一、乳蛋白基因及其应用的研究进展（论文文献综述）
梁艳,倪炜,王梦琦,储双凤,杨章平,毛永江[1]（2019）在《智利进口荷斯坦牛β-Lg和β-CN基因多态性及其对泌乳性能的影响》文中认为本研究利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）对江苏某大型奶牛场智利进口荷斯坦牛β-Lg（β-乳球蛋白）和β-CN（β-酪蛋白）基因多态性进行分型,同时收集采样牛只2016～2018年DHI检测结果,利用最小二乘模型分析其多态性及其对泌乳性能的影响。结果表明,在检测群体中β-Lg有A、B两种等位基因,基因频率分别为0.527和0.473,有AA、AB、BB三种基因型,优势基因型为AB型,频率为0.569;β-CN有A、B两种等位基因,其基因频率分别为0.960和0.040,有AA和AB两种基因型,优势基因型为AA型,频率为0.920。方差分析表明,β-Lg对日产奶量、乳蛋白率、体细胞评分（SCS）和尿素氮含量均有极显着影响（P<0.01）;β-CN对乳蛋白率和脂蛋白比有显着影响（P<0.05）,对日产奶量影响极显着（P<0.01）。该结果为利用乳蛋白基因多态性提高智利进口荷斯坦牛泌乳性能提供了参考资料。
赵艳坤[2]（2017）在《脐带间充质干细胞对奶牛乳腺上皮细胞的影响机制研究》文中进行了进一步梳理在无血清共培养条件下,为研究脐带间充质干细胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,UC-MSCs）对奶牛乳腺上皮细胞（Bovine Mammary Gland Epithelial Cells,BMECs）增殖、凋亡、及乳脂、乳蛋白合成的影响,揭示非外源性细胞因子对BMECs泌乳调控的具体作用机制。本试验分为三个部分:第一部分,以UC-MSCs和BMECs为研究对象,纯化扩增选取生长状态最佳的P（Passage,P）5代UC-MSCs和P8代BMECs,将2种细胞以直接和间接接触两种共培养方式作为试验组,直接接触是按照UC-MSCs:BMECs分别为2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10的浓度梯度混合共培养,间接接触则是提取UC-MSCs的上清液作为条件培养基重悬BMECs,对照组为UC-MSCs和BMECs单培养组,于0、4、8、12、24、36、48、60、72 h时观察各组细胞的生长变化,采用细胞增殖与活性检测试剂盒CCK-8法检测各组细胞增殖情况,并结合细胞形态学观察筛选出UC-MSCs和BMECs最佳共培养条件。第二部分,以最佳共培养比例和时间为基准,建立UC-MSCs和BMECs（1:2）共培养试验组,对比单独培养的UC-MSCs和BMECs,48 h后,ELISA法检测各组上清中IGF-I分泌情况;利用Transwell?小室将UC-MSCs和BMECs上下双层共培养,于不同时间点提取各组RNA,实时荧光定量PCR检测细胞中IGF-ⅠR、IGF-ⅠmRNA的表达。第三部分,在Transwell?小室共培养验证IGF-I最佳分泌条件的基础上,以BMECs单纯培养为对照,分别采用IGF-ⅠR抑制剂AG1024、JAK2信号特异性阻断剂AG490和PI-3K信号特异性阻断剂LY294002处理细胞,观察处理前后各组细胞生长情况,采用Annexin V-FITC/PI双参数法和流式细胞仪检测细胞凋亡,测定上清中IGF-Ⅰ和CSN2、CSN3、TG含量变化,RT-qPCR检测细胞信号通路相关基因PI-3K、AKT、mTOR、JAK2、STAT5、ELF5的表达丰度,细胞凋亡基因Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA相对定量值,及乳脂、乳蛋白合成关键基因ACACA、FASN、SREBP1及CSN2、CSN3 mRNA相对表达丰度。结果:第一部分,优化了UC-MSCs和BMECs最适共培养条件,结果显示,48 h,条件培养基BMECs组光密度（Optical density,OD）值显着高于对照组（P<0.05）,而1:2浓度组极显着高于对照组（P<0.01）,显着高于其他各组（P<0.05）;第二部分,Transwell?小室明确了UC-MSCs和BMECs之间的相互作用,结果显示,48 h,两种共培养方案IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR mRNA表达值显着或极显着高于单培养组（P<0.05,P<0.01）,共培养组IGF-Ⅰ浓度显着高于UC-MSCs组（P<0.05）,极显着高于BMECs组（P<0.01）,BMECs/UC-MSCs组显着高于UC-MSCs/BMECs组（P<0.05）;第三部分,证实了UC-MSCs对BMECs凋亡、乳脂乳蛋白的影响及可能作用途径,结果显示,试验组的凋亡率极显着低于其他各组（P<0.01）,试验组较对照组Bcl-2 mRNA表达丰度极显着上调（P<0.01）、Caspase-3、Bax mRNA表达显着下调（P<0.05）,AG1024、LY294002和AG490处理后,上调了各组细胞凋亡率和Bax、Caspase-3 mRNA表达丰度,下调了Bcl-2 mRNA表达丰度,均具有统计学意义;乳脂、乳蛋白合成的结果显示,试验组各项指标均显着或极显着高于对照组（P<0.05,P<0.01）,AG1024处理对IGF-Ⅰ具有极显着抑制效果（P<0.01）,显着和极显着降低TG、CSN2、CSN3含量及各基因相对表达丰度（P<0.05,P<0.01）,AG490处理显着降低CSN2、CSN3 mRNA相对表达丰度（P<0.05）,但对ACACA、FASN、SREBP1 mRNA的表达无显着影响（P>0.05）,LY294002处理抑制了PI-3K（P<0.01）、AKT、mTOR（P<0.05）mRNA的表达,显着降低了TG、CSN2、CSN3含量及各基因表达（P<0.05）,AG1024和AG490共同处理时乳脂合成关键基因表达变化较AG1024单独处理差异不显着（P>0.05）,AG1024和LY294002共同处理显着下调了CSN2、CSN3 mRNA的表达（P<0.05）,极显着降低了其他各指标（P<0.01）。综上所述,本研究建立了UC-MSCs和BMECs最适共培养条件,且利用Transwell?小室明确了UC-MSCs和BMECs之间的作用,发现UC-MSCs对BMECs中IGF-Ⅰ及其受体相应基因的表达起促进作用,IGF-I参与UC-MSCs对BMECs凋亡、乳脂及乳蛋白合成的调节作用,PI-3K/AKT/mTOR和JAK2/STAT5信号通路是IGF-I调控BMECs凋亡、泌乳功能的共同通路,但JAK2/STAT5信号通路不参与UC-MSCs对BMECs乳脂合成的调控,因此可以说UC-MSCs通过IGF-I介导PI-3K/AKT/mTOR和JAK2/STAT5信号通路协同抑制BMECs凋亡,提高其存活率,从而促进BMECs乳脂、乳蛋白合成,进而调控BMECs泌乳性能,不仅弥补了BMECs自身IGF-I分泌不足的缺陷,也为进一步探究内源性IGF-Ⅰ对BMECs生物学功能的调节作用奠定理论基础。
周文君[3]（2017）在《利用CRISPR/Cas9技术敲除山羊BLG基因与定点整合hLF基因的研究》文中指出山羊乳含有丰富的营养成分,是一种潜在的人乳替代品。但是,山羊乳中不但含有人过敏原β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,BLG）,而且其乳铁蛋白含量远低于人乳。人乳铁蛋白（human lactoferrin,hLF）是一种多功能糖蛋白,具有促进铁吸收、抗菌、抗病毒、抗癌和抗氧化等多种生物学功能,是一种十分理想的食品添加剂和药物。近年来,研究者使用体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer,SCNT）等转基因技术生产了一批转人乳铁蛋白家畜,但由于之前的方法存在着技术难度大、成本高、周期长和后代发育异常、存活率低等问题,未能被推广至产业化生产中。CRISPR/Cas9技术作为近几年最热门的基因编辑技术之一,可以高效地精确编辑动植物基因组,是生产转基因动物的理想方法。目前,研究者利用CRISPR/Cas9技术已经获得了基因敲除或敲入的兔、猪、绵羊、山羊和牛个体,但至今尚未有利用CRISPR/Cas9技术获得BLG敲除和hLF定点整合山羊的报道。鉴于此,本试验以山羊为研究对象,首先,建立CRISPR/Cas9介导的山羊BLG基因打靶系统;其次,在细胞水平上利用CRISPR/Cas9技术成功地在山羊BLG位点敲入hLF基因,并且比较了不同浓度RS-1对敲入效率的影响;然后,探究了显微注射CRISPR/Cas9系统获得BLG基因敲除山羊和hLF敲入山羊的可行性;最后,分析了BLG基因敲除对泌乳期山羊乳蛋白基因表达与乳汁中BLG蛋白表达情况的影响。主要研究结果如下:1.CRISPR/Cas9介导的山羊BLG基因打靶系统的建立本试验为了探究CRISPR/Cas9系统能否有效编辑山羊耳成纤维细胞BLG基因座,以及比较不同转染方法下Cas9编辑效率的差异。本试验针对山羊BLG基因第一外显子设计了 3条sgRNA,构建了 3个打靶BLG基因的Cas9-sgRNA表达载体:pCas9-sg1、pCas9-sg2和pCas9-sg3。然后,将3个Cas9-sgRNA表达载体分别转染至山羊耳成纤维细胞（GEFs）,72 h后收集细胞提取DNA,PCR扩增打靶区域,使用T7EN1法分析打靶效率,使用桑格尔测序法鉴定打靶区域的突变情况;PCR扩增打靶位点5’端和3’端约1500 bp基因组片段作为同源臂,连接至T载体构建成pβHA-1载体,以pBHA-1为骨架载体插入hLF基因和NEO-IRES-EGFP片段构建了BLG打靶载体pBHA-hLF-NIE;分别使用脂质体法和电转染法将pBHA-hLF-NIE打靶载体转染至GEFs,72h后收集细胞,用流式细胞仪进行转染效率分析。测序结果表明sgRNA引导序列成功插入Cas9-sgRNA表达骨架质粒（pX330）,且pBHA-hLF-NIE打靶质粒构建成功。流式细胞仪分析结果表明电转染方法的效率显着高于脂质体转染方法（15.97%± 1.56 vs 2.38%± 0.10,P<0.05）。T7EN1分析结果发现使用脂质体转染组打靶区域的编辑效率低于检测水平,而电转染组打靶区域编辑效率为6.00%～10.0%;桑格尔测序结果表明脂质体转染组中GEFs打靶区域无突变,而电转染组中GEFs打靶区域突变克隆率为8.00%～12.5%。以上结果表明:（1）CRISPR/Cas9系统可以有效地编辑山羊BLG基因座;（2）pBHA-hLF-NIE载体在GEFs中可以成功表达EGFP蛋白,表明其标记基因成功表达,该质粒可以应用于下游的敲入实验;（3）电转染法较之脂质体转染法有更高的转染效率,在接下来的细胞实验中可以采用电转染法来提高总体的打靶效率。2.利用CRISPR/Cas9在山羊BLG位点敲入hLF基因及敲入效率的优化本试验旨在利用CRISPR/Cas9系统敲除山羊基因组中BLG基因,并在该位点敲入hLF基因,同时探讨不同浓度RS-1对同源重组效率的影响。本试验首先将pCas9-sg 1表达载体和打靶载体pBHA-hLF-NIE共转染至GEFs,分别用0、5、10和20 μMRS-1处理细胞72 h,传4代后进行流式计数统计绿色荧光细胞比例;同时将不同浓度RS-1处理后的GEFs用800 μg/mLG418进行筛选,挑取EGFPP阳性单克隆,然后通过PCR和测序鉴定hLF定点敲入的单克隆。试验结果发现:细胞在经过RS-1处理72 h后,贴壁细胞数减少,20 μMRS-1处理组最为明显;在无药物筛选的敲入实验中,敲入效率与浓度呈正相关;在G418筛选出单克隆的试验中,RS-1浓度0-10 μM时,敲入阳性率随着RS-1浓度增加而升高,在10 μM时敲入阳性率最高,为32.61%,然而在20μM时敲入阳性率下降至22.22%,且衰老的单克隆增多。本试验利用CRISPR/Cas9系统顺利获得BLG敲除和hLF敲入的GEFs,且结果表明合适浓度的RS-1可以显着提升定点整合阳性克隆率。3.CRISPR/Cas9介导的BLG基因敲除山羊和hLF敲入山羊生产可行性研究为了更简便快捷地获得BLG敲除奶山羊,本试验将Cas9 mRNA和sgRNA注入山羊单细胞胚胎中,然后移植到同步的受体中,从而获得基因编辑后代。提取新生羔羊基因组DNA,然后通过PCR、T7EN1分析和桑格尔测序法来鉴定后代基因型;为了获得转hLF基因的奶山羊,本试验将Cas9mRNA、sgRNA和同源重组模板质粒三者的混合物注射至单细胞奶山羊胚胎,然后一部分胚胎留存进行成熟培养,培养5-6d后,扩增全基因组DNA,然后使用PCR法进行基因型鉴定,另一部分胚胎移植至同期的受体中,怀孕、分娩得到后代,使用PCR法进行基因型鉴定;PCR扩增预测的脱靶位点,使用T7E1法进行脱靶分析;PCR扩增成功打靶个体各器官组织基因组打靶区域并使用T7EN1法分析其编辑情况。结果表明,单sgRNA打靶效率为6.66%;低浓度双sgRNA打靶效率为25.00%,高浓度双sgRNA打靶效率为28.60%;胚胎和后代个体中,hLF基因敲入效率为0%;此外,所有预测的脱靶位点均无编辑现象;BLG基因编辑成功个体各器官、组织均被匀质地编辑,但其中大部分个体为嵌合体。以上结果表明,通过显微注射Cas9 mRNA和sgRNA至山羊单细胞胚胎可以有效获得BLG基因敲除奶山羊,提高Cas9mRNA和sgRNA浓度可以明显升编辑效率,但是可能会导致嵌合现象,所有BLG编辑后代均未发现脱靶现象。本试验为通过CRISPR/Cas9介导的一步法获得基因编辑家畜奠定了研究基础,同时为进一步研究BLG蛋白敲除山羊表型变化提供了研究模型。4.BLG基因敲除对泌乳期山羊BLG蛋白和其它乳蛋白基因表达影响的研究本试验旨在分析BLG基因敲除对泌乳期山羊乳蛋白基因、乳汁中BLG蛋白表达及乳品质与野生型山羊的差异。首先,通过人工注射激素催乳,收集泌乳期BLG基因敲除山羊和野生型山羊乳样和乳腺组织,提取乳腺组织DNA和mRNA。然后,PCR扩增sgRNA基因组打靶位点片段以及对应的cDNA片段,连接T载体测序;使用乳品自动分析仪分析BLG敲除奶山羊与野生型奶山羊乳品质差异;使用qRT-PCR分析乳腺组织中各乳蛋白基因表达;使用SDS-PAGE电泳分离乳清蛋白,接着结合考马斯亮蓝染色法和Western Blot分析乳清蛋白变化与BLG蛋白的表达差异。。qRT-PCR结果表明乳腺中BLG基因表达极显着（P<0.01）下降,其余乳蛋白基因CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3和LALBA均显着（P<0.05）降低;考马斯亮蓝染色结果表明BLG双等位基因敲除奶山羊乳清蛋白中BLG蛋白条带消失;Western Blot检测表明BLG双等位基因敲除奶山羊乳清中无BLG蛋白表达。本试验成功分析了 BLG基因敲除对泌乳期奶山羊乳品质、乳汁中BLG蛋白表达以及乳腺中乳蛋白基因表达差异,证实BLG基因的双等位敲除可以有效去除奶山羊乳汁中的BLG蛋白,为日后在实际生产中获得无BLG蛋白“人源化”山羊乳奠定了研究基础。
李聪[4]（2016）在《中国荷斯坦牛乳成分性状候选基因的鉴定及其遗传效应分析》文中研究指明挖掘与鉴定影响奶牛乳成分性状的关键基因或致因突变是实施奶牛低脂高蛋白新品系分子培育的前提与基础。本研究旨在利用基因组学、转录组学、生物信息学、统计遗传学等技术,鉴定影响奶牛乳成分性状（乳脂肪酸和乳蛋白）的候选基因及SNPs,进而对其进行大群体遗传效应分析,以确定真正的致因基因或是遗传效应较大的基因。利用全基因组关联分析（GWAS）鉴定牛乳脂肪酸含量候选基因。以北京地区18个牛场的21头公牛家系的784头中国荷斯坦母牛为研究群体,以Illumina BovineSNP50芯片为基因型,气相色谱法获得22个脂肪酸性状的含量为表型,采用PLINK软件进行GWAS。分析共发现84个全基因组显着水平SNPs和314个潜在显着SNPs同18个脂肪酸性状关联,主要位于BTA5、10、14、17和26上；一些显着SNPs位于或距离很近同已知影响乳成分性状的DGAT1、FASN、 SCD等18个功能基因；结合乳成分QTL区域及基因功能注释,提出了20个新的候选基因：HTR1B、 CPM、 PRKG1、 MINPP1、 LIPJ、LIPK、EHHADH, MOGAT1、 ECHS1、 STAT1、 SORBS1、 NFKB2、 AGPAT3、CHUK、OSBPL8、PRLR、IGF1R、ACSL3、GHR和OXCT1,影响C10:0、C12:0、C14:0、C14：1、C14指数、C18:0、C18:1n9c、C18指数、SFA、UFA和SFA/UFA。利用转录组测序（RNA-Seq）鉴定牛乳蛋白性状候选基因。以2个泌乳期（泌乳高峰期和干奶期）下6头高乳蛋白率和6头低乳蛋白率的中国荷斯坦牛活体取样的乳腺组织为研究对象进行RNA-Seq,在牛已注释的27,544个基因中,约有20,000个基因在乳腺组织广泛表达。结果分别鉴定到高峰期下高低蛋白组、干奶期下高低蛋白组、泌乳期比较组差异表达基因157、497和5,488个。整合分析确定了10个影响乳蛋白性状的已知候选基因：WAP、NARS、MARS、GARS、CDO1、 GATM、INSR、IGF1R、IGFBP3 和CRIM1;并提出10个新的候选基因：SERPINA1、CLU、CNTFR、 ERBB2、NEDD4L、ANG、GALE、HSPA8、LPAR6和CD14。针对以上鉴定到的乳成分性状候选基因,挑选5个影响乳脂肪酸含量的候选基因SCD、FASN、 PPARGC1A、 ABCG2和IGF1于13个牛场的13个公牛家系的346头中国荷斯坦母牛群体中进行遗传效应分析。结果验证了功能基因FASN、SCD及PPARGC1A对牛乳脂肪酸含量的效应导致了其临近SNPs在GWAS中的显着；揭示了SCD主要影响中长链不饱和脂肪酸,特别是C14：1和C14指数性状；FASN、PPARGC1A、ABCG2和IGFl主要影响中链饱和脂肪酸和长链不饱和脂肪酸。挑选4个影响乳蛋白性状的候选基因于17个牛场的17个公牛家系的1,027头中国荷斯坦母牛群体中开展遗传效应分析,从基因组水平验证了4个候选基因SERPINA1、GALE、HSPA8和ERBB2对奶牛乳蛋白性状的显着遗传效应。本研究进一步明确并缩小了影响乳成分性状的基因组区域,为后续基因精细定位揭示致因基因或突变提供了基础；提出的影响乳脂肪酸和乳蛋白性状的已知和新的候选基因,为深入阐明乳脂乳蛋白合成代谢调控机制提供了基础,为后续开展分子标记辅助选择等育种措施培育低脂高蛋白奶牛新品系提供了基因来源和原动力。
米热瓦古力·买买提[5]（2014）在《奶牛产奶性状有关基因的探索》文中指出产奶性状是奶牛生产中的重要数量经济性状,由微效多基因所决定。介绍了影响奶牛产奶性状的几个候选基因,如:α-酪蛋白基因,嗜乳蛋白基因、脂酰辅酶A甘油二脂酰基转移酶、垂体转录因子,骨桥蛋白基因,催乳素基因和催乳素受体基因等在奶牛生产中的研究和应用进展。
胡菡[6]（2014）在《奶牛乳腺上皮细胞的永生化及其鉴定》文中研究指明奶牛乳腺上皮细胞是唯一的乳腺分泌型细胞,其数量和活力决定了乳的产量和品质。体外培养的奶牛乳腺上皮细胞组成单一,脱离了在体复杂环境的干扰,是研究乳腺发育和泌乳机制、乳腺生物反应器的有效细胞模型。目前,还没有国际公认的永生化奶牛乳腺上皮细胞系,因此,建立稳定有效的奶牛乳腺上皮细胞系这项研究工作一直在延续。本研究中,奶牛乳腺上皮细胞的永生化及鉴定工作分为4部分：1.原代奶牛乳腺上皮细胞的永生化。在以往的研究中,作者已建立一套原代奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系。在本研究中,以此原代细胞培养体系为基础,采用携带SV40大T抗原基因的逆转录病毒感染原代奶牛乳腺上皮细胞,获得4株永生化的奶牛乳腺上皮细胞系。经过传代培养,最终得到一株传代超过50代的永生化奶牛乳腺上皮细胞系,命名为CMEC-H;2.永生化细胞的生物学鉴定。对永生化的奶牛乳腺上皮细胞系CMEC-H进行端粒酶活性检测,20代的CMEC-H的端粒酶活性水平与293细胞水平一致,说明SV40大T抗原基因的插入使原代奶牛乳腺上皮细胞成功永生化；永生化的CMEC-H保持了原代细胞的形态特征,呈鹅卵石样；细胞增殖速率加快,细胞倍增时间约为36h,且不同代数细胞之间没有显着差异；CMEC-H细胞染色体数目增加为100条,远多于正常原代细胞的60条30对,这是由于基因插入后所导致遗传信息的改变；CMEC-H不会使裸鼠致瘤,说明永生化的细胞未癌变；3.永生化细胞特征性蛋白表达检测。采用细胞免疫化学检测特征性蛋白的原位表达以鉴定细胞的类型。人乳腺癌细胞MCF-7作为对照,表现为上皮特征性角蛋白CK7.CK8.CK18和CK19表达阳性,分化间质细胞特征性蛋白α-SMA阳性和间质细胞特征性蛋白Vimentin阴性表达,这一结果与前人研究报道一致；永生化的CMEC-H表现为上皮细胞特征性蛋白CK7、CK8和CK18以及Vimentin阳性表达,但α-SMA抗体阴性；同时,永生化使得干细胞标志性蛋白p63和CD44的强阳性表达；在正常培养条件下,永生化的CMEC-H具有上皮干／祖细胞特征,CMEC-H具有强的增殖能力,并且能够被诱导分化；4.永生化细胞的诱导分化。泌乳激素能够诱导永生化奶牛乳腺上皮细胞CMEC-H的诱导分化。采用qRT-PCR检测乳蛋白合成基因和脂肪酸合成相关基因的表达,结果显示,与原代细胞相比,αS1-酪蛋白（CSN1S1）、αs2-酪蛋白（CSN1S2）、和β-酪蛋白（CSN2）在永生化细胞CMEC-H不同代数中的转录水平尽管有变化,但差异不显着；但K-酪蛋白（CSN3）在CMEC-H中的表达显着上调；嗜乳脂蛋白（BTN1A1）、乙酰辅酶A羧化酶（ACACA）和脂肪酸合成酶（FASN）基因表达显着下调,过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）基因的表达显着上调；但定量PCR产物进行琼脂糖电泳结果显示,各样品之间没有明显差异。采用Western-Blotting技术检测了原代细胞,永生化第5、20和50代细胞的乳蛋白合成。以β-Actin为内参,结果显示4个样品都能检测到αS1-酪蛋白、β-酪蛋白、K-酪蛋白和嗜乳脂蛋白的合成,且原代细胞和永生化细胞的乳蛋白合成能力没有明显差异。基因和蛋白检测结果表明,奶牛乳腺上皮细胞经过永生化后,在细胞泌乳功能方面,一些关键基因的表达发生了变化,但对乳蛋白的合成没有影响,CMEC-H能够作为细胞模型用于乳腺生理机制的研究。总之,本研究中建立的永生化奶牛乳腺上皮细胞系CMEC-H具有自身更新能力,并且能够被诱导分化,是研究乳腺生理机制研究的理想模型。
王秀美[7]（2013）在《二、三维培养模式对奶牛乳腺上皮细胞泌乳代谢相关基因的影响》文中研究指明本文主要进行了奶牛乳腺上皮细胞（BMEC）三维培养体系的建立，在此基础上通过不同的试验条件下（全营养因素处理、单一氨基酸处理、催乳素处理）比较二、三维养模式对奶牛乳腺上皮细胞泌乳代谢相关基因的影响。同时利用优化的培养模式进行支链氨基酸和催乳素影响乳蛋白基因转录的的研究。通过以上研究，为BMEC三维培养体系的建立和支链氨基酸、催乳素调控BMEC乳蛋白基因转录提供一定的理论基础。试验结果如下：1、BMEC在Matrigel基质胶中可以快速的形成类腺泡结构，而在鼠尾胶中则形成散落的聚集物。且在培养的过程中Matrigel基质胶比鼠尾胶稳定。三维模式下培养时间和接种密度影响BMEC中αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白的基因表达量。三维模式下BMEC在培养的第5d形成了完全成熟的腺泡，三维模式下BMEC的适合接种密度为1x106个/mL。2、在相同的营养物质及激素水平下，三维培养的BMEC三种乳蛋白的基因表达量显着高于二维培养（P＜0.05），三维培养的BMEC通过western blot的方法能够检测到β-酪蛋白，二维培养的BMEC检测不到β-酪蛋白。三维培养的BMEC在形态上呈现的特点与BMEC在体内所呈现的组织学特征更加接近。二维培养模式下添加催乳素BMEC的αs1-酪蛋白和κ酪蛋白基因的表达量显着高于未添加催乳素组（对照组）（P＜0.05），添加催乳素BMEC的α-乳清蛋白的表达量显着低于对照组（P＜0.05），添加催乳素BMEC的β-酪蛋白基因的表达量和对照组间无显着差异（P＞0.05）。三维培养模式下，添加催乳素BMEC的αs1-酪蛋白和κ酪蛋白基因的表达量和对照组间无显着差异（P＞0.05），添加催乳素BMEC的β-酪蛋白，α-乳清蛋白的表达量显着高于对照组（P＜0.05）。3、在三维培养模式下，添加leu、ile、val使奶牛乳腺上皮细胞αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋、mTOR、S6K1、4E-BP1、eIF4E基因的表达量显着高于对照组（P＜0.05）。本试验表明，在奶牛泌乳代谢的研究中，BMEC的三维培养技术优于二维培养。
王锦[8]（2013）在《水牛乳腺基因表达谱与生长激素转基因水牛的初步研究》文中进行了进一步梳理水牛是中国南方极具开发潜力的主要家畜,具有耐粗饲、乳品品质好等优点。但由于我国本地水牛产奶性能低下,致使奶水牛产业的发展缓慢。因此,如何应用现代生物技术培育出高产奶量的水牛新品种是目前要解决的主要问题。本研究首先分析了水牛泌乳期和非泌乳期乳腺组织基因表达谱,寻找差异表达基因,研究水牛的泌乳机制,并为培育高产奶量的转基因水牛提供丰富的候选基因素材；然后,探索转座子系统在水牛转基因中的应用,以期提高水牛转基因的效率；构建了乳腺特异性生长激素基因（GH）转基因表达载体,在乳腺细胞和乳腺组织中进行检测,分析外源GH基因的表达对乳蛋白等基因表达的影响；最后,采用随机整合、转座子主动整合等转基因技术将重组GH基因导入水牛基因组,生产GH转基因的水牛胚胎,以期培育出高产奶量转基因水牛新品种。本研究取得的主要结果总结如下：1.水牛泌乳期与非泌乳期基因表达谱及差异表达分析。构建水牛泌乳期和非泌乳期乳腺组织基因表达谱,分析差异表达和泌乳期高丰度表达的基因,探讨水牛泌乳的分子机制,也为转基因水牛提供外源基因乳腺泌乳期特异性表达启动子。基因表达谱序列拼接后获得114,014个单一的Unigenes,与牛的基因组信息比对注释了30290个基因,可以定位到270条相应的通路上（pathway）,其中与乳脂肪、乳蛋白和乳糖合成代谢通路相关基因表达丰度较高。在泌乳期乳腺组织中特异性表达的基因有3053个,占到所有基因序列的2.68%。比较水牛乳腺两个时期基因表达量,泌乳期表达量上调的基因有1390个,下调的基因有5851个。在270条KEGG通路中有228个通路涉及到差异表达基因,如介导生长激素作用的JAK-STAT和MAPK信号通路。实时定量PCR （QRT-PCR）检测到水牛的非泌乳期乳腺组织中有少量的乳蛋白基因表达。K酪蛋白（CN3）基因表达量在非泌乳期与泌乳期乳腺中都是显着高于其它基因。与非泌乳期相比,泌乳期乳腺CN1S1基因表达量增加了6958倍,CN1S2增加了4800倍,kCN和αLA增加了1000倍左右,而β酪蛋白增加了244倍,与测序结果基本一致。泌乳期和非泌乳期的乳腺组织中检测至（?）GHR, PRLR（?）（?）GF1R的表达,说明GH、PRL（?）（?）IGF1可能参与了泌乳的分子调控过程。2.水牛乳腺上皮细胞（BME）基因表达分析。通过PB转座子携带的LT抗原永生化诱导水牛乳腺上皮细胞（BME）,建立检测乳腺转基因表达载体的细胞模型。PB转座子为骨架的永生化载体pXL-BACII-bCN2/LT转染后的BME细胞的腺泡消失速度和成纤维样转变降低。在添加催乳素诱导培养后,第30代的永生化处理的BME细胞能检测到乳蛋白基因的表达。其中CN1S1基因表达量为非泌乳期乳腺的88.32倍,CN3为32.09倍,CN1S2和αLA基因表达量分别为2.8倍和3.3倍。结果表明,初步建立了细胞水平检测乳腺特异性表达载体的体外模型。3.水牛转座子转基因技术方法的建立。本研究通过构建piggyBac （PB）, passport （PP）和sleeping beauty （SB）转座子转基因载体,转染水牛胎儿成纤维细胞（BFF）,同时对转座子转基因系统进行优化,以期建立水牛转座子转基因技术体系。转座子转基因载体转染水牛的胎儿成纤维细胞（BFF）后,均能观察到标记基因EGFP的表达。应用p18T载体、PB、PP和SB转座子表达NEO基因,转染细胞后筛选获得的G418抗性细胞克隆形成数（CFN）差异不显着。与随机整合相比,加入相应的转座酶后,PB转座子系统抗性细胞克隆数量提高了22倍,PP转座子系统提高了8倍,SB转座子提高了14倍,PB转座子系统获得了最高的转基因效率。PB转座子在转座子和转座酶比例（Tn:Ts）为1：l的时候转基因效率最高,而PP和SB转座子为1：0.5。当添加的转座酶质粒过量时,PB转座子的转基因效率下降幅度没有PP和SB转座子大。通过QRT-PCR检测了不同转座子外源基因的整合拷贝数,结果显示：随机整合组每个单倍体基因组整合拷贝数从5个拷贝至51.9个拷贝不等。PB转座子为16.62拷贝,PP转座子为2.5拷贝。SB转座子整合到基因组中的转基因拷贝数最多,单倍体基因组中为98个拷贝。以上结果显示：三种转座子均能应用于水牛的转基因研究,转基因效率优于随机整合转基因。4.生长激素转基因载体构建与细胞水平检测。克隆分析了人、奶牛和水牛的生长激素基因（GH）,PB转座子携带的GH转基因载体转染乳腺细胞和乳腺组织块,研究GH转基因的表达对其乳蛋白等基因表达的影响。结果显示牛、水牛和牦牛之间GH基因的同源性最高,与其它偶蹄目也有较高的同源性,生长激素氨基酸序列也较为保守。将分别携带有人和奶牛GH的piggyBac转座子转基因载体（pXL-BacⅡ-bCN2.8/hGH2.1-EGFP-Neo, PXL-BacⅡ-bCN2.8/hGH2.2-EGFP-Neo）转染人的乳腺癌细胞系（Bcap37）,能观察至（?）EGFP的表达,RT-PCR和western blot均能检测到人和奶牛GH基因的特异性表达。分别用P18T-bGH和PB-bGH转基因载体转染永生化BME细胞后,检测到bGH转基因的表达。p酪蛋白、CN1S1酪蛋白和α乳清白蛋白基因表达量均有显着提高,GHR和IGF1R基因的表达量也有上调。pB-bGH载体转染的水牛乳腺组织块,CN1S1, CN1S2,p酪蛋白和K酪蛋白基因的表达量提高了50倍以上,初步证明GH转基因载体的转染可以显着提高乳蛋白基因的表达水平。5.转GH基因水牛克隆胚胎的生产与早产转基因克隆水牛的检测。使用受精卵胞质注射、卵胞质内单精子注射（ICSI）和转基因体细胞核移植的方法生产转GH基因的水牛胚胎,并对经胚胎移植后的获得的早产转基因克隆水牛进行了鉴定。水牛受精卵胞质注射和水牛卵母细胞内单精子注射（ICSI） PB转座子GH转基因载体和转座酶载体后,均获得EGFP表达的转基因阳性胚胎。以转GH基因BFF为核供体,制备了EGFP表达的转基因克隆水牛囊胚。经胚胎移植后获得了转GH基因克隆水牛的妊娠,于9月龄早产。特定蓝光照射下在早产水牛头侧部能观察到绿色荧光表达,解剖结果显示心、肺、肝、胃和脾发育正常,但大肠,肾脏,生殖系统等发育不良,而且有严重的组织粘连。激光共聚焦显微镜下观察到心、肝、脾、肺、膈肌和肌肉等组织冰冻切片均有较强的EGFP表达。通过PCR检测和染色体步移法检测到早产克隆水牛的各组织中均有外源基因的整合。这些工作为获得乳腺特异性表达GH基因转基因水牛奠定了较好的工作基础。
季昀[9]（2013）在《GH和IGF-I对奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白合成的调节作用机制》文中进行了进一步梳理本研究以奶牛乳腺上皮细胞为材料,采用乳腺上皮细胞体外分离培养技术、细胞分子生物学相关技术,研究了生长激素（GH）和胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）对乳酪蛋白合成、乳蛋白合成调节关键激酶和调节因子基因表达以及细胞增殖与凋亡的影响。试验一、体外分离培养了奶牛乳腺上皮细胞并鉴定其是否表达生长激素受体（GHR）和胰岛素样生长因子-Ⅰ受体（IGF-IR）。从泌乳荷斯坦奶牛活体采集乳腺组织,利用胶原酶消化分离培养奶牛乳腺上皮细胞,通过形态学、特异性蛋白（角蛋白-18）表达、特异性基因（CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3）表达鉴定纯化后的奶牛乳腺上皮细胞。免疫荧光化学法鉴定角蛋白-18的表达,RT-PCR法鉴定四种酪蛋白基因CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3以及两种受体基因GHR、IGF-IR的表达。结果发现,分离纯化后的乳腺上皮细胞呈典型的铺路鹅卵石样,能够特异性表达角蛋白-18和四种酪蛋白基因,同时检测到了GHR和IGF-IR的表达,细胞冻存再复苏后有较高的成活率。结果表明,本研究成功分离并获取了高纯度的奶牛乳腺上皮细胞且冻存后能够用于后续的试验,GH可能通过直接或间接通过IGF-Ⅰ作用于奶牛乳腺上皮细胞上相应的受体来发挥作用。试验二、测定了GH和IGF-Ⅰ对奶牛乳腺上皮细胞K-酪蛋白基因表达与蛋白合成的影响。对照组为无血清生长培养基,处理组在对照组的基础上添加GH （100ng/mL）、IGF-I （100ng/mL）或GH （100ng/mL）+IGF-I （100ng/mL）,细胞培养24h后,采用实时荧光定量PCR （RT-qPCR）法测定K-酪蛋白基因（CSN3）的相对表达量,ELISA法测定K-酪蛋白合成量。结果发现,GH和IGF-Ⅰ单独或联合添加到无血清生长培养基中均能显着提高CSN3基因表达量（P<0.05）,蛋白水平的测定结果与基因表达有类似的趋势,但与对照组差异不显着（P>0.05）,此外,无论是在基因表达水平还是蛋白水平都没有观察到GH和IGF-Ⅰ的累积效应。结果表明,添加100ng/mL的GH或IGF-Ⅰ处理乳腺上皮细胞24h对κ-酪蛋白的合成有一定促进作用。试验三、测定了GH和IGF-Ⅰ对参与乳蛋白合成调节过程中的关键激酶和调节因子的基因表达的影响。试验处理方式同试验二,采用实时荧光定量PCR （RT-qPCR）法测定Janus激酶2（JAK2）、信号转导子与转录激活子5（STAT5）、E74-样转录因子5（ELF5）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR核糖体蛋白S6激酶1（rpS6K1）、真核生物起始因子4E结合蛋白1（4EBP1）、真核生物起始因子4E（eIF4E）、真核生物延伸因子2（eEF2）基因的相对表达量,进一步利用Western blot法在蛋白水平测定了mTOR的表达量。结果发现,与对照组相比,单独添加GH有提高ELF5基因mRNA表达量的趋势（P<0.1）,而单独添加IGF-Ⅰ显着促进了rpS6K1mRNA以及mTOR的表达量（P<0.05）,但GH没有进一步加强IGF-Ⅰ的这种作用。结果表明,GH和IGF-I可能单独通过影响调控乳蛋白合成的关键激酶及调节因子的基因表达来调节K-酪蛋白的合成。试验四、测定了GH和IGF-Ⅰ对奶牛乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响。细胞处理方式同试验二,采用CCK-8法测定4-96h内奶牛乳腺上皮细胞的增殖情况,用FITC-AnnexinV/PI双染法检测24h内细胞凋亡率,同时用RT-qPCR法测定了IGFBP-5基因的相对表达量。结果发现,补充GH没有促进乳腺细胞的增殖（P>0.05）,而补充IGF-I在4～6h有显着促进增殖的效果（P<0.05）,同时补充GH和IGF-Ⅰ在4-96h内都显着促进了乳腺上皮细胞的增殖（P<0.05）且与IGF-I组差异不显着（P>0.05）。补充GH和IGF-I显着减少了凋亡晚期的细胞数（P<0.01）和总凋亡数（P<0.05）,联合添加GH和IGF-I显着降低了凋亡晚期和总凋亡细胞数（P<0.01）,其机理可能与GH和IGF-I抑制IGFBP5的表达量有关。结果表明,GH和IGF-I可通过促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖、抑制奶牛乳腺上皮细胞的凋亡来调节乳腺上皮细胞数量和活性,进而促进泌乳。
赖淑静,齐瑞利,袁陶燕,何俊,吴兵兵,傅衍,牛冬[10]（2013）在《奶牛酪蛋白和β-乳球蛋白基因多态及其对泌乳性状的影响》文中研究指明牛乳蛋白主要包括酪蛋白和乳清蛋白,其中酪蛋白基因和β-乳球蛋白基因是对奶牛产奶性能有较大影响的两种基因。牛乳蛋白基因多态性与泌乳性状,如泌乳量、乳脂率、乳蛋白量及乳蛋白率有很强的相关性。本文主要对酪蛋白和β-乳球蛋白基
二、乳蛋白基因及其应用的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乳蛋白基因及其应用的研究进展（论文提纲范文）
（1）智利进口荷斯坦牛β-Lg和β-CN基因多态性及其对泌乳性能的影响（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 乳样采集及乳蛋白的分离 |
| 1.2 样品处理 |
| 1.3 数据收集与整理 |
| 1.4 统计分析 |
| 1.4.1. 群体遗传分析 |
| 1.4.2. 最小二乘模型 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 β-Lg和β-CN基因频率、基因型频率及遗传变异分析 |
| 2.2 β-Lg和β-CN多态性对智利进口荷斯坦牛泌乳性能的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（2）脐带间充质干细胞对奶牛乳腺上皮细胞的影响机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 脐带间充质干细胞的生物学特性 |
| 1.2 间充质干细胞共培养的研究进展 |
| 1.3 奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型的研究进展 |
| 1.4 乳蛋白合成关键基因 |
| 1.5 乳脂合成的关键基因 |
| 1.6 泌乳调控主要信号通路 |
| 1.7 胰岛素样生长因子对乳腺发育及泌乳调控的研究进展 |
| 1.8 研究目的、意义及内容 |
| 1.9 试验技术路线 |
| 第2章 无血清条件下脐带间充质干细胞与乳腺上皮细胞最适共培养条件筛选 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 无血清条件下UC-MSCs和 BMECs共培养对IGF-Ⅰ表达的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 与UC-MSCs共培养对BMECs凋亡的影响及作用机制 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 与UC-MSCs共培养对BMECs乳脂、乳蛋白合成的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 UC-MSCs对 BMECs乳脂、乳蛋白合成的调控作用机制 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 全文结论 |
| 第8章 特色与创新点 |
| 第9章 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）利用CRISPR/Cas9技术敲除山羊BLG基因与定点整合hLF基因的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(Abbreviation) |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 CRISPR/Cas9技术在家畜基因修饰中的研究进展 |
| 1 CRISPR/Cas9技术简介 |
| 2 Cas9蛋白结构与技术原理 |
| 2.1 CRISPR/Cas9系统的结构 |
| 2.2 CRISPR/Cas9技术的技术原理 |
| 3 CRISPR/Cas9技术在家畜基因编辑中的应用 |
| 3.1 CRISPR/Cas9技术在家畜生产性能基因编辑中的应用 |
| 3.2 CRISPR/Cas9技术在家畜抗病育种中的应用 |
| 3.3 CRISPR/Cas9技术在家畜疾病模型生产中的应用 |
| 3.4 CRISPR/Cas9技术在家畜乳品质改进中的应用 |
| 参考文献 |
| 第二章 乳铁蛋白生物学特性及家畜乳腺表达hLF的研究进展 |
| 1 分布与含量 |
| 2 结构与特性 |
| 3 生物学功能 |
| 3.1 促进铁元素的吸收 |
| 3.2 抗菌活性 |
| 3.3 抗病毒作用 |
| 3.4 抗氧化作用 |
| 3.5 免疫调节作用 |
| 3.6 抗肿瘤作用 |
| 4 转基因家畜乳腺表达重组人乳铁蛋白研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第三章 不同转染方法对CRISPR/Cas9介导的山羊BLG基因编辑效率的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要溶液的配制 |
| 1.5 试验方法 |
| 1.6 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 sgRNA的设计及Cas9-sgRNA打靶质粒构建 |
| 2.2 BLG打靶载体pBHA-hLF-NIE的构建及其鉴定 |
| 2.3 不同转染方法在山羊成纤维细胞中转染效率的影响 |
| 2.4 不同转染方法对CRISPR/Cas9介导的BLG基因编辑效率的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 RS-1对CRISPR/Cas9介导的山羊BLG位点敲入hLF效率的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要溶液的配制 |
| 1.5 试验方法 |
| 1.6 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同浓度RS-1对CRISPR/Cas9介导的同源重组效率的影响 |
| 2.2 不同浓度RS-1对CRISPR/Cas9介导的hLF敲入阳性克隆率的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 CRISPR/Cas9介导的BLG基因敲除和hLF基因敲入山羊的生产与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要溶液的配制 |
| 1.5 试验方法 |
| 1.6 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Cas9 mRNA和sgRNA体外转录与回收 |
| 2.2 山羊单细胞胚胎显微注射和后代基因型鉴定结果 |
| 2.3 打靶阳性个体突变类型分析 |
| 2.4 打靶阳性个体脱靶分析 |
| 2.5 打靶个体各器官编辑情况 |
| 3 讨论 |
| 3.1 CRISPR/Cas9系统介导的基因敲除山羊生产效率比较 |
| 3.2 CRISPR/Cas9系统介导的基因敲入山羊生产效率比较 |
| 3.3 CRISPR/Cas9脱靶活性分析 |
| 3.4 BLG基因成功编辑个体嵌合分析 |
| 参考文献 |
| 第六章 BLG基因敲除对泌乳期山羊乳品质及乳蛋白基因表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要溶液的配制 |
| 1.5 试验方法 |
| 1.6 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 BLG基因敲除山羊乳腺基因型及BLG cDNA序列的测定 |
| 2.2 BLG基因敲除对山羊乳品质的影响 |
| 2.3 BLG基因敲除对泌乳期山羊乳蛋白基因表达的影响 |
| 2.4 BLG基因敲除对山羊乳清蛋白表达的影响 |
| 2.5 BLG基因敲除对山羊乳汁中BLG蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（4）中国荷斯坦牛乳成分性状候选基因的鉴定及其遗传效应分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 奶牛分子育种 |
| 1.1.1 标记辅助选择育种 |
| 1.1.2 基因组选择 |
| 1.1.3 转基因育种 |
| 1.2 奶牛重要经济性状候选基因的鉴定 |
| 1.2.1 标记-QTL连锁分析 |
| 1.2.2 候选基因关联分析 |
| 1.2.3 全基因组关联分析 |
| 1.2.4 转录组测序 |
| 1.3 奶牛乳成分性状候选基因研究进展 |
| 1.3.1 奶牛乳脂肪酸性状候选基因 |
| 1.3.2 奶牛乳蛋白性状候选基因 |
| 1.4 本研究目的意义和主要内容 |
| 第二章 利用全基因组关联分析鉴定中国荷斯坦牛乳脂肪酸含量性状候选基因 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 资源群体的构建 |
| 2.1.2 乳样和血样的采集 |
| 2.1.3 脂肪酸含量的测定 |
| 2.1.4 主要试剂和溶液配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 牛基因组DNA提取及基因型数据 |
| 2.1.7 基因型数据的质量控制 |
| 2.1.8 统计分析 |
| 2.1.9 关联分析结果的显着性检验 |
| 2.1.10 基因功能注释及候选基因的确定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 脂肪酸表型的描述性统计量 |
| 2.2.2 基因型质量控制结果 |
| 2.2.3 固定效应分析结果 |
| 2.2.4 关联分析结果 |
| 2.2.5 影响牛乳脂肪酸含量性状的候选基因 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 牛乳脂肪酸表型及固定效应对其的影响 |
| 2.3.2 全基因组关联分析 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 利用转录组测序鉴定中国荷斯坦牛乳蛋白性状及泌乳相关候选基因 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验动物及试验设计 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 乳腺组织活体采集 |
| 3.2.2 乳腺组织RNA提取及质量控制 |
| 3.2.3 cDNA文库制备 |
| 3.2.4 cDNA文库转录组测序 |
| 3.3 RNA-Seq数据处理及生物信息学分析 |
| 3.3.1 RNA-Seq原始数据质控 |
| 3.3.2 测序Reads比对 |
| 3.3.3 转录本表达水平确定及标准化 |
| 3.3.4 差异表达转录本筛选 |
| 3.3.5 差异表达基因qRT-PCR验证 |
| 3.3.6 差异表达基因的GO和KEGG富集分析 |
| 3.3.7 候选基因的确定 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 RNA提取与质量检测 |
| 3.4.2 RNA-Seq原始测序数据质控 |
| 3.4.3 样本重复相关性检查 |
| 3.4.4 参考序列比对结果 |
| 3.4.5 差异表达基因筛选 |
| 3.4.6 差异表达基因qRT-PCR验证 |
| 3.4.7 GO与KEGG分析 |
| 3.4.8 影响乳蛋白性状及泌乳相关的候选基因 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 乳腺组织活体取样 |
| 3.5.2 不同泌乳阶段下乳腺组织基因表达规律 |
| 3.5.3 新的乳蛋白候选基因的提出 |
| 3.5.4 干奶期下高低蛋白比较组和两个泌乳时期差异比较组 |
| 3.5.5 GO和Pathway |
| 3.5.6 其它 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 候选基因与乳成分性状的遗传效应分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 性状表型记录 |
| 4.1.3 主要试剂和溶液配制 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 牛凝血DNA提取 |
| 4.2.2 公牛冻精DNA提取 |
| 4.2.3 候选基因多态性检测 |
| 4.2.4 MALDI-TOF-MS技术进行SNP基因分型 |
| 4.2.5 数据统计分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 血样及冻精基因组DNA提取结果 |
| 4.3.2 SNP的检测 |
| 4.3.3 SNP的分型 |
| 4.3.4 Hardy-Weinberg检测结果 |
| 4.3.5 候选基因对乳成分性状的遗传效应 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 SCD基因 |
| 4.4.2 FASN、PPARGC1A、ABCG2和IGF1基因 |
| 4.4.3 SERPINA1、GALE、HSPA8和ERBB2基因 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附表 |
| 个人简介 |
（5）奶牛产奶性状有关基因的探索（论文提纲范文）
| 1 α-酪蛋白基因 |
| 2 嗜乳蛋白基因 |
| 3 脂酰辅酶A甘油二脂酰基转移酶 |
| 4 垂体转录因子 |
| 5 骨桥蛋白基因 |
| 6 催乳素基因 |
| 7 催乳素受体基因 |
| 8 结论 |
（6）奶牛乳腺上皮细胞的永生化及其鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 奶牛乳腺上皮细胞体外培养及其应用研究进展 |
| 1.1 奶牛乳腺上皮细胞是重要的乳腺分泌型细胞 |
| 1.1.1 奶牛乳腺上皮细胞是重要的乳腺分泌细胞 |
| 1.1.2 奶牛乳腺上皮细胞体外培养 |
| 1.2 乳腺干细胞 |
| 1.3 细胞永生化 |
| 1.3.1 细胞永生化及端粒酶 |
| 1.3.2 SV40-large T antigene |
| 1.3.3 逆转录病毒 |
| 1.4 永生化奶牛乳腺上皮细胞系的应用及展望 |
| 1.4.1 奶牛乳腺上皮细胞模型在乳蛋白合成机制研究领域的应用 |
| 1.4.2 永生化奶牛乳腺上皮细胞模型应用展望 |
| 第二章 永生化奶牛乳腺上皮细胞系的建立 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1. 主要试剂和耗材 |
| 2.2. 方法 |
| 2.2.1 质粒的转化 |
| 2.2.2 原代细胞的培养 |
| 2.2.3 逆转录病毒包装 |
| 2.2.4 病毒感染效率的检测 |
| 2.2.5 乳腺上皮细胞的感染 |
| 2.2.6 单克隆细胞株的获得及持续培养 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 质粒的转化 |
| 2.3.2 原代细胞的准备 |
| 2.3.3 逆转录病毒制备及病毒滴度检测 |
| 2.3.4 乳腺上皮细胞的感染及单克隆细胞株的获得 |
| 2.3.5 永生化细胞的传代和培养 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 永生化奶牛乳腺上皮细胞系的生物学鉴定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1. 主要试剂和耗材 |
| 3.1.2. 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 永生化细胞的生物学形态 |
| 3.2.2 端粒酶表达在永生化细胞中的表达 |
| 3.2.3 永生化细胞生长特性 |
| 3.2.4 永生化细胞的核型分析 |
| 3.2.5 永生化细胞裸鼠致瘤检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 永生化奶牛乳腺上皮细胞系的特征性蛋白表达 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1. 主要试剂和耗材 |
| 4.1.2.方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 上皮细胞特征性蛋白检测 |
| 4.2.2 纤维细胞特征性蛋白检测 |
| 4.2.3 干细胞特征性蛋白检测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 永生化奶牛乳腺上皮细胞系的诱导分化 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1. 主要试剂和耗材 |
| 5.1.2. 方法 |
| 5.1.3. 数据分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 乳蛋白基因及合成调控基因的表达 |
| 5.2.2 乳蛋白合成检测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）二、三维培养模式对奶牛乳腺上皮细胞泌乳代谢相关基因的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 动物细胞培养的发展历史 |
| 1.1.1 器官培养的发展和存在的局限性 |
| 1.1.2 动物细胞二维培养的发展 |
| 1.1.3 动物细胞二维培养的特点 |
| 1.1.4 动物细胞二维培养主要的局限性 |
| 1.2 动物细胞的三维培养 |
| 1.2.1 动物细胞三维培养的定义 |
| 1.2.2 动物细胞三维培养的发展 |
| 1.2.3 动物细胞三维培养的种类 |
| 1.2.4 动物细胞三维培养的优点 |
| 1.2.5 动物细胞三维培养的局限性 |
| 1.2.6 动物细胞三维培养的应用 |
| 1.3 奶牛乳腺上皮细胞的二维培养 |
| 1.3.1 奶牛乳腺上皮细胞的二维培养的历史 |
| 1.3.2 奶牛乳腺上皮细胞系的建立 |
| 1.3.3 奶牛乳腺上皮细胞二维培养的发展现状 |
| 1.4 奶牛乳腺上皮细胞三维培养 |
| 1.4.1 奶牛乳腺上皮细胞三维培养的凝胶技术 |
| 1.4.2 奶牛乳腺上皮细胞三维培养凝胶 |
| 1.4.3 乳腺上皮细胞三维培养模式下细胞在凝胶中的接种方式 |
| 1.4.4 奶牛乳腺在体内的发育及体外三维培养条件奶牛乳腺上皮细胞的发育 |
| 1.4.5 三维培养模式下凝胶诱导细胞分化的原理 |
| 1.4.6 三维培养模式下细胞激素信号调控的实现 |
| 1.4.7 奶牛乳腺上皮细胞三维培养的发展现状 |
| 1.5 支链氨基酸调控奶牛泌乳研究的现状 |
| 1.6 本研究的目的、意义及主要研究内容 |
| 1.7 本研究的技术路线 |
| 2 试验研究 |
| 2.1 奶牛乳腺上皮细胞三维培养体系的建立 |
| 2.1.1 鼠尾胶和 Matrigel 胶对奶牛乳腺上皮细胞形态形成的影响 |
| 2.1.2 三维模式下培养时间对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白基因表达的影响 |
| 2.1.3 三维模式下接种密度对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白基因表达的影响 |
| 2.2 二、三维培养模式下奶牛乳腺上皮细胞泌乳代谢相关功能的比较 |
| 2.2.1 二、三维培养对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白基因表达和蛋白合成的影响 |
| 2.2.2 二维和三维培养模式下添加亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白基因表达影响的比较研究 |
| 2.2.3 二、三维培养模式下添加催乳素（prl）对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白基因及激素相关受体基因表达影响的研究 |
| 3 总体讨论与结论 |
| 3.1 总体讨论 |
| 3.1.1 基质胶原、奶牛乳腺上皮细胞的接种密度、培养时间对奶牛乳腺上皮细胞类腺泡形态结构的形成及酪蛋白基因转录水平的影响 |
| 3.1.2 Leu、Ile、Val 及催乳素对奶牛乳腺上皮细胞泌乳代谢相关基因转录水平的影响 |
| 3.2 总体结论 |
| 3.3 本研究的创新点 |
| 3.4 进一步研究的问题 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（8）水牛乳腺基因表达谱与生长激素转基因水牛的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 缩略词(Abbreviations) |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 乳腺发育与生长激素转基因动物 |
| 1 乳腺发育机理 |
| 2 血液中的乳蛋白成份 |
| 3 生长激素 |
| 3.1 概况 |
| 3.2 牛生长激素 |
| 4 外源注射BST促进产奶量 |
| 4.1 BST处理安全性 |
| 4.2 BST处理效果 |
| 4.3 BST注射促进泌乳的机制 |
| 5 生长激素转基因动物研究进展 |
| 6 乳腺特异性表达生长激素 |
| 7 生长激素转基因的影响 |
| 7.1 对内源性生长激素的影响 |
| 7.2 对生长性状的影响 |
| 8 生长激素转基因动物存在的问题与展望 |
| 第二章 转座子转基因动物研究进展 |
| 1 转座子概述 |
| 2 主动整合与转座子转基因 |
| 3 PB转座子(PIGGYBAC TRANSPOSON) |
| 4 SB转座子(SLEEPING BEAUTYTRANSPOSON) |
| 5 PP转座子(PASSPORT TRANSPOSON) |
| 研究的目的与意义 |
| 第二部分 实验内容 |
| 第三章 水牛乳腺基因表达谱分析与乳腺细胞永生化 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 水牛乳腺组织基因表达谱构建 |
| 2.2 基因表达谱中差异表达基因 |
| 2.3 水牛泌乳期与非泌乳期期基因表达 |
| 2.4 水牛乳腺上皮细胞(BME)及永生化 |
| 2.5 永生化BME细胞,泌乳期与非泌乳期乳腺组织基因表达对比 |
| 3 讨论 |
| 3.1 乳腺基因表达谱分析 |
| 3.2 乳蛋白基因表达 |
| 3.3 泌乳相关基因表达 |
| 3.4 水牛乳腺上皮细胞的永生化 |
| 4 小结 |
| 第四章 水牛转座子转基因的初步研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 药品与试剂 |
| 1.2 转基因载体 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转基因BFF细胞荧光观察与neo整合检测 |
| 2.2 外源基因整合位点检测 |
| 2.3 随机整合与转座子转基因效率比较 |
| 2.4 转座子转基因系统的优化 |
| 2.5 转座子转基因拷贝数检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 随机整合与主动整合转基因效率 |
| 3.2 转座子转基因体系优化 |
| 3.3 转基因整合拷贝数 |
| 4 小结 |
| 第五章 生长激素转基因水牛的初步研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 人、奶牛、水牛GH基因 |
| 2.2 GH转基因在Bcap37乳腺细胞中的表达 |
| 2.3 GH转基因对BME乳腺细胞基因表达的影响 |
| 2.4 转GH基因水牛胚胎发育观察及早产转基因克隆水牛的鉴定 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 生长激素基因及转基因表达 |
| 3.2 生长激素转基因对乳腺细胞和乳腺组织的影响 |
| 3.3 GH转基因牛 |
| 4 小结 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 附录 (APPENDIX) |
| 附录1：水牛生长激素基因编码区序列GENBANK提交(JF894306) |
| 附表1：水牛乳腺泌乳期与非泌乳期乳腺差异表达基因-KEGG归类 |
| 附表2：泌乳期表达量上调的基因列表(部分) |
| 附表3：泌乳期表达量下调的基因列表(部分) |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（9）GH和IGF-I对奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白合成的调节作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 GH和IGF-Ⅰ概述 |
| 1.1 GH和IGF-Ⅰ对奶牛的作用研究进展 |
| 1.2 GH和IGF-Ⅰ对奶牛体组织代谢调控作用的研究进展 |
| 1.3 GH和IGF-Ⅰ对动物乳腺组织调控作用研究进展 |
| 2 奶牛乳腺内乳蛋白合成及其调控的研究进展 |
| 2.1 奶牛乳蛋白的组成 |
| 2.2 奶牛乳蛋白的合成过程 |
| 2.3 乳蛋白合成调控的分子机理 |
| 3 营养物质和内分泌对乳蛋白合成的调节 |
| 3.1 营养物质对乳蛋白合成的调节 |
| 3.2 激素和生长因子对乳蛋白合成的调控 |
| 4 研究目的、意义和内容 |
| 4.1 研究目的、意义和技术路线 |
| 4.2 研究内容 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 奶牛乳腺上皮细胞的培养鉴定及GHR和IGF-IR的表达鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 GH和IGF-Ⅰ对奶牛乳腺上皮细胞κ-酪蛋白基因表达及蛋白合成的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 GH和IGF-Ⅰ对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成调控关键信号通路关键基因表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 GH和IGF-Ⅰ对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文讨论与结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（10）奶牛酪蛋白和β-乳球蛋白基因多态及其对泌乳性状的影响（论文提纲范文）
| 1 牛乳蛋白的主要功能 |
| 2 乳蛋白基因的分子结构 |
| 3 酪蛋白基因单倍型对奶牛泌乳性状的影响 |
| 4 BLG基因型对奶牛泌乳性状的影响 |
四、乳蛋白基因及其应用的研究进展（论文参考文献）
- [1]智利进口荷斯坦牛β-Lg和β-CN基因多态性及其对泌乳性能的影响[J]. 梁艳,倪炜,王梦琦,储双凤,杨章平,毛永江. 中国奶牛, 2019(02)
- [2]脐带间充质干细胞对奶牛乳腺上皮细胞的影响机制研究[D]. 赵艳坤. 新疆农业大学, 2017
- [3]利用CRISPR/Cas9技术敲除山羊BLG基因与定点整合hLF基因的研究[D]. 周文君. 南京农业大学, 2017(07)
- [4]中国荷斯坦牛乳成分性状候选基因的鉴定及其遗传效应分析[D]. 李聪. 中国农业大学, 2016(08)
- [5]奶牛产奶性状有关基因的探索[J]. 米热瓦古力·买买提. 新疆畜牧业, 2014(09)
- [6]奶牛乳腺上皮细胞的永生化及其鉴定[D]. 胡菡. 中国农业科学院, 2014(01)
- [7]二、三维培养模式对奶牛乳腺上皮细胞泌乳代谢相关基因的影响[D]. 王秀美. 内蒙古农业大学, 2013(10)
- [8]水牛乳腺基因表达谱与生长激素转基因水牛的初步研究[D]. 王锦. 广西大学, 2013(02)
- [9]GH和IGF-I对奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白合成的调节作用机制[D]. 季昀. 扬州大学, 2013(04)
- [10]奶牛酪蛋白和β-乳球蛋白基因多态及其对泌乳性状的影响[J]. 赖淑静,齐瑞利,袁陶燕,何俊,吴兵兵,傅衍,牛冬. 浙江畜牧兽医, 2013(01)