介导的 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 本研究的创新性自我评价 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）白细胞介素37对天然CD4+CD25+调节性T细胞免疫抑制活性的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表文章 |
| 英文论文一 |
| 英文论文二 |
| 英文论文三 |
| 附件 |
（8）β1肾上腺素受体和毒蕈碱M2受体介导电针改善急性心肌缺血效应机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 心肌β肾上腺素能受体研究进展 |
| 1. βAR的亚型 |
| 2. βAR信号转导通路 |
| 2.1 β_1-AR信号转导通路 |
| 2.2 β_2-AR信号转导通路 |
| 2.3 β_3-AR信号转导通路 |
| 3. βAR亚型间的相互作用 |
| 4. β-AR信号转导通路的调节机制 |
| 5. β-AR信号转导通路与心脏疾病 |
| 5.1 β-AR与心肌缺血性损伤 |
| 5.2 β-AR与心力衰竭 |
| 6. 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 毒蕈碱M_2受体研究进展 |
| 1. M_2AchR的分子结构 |
| 2. M_2AchR的分布 |
| 3. M_2AchR的生理功能 |
| 4. M_2AchR的信号转导通路 |
| 4.1 M_2AchR激活GIRK通道 |
| 4.2 M_2AchR抑制cAMP依赖性反应 |
| 4.3 NO和cGMP在抑制cAMP依赖性反应中的作用 |
| 4.4 毒蕈碱促进cAMP依赖性反应 |
| 4.5 NO和cGMP在促进cAMP依赖性反应中的作用 |
| 4.6 AC激活的直接调节作用 |
| 5. 总结 |
| 参考文献 |
| 综述三 针刺内关穴治疗心肌缺血的研究进展 |
| 1. 内关治疗冠心病的临床研究进展 |
| 2. 内关改善心肌缺血的机制研究进展 |
| 2.1 影响基因组表达 |
| 2.2 促进血管新生 |
| 2.3 调节血管张力 |
| 2.4 抑制炎症反应 |
| 2.5 抑制细胞凋亡 |
| 2.6 抑制氧化应激 |
| 2.7 抑制血小板聚集 |
| 2.8 对自主神经系统的调控 |
| 3. 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物与分组 |
| 1.2 实验器材及仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.3.1 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 1.3.2 蛋白质印迹法(免疫印迹实验,Western Blot) |
| 1.3.3 心肌细胞钙瞬变检测 |
| 1.3.4 形态学检测 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 心肌缺血动物模型的建立 |
| 2.2 针刺方法 |
| 2.3 小鼠心脏和血清的取材 |
| 2.4 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.4.1 心肌组织中cAMP和cGMP含量的测定 |
| 2.4.2 血清中cTnT含量的检测 |
| 2.5 蛋白质印迹法(Western Blot) |
| 2.5.1 蛋白提取 |
| 2.5.2 蛋白定量:采用BCA法进行蛋白定量 |
| 2.5.3 蛋白浓度调整及蛋白变性 |
| 2.5.4 配制分离胶和浓缩胶 |
| 2.5.5 电泳 |
| 2.5.6 转膜:采用湿转法 |
| 2.5.7 封闭 |
| 2.5.8 一抗孵育 |
| 2.5.9 二抗孵育 |
| 2.5.10 曝光显影 |
| 2.5.11 内参蛋白Western Blot实验 |
| 2.5.12 读取灰度值 |
| 2.6 心肌细胞钙瞬变检测 |
| 2.6.1 溶液配制 |
| 2.6.2 分离小鼠心肌细胞 |
| 2.6.3 复钙 |
| 2.6.4 小鼠心肌细胞负载Fura-2/AM荧光探针 |
| 2.6.5 单个心肌细胞内钙瞬变的检测 |
| 2.7 形态学检测 |
| 2.7.1 组织取材和样品制备 |
| 2.7.2 HE染色 |
| 2.7.3 HBFP染色 |
| 2.7.4 切片图像获取及处理 |
| 2.8 统计学方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 电针内关对心肌缺血的改善效应 |
| 3.1.1 各组C57BL6小鼠心电图的改变 |
| 3.1.2 各组C57BL6小鼠血清cTnT水平的变化 |
| 3.1.3 各组C57BL6小鼠心肌组织切片变化 |
| 3.2 电针内关穴对β_1AR和M_2AChR信号通路的影响 |
| 3.2.1 电针内关穴对β_1AR信号转导通路的影响 |
| 3.2.2 电针内关穴对M_2AChR信号转导通路的影响 |
| 4. 小结 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 动物模型的选择 |
| 5.2 电针内关穴改善心肌缺血的效应 |
| 5.3 β_1-AR和M_2AchR信号通路介导的心肌缺血保护效应机制 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（9）蓝斑核去甲肾上腺素在帕金森病发生发展中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| Abstract in English |
| Abstract in Chinese |
| Abbreviations |
| CHAPTER 1. Introduction |
| 1.1 Overview |
| 1.2 Significance of Parkinson's disease research |
| 1.3 The progressive nature of Parkinson's disease |
| 1.4 Why is Parkinson's disease progressive and incurable? |
| 1.5 Neuroinflammation-mediated rodent Parkinson's disease models |
| 1.6 Development of novel therapeutic strategies of Parkinson's disease |
| 1.7 Hypothesis and Research Aims |
| 1.8 References |
| CHAPTER 2. Sequential,Ascending,Progressive Neuron Loss in Different BrainRegions of Systemic LPS-injected Mice |
| 2.1 Introduction |
| 2.2 Materials and Methods |
| 2.3 Results |
| 2.4 Discussion |
| 2.5 Brief summary |
| 2.6 References |
| CHAPTER 3. Locsu Coeruleus-Norepinephrine Deficiency PotentiatesNeurodegeneration of Adrenergic Neuron-Innervated Brain Regions |
| 3.1 Introduction |
| 3.2 Materials and Methods |
| 3.3 Results |
| 3.4 Discussion |
| 3.5 Brief summary |
| 3.6 References |
| CHAPTER 4. A Modified Motor/Non-Motor Model of Parkinson's Disease |
| 4.1 Introduction |
| 4.2 Materials and Methods |
| 4.3 Results |
| 4.4 Discussion |
| 4.5 Brief summary |
| 4.6 References |
| CHAPTER 5. The Mechanisms Underlying NE Deficiency-Related Neuroinflammationand Neurodegeneration |
| 5.1 Introduction |
| 5.2 Materials and Methods |
| 5.3 Results |
| 5.4 Discussions |
| 5.5 Brief summary |
| 5.6 References |
| CHAPTER 6. Clozapine Metabolites Protect Dopaminergic Neurons through Inhibitionof Microglial NADPH Oxidase |
| 6.1 Introduction |
| 6.2 Materials and Methods |
| 6.3 Results |
| 6.4 Discussion |
| 6.5 Brief Summary |
| 6.6 References |
| CHAPTER 7.Concluding Remarks |
| 7.1 Summary |
| 7.2 Future Perspectives |
| Acknowledgement |
| 攻读学位期间发表的论文及专着 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 论文一 |
| 论文二 |
（10）不同肾上腺肿瘤周围棕色脂肪组织的表达及其意义的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语表 |
| 绪论 |
| 第一部分 不同肾上腺肿瘤周围棕色脂肪组织的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 影响肾上腺肿瘤周围棕色脂肪组织表达的因素分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附录 硕士期间所从事的其他工作 |
| 1 双侧孤立性肾上腺肿瘤引起的库兴综合征的临床诊治分析 |
| 前言 |
| 资料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 2 原醛腺瘤术后即刻高血压危险因素分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
四、Muscarinic stimulation rescues β_1-adrenergic response in transgenic mouse heart overexpressing β_2-adrenoceptor（论文参考文献）
- [1]参枝苓口服液对拟SAD小鼠的髓鞘保护作用机制研究[D]. 王亚晗. 北京中医药大学, 2020(04)
- [2]Hippo信号通路在异丙肾上腺素所致心肌损伤中的调控作用研究[D]. 肇炜博. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [3]周细胞对脓毒症大鼠血管舒缩和屏障功能的协同保护作用及机制[D]. 张紫森. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [4]Epac1参与β1-肾上腺素受体自身抗体诱导的心肌细胞自噬水平下降及受体机制研究[D]. 侯晓鸿. 山西医科大学, 2019(09)
- [5]Gsα在平滑肌功能障碍疾病中的作用和机制研究[D]. 秦小腾. 山东大学, 2019(09)
- [6]BAG3与MALAT1在心肌生理性肥大和心肌病理性肥大中的不同作用及机制研究[D]. 贾鹏宇. 中国医科大学, 2020(01)
- [7]白细胞介素37对天然CD4+CD25+调节性T细胞免疫抑制活性的影响及其机制研究[D]. 王大伟. 山东大学, 2017(03)
- [8]β1肾上腺素受体和毒蕈碱M2受体介导电针改善急性心肌缺血效应机制研究[D]. 石力. 北京中医药大学, 2017(02)
- [9]蓝斑核去甲肾上腺素在帕金森病发生发展中的作用及机制研究[D]. 姜路路. 山东大学, 2016(09)
- [10]不同肾上腺肿瘤周围棕色脂肪组织的表达及其意义的研究[D]. 成康. 上海交通大学, 2016(03)