一、Calcium-releasing activity induced by nuclei of mouse fertilized early embryos（论文文献综述）
廖静[1]（2021）在《Piezo1介导特发性肺动脉高压患者来源的肺动脉平滑肌细胞增殖的机制研究》文中指出【研究背景】肺动脉高压是一组肺血管阻力进行性升高并导致右心功能不全,运动受限,最终发展为死亡的心肺疾病。肺小动脉的异常收缩和肺动脉重塑是肺动脉高压发病过程中肺血管阻力增加的关键驱动因素,其中重要的机制是肺动脉平滑肌细胞（Pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs）内钙离子(Calcium,Ca2+)稳态失衡。目前研究者认为促进PASMCs中胞浆游离Ca2+浓度(Intracellular free calcium concentration,[Ca2+]i)升高主要通过以下两种种途径实现:a)细胞内Ca2+库上Ca2+通道介导的Ca2+释放;b)细胞膜Ca2+通道介导的细胞外Ca2+内流。最近的研究报道了压电式机械敏感离子通道组件1（Piezo Type Mechanosensitive Ion Channel Component 1,Piezo1）可通过改变细胞内Ca2+动态平衡来响应机械刺激,这一过程对调节血管张力起着至关重要的作用。但是,Piezo1在肺血管中的具体作用尚不完全清楚。【研究目的】研究在正常生理和肺动脉高压疾病状态下,Piezo1是否以及如何通过参与细胞内Ca2+调节机制来介导PASMCs收缩及增殖表型。【研究方法】1.我们把健康对照和特发性肺动脉高压（Idiopathic pulmonary arterial hypertension,IPAH）患者中分离培养的PASMCs作为细胞模型;2.通过基于Fura2的细胞内Ca2+成像技术测量细胞内游离Ca2+浓度(Intracellular free calcium concentration,[Ca2+]i);3.利用免疫荧光共定位技术评估Piezo1的亚细胞定位;4.利用细胞实时成像技术、离体血管条张力实验,研究Piezo1对PASMCs收缩的影响;5.利用EdU和（或）CCK8检测细胞增殖方法,研究Piezo1对PASMCs增殖的影响。【研究结果】1.Piezo1激活可通过两种途径介导PASMCs中[Ca2+]i升高:（1）定位于胞内亚细胞器（包括肌浆网/内质网、线粒体和核膜）的Piezo1（Intra-Piezo1）可介导独立于三磷酸肌醇受体（IP3R）和雷诺丁受体（Ry Rs）调控的胞内Ca2+释放,继而触发细胞膜钙池操纵性钙内流(Store-operated Ca2+entry,SOCE);（2）细胞膜定位的Piezo1（PM-Piezo1）可介导独立于电压依赖性钙通道（L type Voltage-dependent calcium channel,L-VDCC）、钙池操纵性钙通道(Store-operated Ca2+channels,SOCC)和小凹蛋白（Caveolin-1）介导的胞外Ca2+内流;2.Piezo1介导的[Ca2+]i的增加与PASMC的收缩和增殖增加有关;3.Yoda1可诱导大鼠去内皮肺内动脉剂量依赖性血管收缩;4.相对于健康对照,Piezo1在IPAH患者来源的PASMCs中表达与活性均显着增加,并参与介导IPAH-PASMCs中异常的[Ca2+]i的增加和细胞过度增殖。【结论】Piezo1通过触发细胞内Ca2+释放和细胞外Ca2+内流来介导胞浆[Ca2+]i的增加。Piezo1的上调和活化至少部分地解释了IPAH-PASMCs中[Ca2+]i异常增加并诱导细胞收缩和过度增殖。
阳一栋[2]（2019）在《内质网-线粒体相关膜在低氧诱导的平滑肌细胞增殖和内皮细胞损伤中的作用及机制研究》文中认为研究背景:低氧性肺动脉高压表现为持久的肺血管收缩及显着的肺血管重构,引起肺动脉压力明显增加,最终导致致命性的右心衰竭。以血管平滑肌细胞增殖及内皮细胞损伤为核心的细胞增殖/凋亡失衡是血管重构的关键因素。持续的低氧暴露可促进平滑肌细胞增殖,促进血管重构。血管内的平滑肌细胞同时也受其他细胞调控,内皮细胞位于血管壁的内层,调节平滑肌细胞增殖、血小板黏附和聚集、内源性舒张物质分泌等。低氧可诱导内皮细胞凋亡,激活NF-κB途经介导的黏附分子及促炎细胞因子表达,招募炎性细胞浸润。同时,舒张血管物质生成减少,收缩性物质分泌增多,进一步加重血管重构。线粒体不仅作为能量工厂,更是细胞内各种信号汇集传导的中转站,广泛参与细胞自噬,炎症应答,增殖/凋亡等生物进程。低氧时内皮细胞与平滑肌细胞均存在线粒体结构和功能的异常改变。低氧可促进平滑肌细胞糖酵解,抑制线粒体的有氧氧化。线粒体钙水平降低是抑制线粒体有氧氧化的主要因素之一,包括丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、酮戊二酸脱氢酶和ATP合酶等线粒体呼吸相关酶的活性依赖Ca2+的参与。因此,线粒体钙的减少可抑制氧化呼吸,并伴随线粒体氧自由基的失衡。而线粒体功能异常可激活下游增殖信号通路如HIF-1α,NFATc及Kv1.5的下调,从而促进细胞增殖。在血管重构的另一关键细胞中,低氧可诱导内皮线粒体嵴断裂,肿胀,也可激活线粒体自噬,损伤线粒体生物合成,从而激活NF-κB途径介导的炎性分子表达并抑制NO生成,促进收缩性因子的分泌。内质网-线粒体相关膜（Mitochondria-associated Endoplasmic Reticulum membranes/mitochondria-associated membranes,MAMs）是内质网与线粒体膜之间接触的区域,广泛参与线粒体功能调节。MAMs通过位于内质网膜和线粒体外膜蛋白之间的连接作用促进膜的接触。IP3Rs/GRP75/VDAC1是内质网-线粒体蛋白连接子之一,介导内质网-线粒体钙转移,影响线粒体功能。同时,IP3Rs可被MAMs界面分子伴侣蛋白结合或激酶Akt磷酸化,影响钙的释放。因此,内质网-线粒体钙转移受MAMs形成及IP3Rs/Grp75/VDAC1钙转移轴相关修饰信号的共同调节。除调控胞内钙转移信号外,众多生物进程中的核心蛋白表达于MAMs界面,使得MAMs广泛参与脂类代谢,自噬,线粒体分裂,免疫应答,凋亡和内质网应激等。一系列研究表明,肝脏及脑组织蛋白组学检测发现MAMs界面表达上千种蛋白和数十种激酶及磷酸酶,病理条件下,此界面蛋白表达、修饰化水平及蛋白通路等发生显着转变,参与疾病的发生与发展。最近报道,沉默Nogo-B的表达可增强低氧时MAMs的形成,介导内质网-线粒体钙转移,促进平滑肌细胞凋亡,改善低氧性肺动脉高压表型。Nogo-B受体（Nogo-B receptor,NgBR）在先天性肺动脉高压模型中表达降低,通过ROS的生成介导平滑肌细胞增殖,其相关机制有待进一步明确。同时,低氧时内皮细胞MAMs的改变及其作用尚不清楚。因此,本研究拟以血管重构的关键靶点内皮细胞和平滑肌细胞为研究对象,探讨低氧时MAMs形成和界面蛋白通路的转变及其作用,明确介导MAMs改变的调控机制,以加深对低氧诱导平滑肌细胞增殖和内皮细胞损伤的理解。方法:1.建立低氧诱导的平滑肌细胞增殖模型,通过MAMs组成蛋白WB及电镜检测明确低氧时MAMs的形成改变。构建内质网-线粒体连接子转染平滑肌细胞,促进MAMs形成,通过线粒体呼吸、增殖/凋亡等蛋白检测探讨其对低氧时平滑肌细胞增殖/凋亡的影响。2.获取足够的平滑肌细胞MAMs界面蛋白,通过蛋白组学检测分析低氧时MAMs蛋白组学改变表征及其在内质网-线粒体钙转移中的作用。3.探讨Nogo-B/NgBR对平滑肌细胞MAMs形成和内质网-线粒体钙转移通路的调控作用。利用低氧性肺动脉高压自然逆转和体外低氧-复氧模型检测平滑肌细胞Nogo-B及NgBR表达。过表达和抑表达Nogo-B或NgBR后,WB检测MAMs组成蛋白及内质网-线粒体钙转移pAkt-IP3R3通路。通过氧耗率测定,激光共聚焦,WB等检测线粒体钙,线粒体呼吸,线粒体膜电位及线粒体氧自由基等线粒体功能指标和细胞增殖水平。4.建立低氧诱导的内皮细胞损伤模型,通过MAMs组成蛋白WB检测、内质网-线粒体标志蛋白IF检测明确低氧时内皮细胞MAMs的形成改变。下调MAMs组成蛋白PACS-2,IP3R1表达以抑制MAMs形成,探讨其对低氧诱导内皮细胞损伤的保护作用。检测线粒体钙,线粒体呼吸,线粒体膜电位及氧自由基等线粒体功能指标,检测流式细胞,PARP,PCNA及上清LDH酶活性等凋亡指标,检测炎性分子蛋白及mRNA表达,并检测eNOS-NO通路。结果:1.WB提示低氧时平滑肌细胞增殖相关蛋白PCNA表达增加,而凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达降低。同时,IF显示Edu标记的阳性细胞百分比增加。低氧时MAMs组成蛋白表达降低,电镜显示内质网与线粒体膜之间的最短距离增加,反映MAMs的形成受到破坏。构建内质网-线粒体连接子转染平滑肌细胞后,线粒体呼吸增强,低氧时pAMPKα,PCNA增加,剪切型PARP比值减少。2.GO分析提示,低氧时MAMs界面差异蛋白主要定位于内质网,具有结合及催化活性,参与信号处理,生物学调控,刺激应答及蛋白定位等生物进程。富集分析发现差异蛋白主要与酰胺合成,抑制细胞分化有关。KEGG通路富集分析表明低氧时内质网蛋白处理加工及鞘脂类代谢通路显着激活。Nogo-B表达于MAMs界面,且在低氧时增加。3.IF提示低氧诱导的血管重构中平滑肌Nogo-B蛋白表达增加,NgBR降低,随着复氧后结构改建的自然逆转Nogo-B表达降低,NgBR增加。体外平滑肌细胞低氧时,Nogo-B在全细胞匀浆水平中表达未改变,WB及免疫沉淀作用结果表明低氧时MAMs界面Nogo-B表达增加。而NgBR在体外低氧的平滑肌细胞中表达降低。过表达Nogo-B或抑表达NgBR能抑制MAMs形成,表现为MAMs组成蛋白表达下调或内质网-线粒体标记荧光共区域指数降低,电镜发现内质网膜与线粒体外膜之间的最短距离增加。同时,WB提示MAMs内质网-线粒体钙转移通路pAkt-IP3R3激活。Rhod-2 am检测发现线粒体钙水平降低,而耗氧率测定表明线粒体呼吸受到抑制。同时,IF提示线粒体膜电位增加,线粒体氧自由基减少,HIF-1α入核的阳性细胞百分比增加。MTT,PCNA、Cyclin D1蛋白或Edu标记阳性百分比检测表明过表达Nogo-B或抑表达NgBR能在常氧条件下促进平滑肌细胞增殖。抑表达Nogo-B或过表达NgBR能逆转上述效应,抑制低氧诱导的平滑肌细胞增殖。4.WB及IF提示低氧时HPAEC及HUVEC MAMs组成蛋白表达增加,内质网-线粒体标记荧光共区域指数增加。利用siRNA下调MAMs组成蛋白PACS-2或IP3R1以抑制MAMs形成。干预MAMs后,IF提示低氧时线粒体钙信号降低,线粒体膜电位值增加,ROS减少。氧耗率测定显示基础呼吸增加,ATP生成增多。干预MAMs后,流式细胞检测提示低氧时增加的早期凋亡、晚期凋亡和总的凋亡细胞百分比降低。WB表明,剪切型PARP比值降低,PCNA增加。细胞培养上清LDH活性降低。干预MAMs后,WB发现低氧诱导的NF-κB磷酸化受到显着抑制。Realtime PCR,WB及Elisa检测提示促炎分子ICAM-1,VCAM-1,E-selectin,MCP-1,IL-6,IL-1β表达降低。干预MAMs后,WB及Elisa检测表明低氧抑制的eNOS S1177磷酸化增加,eNOS活性增强。细胞上清中NO含量增多。结论:1.低氧可诱导平滑肌细胞增殖,MAMs形成减少。促进MAMs形成可促进低氧时平滑肌细胞凋亡和抑制增殖。2.低氧时MAMs界面内质网蛋白处理加工及鞘脂类代谢通路显着激活,Nogo-B蛋白表达增加,从而参与内质网应激应答,神经酰胺、鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇等鞘脂代谢及内质网-线粒体钙转移信号调控,影响平滑肌细胞增殖。3.Nogo-B与NgBR蛋白表达在低氧诱导的平滑肌细胞增殖中出现分离。低氧时,Nogo-B于MAMs界面分布增多,在全细胞水平上未改变。低氧时NgBR表达降低。过表达Nogo-B或抑表达NgBR可抑制MAMs形成和激活MAMs内质网-线粒体钙转移pAkt-IP3R3通路,降低线粒体钙水平,损害线粒体功能,促进平滑肌细胞增殖。4.低氧时内皮细胞MAMs形成增多。破坏MAMs形成可减少低氧引起的线粒体功能损害,抑制细胞凋亡和炎症应答,并增加NO生成。上述研究表明MAMs有望成为干预或防治低氧性肺动脉高压的有效靶点。
任聪[3]（2019）在《马鹿茸多肽“补肾健骨”作用与机制研究》文中认为目的:对马鹿茸多肽进行分离纯化,获得不同分子量的马鹿茸多肽（A～E）。研究马鹿茸多肽（A～E）对MC3T3-E1成骨细胞的增殖及成骨分化作用、对骨髓间充质干细胞的增殖及骨向分化的作用;马鹿茸多肽A对大鼠肾虚型骨质疏松症的作用,探究马鹿茸防治骨质疏松症的作用机制。通过HPLC-MS联用技术分析马鹿茸多肽A的组分组成,采用原子力显微镜对马鹿茸多肽A的表面结构进行分析和表征,采用网络药理学和生物信息学分析方法,探究马鹿茸多肽A防治骨质疏松症的靶基因和靶蛋白,及相关的作用机制的信号通路,为防治骨质疏松症提供理论依据和科学指导。材料与方法:1材料鹿茸药材购于辽宁西丰药材市场,经辽宁中医药大学中药鉴定教研室的李峰教授鉴定为鹿科动物马鹿Cervus elaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角;马鹿茸多肽,由实验室自制。2方法2.1马鹿茸多肽（A～E）的分离纯化及分子量的分布测定采用多级膜分离技术分离并纯化得到5种不同分子量的马鹿茸多肽（A～E）;采用高效凝胶过滤色谱法和SDS-PAGE电泳法测定马鹿茸多肽（A～E）的分子量。2.2马鹿茸多肽（A～E）对MC3T3-E1成骨细胞的增殖及分化作用采用MTT法研究马鹿茸多肽对MC3T3-E1成骨细胞的增殖作用;以ALP为指标,采用ELISA法研究马鹿茸多肽（A～E）对MC3T3-E1成骨细胞的分化作用。2.3马鹿茸多肽（A～E）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖及骨向分化作用采用MTT法研究马鹿茸多肽（A～E）对骨髓间充质干细胞的增殖作用;以ALP、BGP、BMP-2为指标,采用ELISA法研究马鹿茸多肽（A～E）对骨髓间充质干细胞的骨向分化作用。分别采用RT-PCR法和Western-blot法检测BMSCs中BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2基因和蛋白的表达。2.4马鹿茸多肽A对大鼠肾虚型骨质疏松症的作用采用切除雌性大鼠双侧卵巢的方法,建立肾虚型骨质疏松症模型,分别以补佳乐（Progynova）,仙灵骨葆（XLGB）作为阳性对照药,连续给予12周的马鹿茸多肽A。采用骨密度仪测定大鼠的骨密度;采用称量法测定大鼠的子宫指数;采用酶联免疫法（ELISA）检测大鼠血清中的雌二醇（E2）、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（BGP）、骨形成蛋白-2（BMP-2）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（PPARγ2）的活性,及骨组织中的BALP、BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2、TGF-β1,以及下丘脑和肾脏组织的TIEG1、TGF?1。分别采用RT-PCR法和Western-blot法检测骨组织BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2基因和蛋白的相对表达。采用HE染色,观察大鼠股骨、椎骨的形态变化;采用免疫组化法观察大鼠骨组织的形态变化和阳性表达。2.5马鹿茸多肽A的组成与特征采用柱前衍生化的方法,利用氨基酸自动分析仪,测定马鹿茸多肽A水解后的氨基酸的种类和含量。采用HPLC-MS测定马鹿茸多肽A的组分分析。利用原子力显微镜,以粗糙度、表面高度分析、功率谱密度等为参数,测定马鹿茸多肽A的表面形貌。采用GO分析、KEGG分析和String蛋白互作网络等生物信息学方法,分析马鹿茸多肽A的72个多肽片段中,推测与骨质疏松症相关的靶基因和靶蛋白,以及作用机制相关的信号转导通路。结果:1分离纯化得到五种分子量的多肽,即多肽A（200～3000 Da）,多肽B（3000～5000 Da）,多肽C（5000～10000 Da）,多肽D（10000～50000 Da）,多肽E（>50000 Da）。2马鹿茸多肽（A～E）均能促进MC3T3-E1成骨细胞的增殖及成骨分化,其中分子量为200-3000 Da的多肽A,在浓度为200μg·m L-1,作用48 h后,促成骨细胞增殖及成骨分化的作用最显着。3马鹿茸多肽（A～E）对BMSCs细胞的增殖及分化作用3.1马鹿茸多肽（A～E）均能促进BMSCs的增殖及骨向分化,其中以分子量为200-3000 Da的多肽A,在浓度为200μg·m L–1时,促BMSCs的增殖及骨向分化的作用最显着。3.2马鹿茸多肽（A～E）增强Bmp-2、Smad1、Smad5、Runx2基因、蛋白的表达;多肽A上调Bmp-2、Smad1、Smad5、Runx2基因、蛋白的表达最接近诱导液组,可能跟激活Bmp-2/Smad1、Smad5/Runx2信号转导通路有关。4马鹿茸多肽A对大鼠肾虚型骨质疏松症的作用4.1血清中骨代谢相关指标检测结果马鹿茸多肽A升高E2、ALP、BGP、BMP-2的水平,并降低TRAP和PPARγ2水平。4.2子宫指数与正常组比较,模型组大鼠的子宫明显萎缩,各组的子宫指数明显小于正常组;与模型组比较,多肽A高、低剂量组、西阳对照组、中阳对照组,与模型组的子宫指数差异无统计学意义。4.3骨密度的检测结果各给药组均能增加大鼠骨密度,马鹿茸多肽A高剂量组的效果最显着。4.4骨组织中相关指标的检测结果与正常组比较,模型组大鼠骨组织中BALP、BGP、BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2、TGFβ1、TIEG1含量显着降低;与模型组相比,马鹿茸多肽A高、低剂量组、西阳对照组、中阳对照组均能显着提高骨组织中BALP、BGP、BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2、TGFβ1、TIEG1的水平,其中多肽A高剂量组的效果最显着。4.5下丘脑中的TGF-β1和TIEG1蛋白的表达各给药组均增强下丘脑中TGF-β1、TIEG1的表达水平,多肽A高剂量组的效果最显着。4.6肾中的TGF-β和TIEG1蛋白的表达各给药组均增强肾中TGF-β1、TIEG1的表达水平,多肽A高剂量组效果最显着。4.7骨组织中相关基因的表达各给药组大鼠骨组织中BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2基因相对表达量显着升高;多肽A高剂量组对BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2基因相对表达量优于其他组。4.8骨组织中相关蛋白的表达与正常组比较,模型组大鼠骨组织中BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2蛋白灰度值量显着降低;各给药组均能增加BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2的蛋白表达量,且多肽A高剂量组的效果最显着。4.9骨组织形态学检测的结果4.9.1 HE染色检测结果与模型组比较,马鹿茸多肽A高、低剂量组可见骨小梁增厚,结构紧密,骨髓腔变小,骨外膜可见骨原细胞。4.9.2骨组织的免疫组化的结果与正常组比,模型组中的Bmp-2、Smad1、Smad 5、Runx2的平均光密度显着下降;与模型组比,各组的Bmp-2、Smad1、Smad 5、Runx2的平均光密度显着高于模型组,马鹿茸多肽A高、低剂量组的Smad1和Runx2的平均光密度显着高于西阳对照组;多肽A高、低剂量组的Bmp-2、Smad1、Smad 5、Runx2的平均光密度接近甚至高于阳性组。5马鹿茸多肽A的组分分析5.1马鹿茸多肽A中氨基酸的种类与含量在水解后氨基酸中含有18种氨基酸,约占26.4%;组氨酸的含量最高,天冬氨酸含量最少,且8种必需氨基酸含量是2071.24mg.g-1占53.04%。游离氨基酸含有18种氨基酸,约占23.6%;苏氨酸的含量最高,脯氨酸含量最少;8种必需氨基酸553.81mg.g-1,占60.18%。结合氨基酸中必须氨基酸含量1517.43mg.g-1,达50.84%。5.2 HPLC-MS法测定马鹿茸多肽A的组分组成分析得到多肽片段共72个,分子量在700～2000 Da,等电点在4.33-11.45之间。5.3马鹿茸多肽A的表面形貌特征5.3.1表面形貌概况马鹿茸多肽A表面呈现有尖锐的椎体状,且不规律分布在表面。且当浓度从0.1μg.m L-1增加到5μg.m L-1,粗糙度Ra/Rq减小,但变化不明显。5.3.2表面高度分布浓度为0.1 ug.m L-1的马鹿茸多肽的表面高度是6.13969 nm;浓度为0.25μg.m L-1的马鹿茸多肽的表面高度是39.4588 nm;浓度为0.5μg.m L-1的马鹿茸多肽样品的表面高度是14.5105 nm;浓度为1 ug.m L-1的马鹿茸多肽样品的表面高度是16.6944 nm;浓度为5μg.m L-1的马鹿茸多肽样品的表面高度是28.6132nm。5.3.3功率谱密度（PSD）当波长为0.208祄,频率为4.80/祄,马鹿茸多肽A的PSD值为水平轴PSD为40.1 nm3,垂直轴PSD为44.7 nm3,二维的PSD分别为75055 nm4;当波长为0.0971祄,频率为10.3/祄,马鹿茸多肽的PSD值为水平轴的PSD为3.29 nm3,垂直轴的PSD为6.3 nm3,二维的PSD分别为2931 nm4。5.4马鹿茸多肽A的网络药理学研究网络药理学研究发现多肽A中的主要的靶蛋白是胶原蛋白α-1（I）链（COL1A1）、有丝分裂蛋白活化蛋白激酶激酶14（MAPK14）、纤维蛋白2（FBN2）等,推测分析可知PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路,FOX信号通路等,可能与马鹿茸的“补肾健骨”的防治骨质疏松症的作用有关,其共同作用,防治骨质疏松症的发生。这些信号通路的发现与推测是对鹿茸多肽防治肾虚型骨质疏松症的作用机制的补充,推测鹿茸多肽“补肾健骨”的作用,可能是这几种信号通路协同作用的结果。结论:1马鹿茸多肽分离并纯化为为五种不同分子量的多肽（A～E）;采用高效凝胶过滤色谱法和SDS-PAGE电泳法测定马鹿茸多肽的分子量的结果基本一致。2马鹿茸多肽（A～E）促进MC3T3-E1成骨细胞的增殖和分化;且分子量为200-3000 Da的多肽A的促增殖及分化的效果明显优于其他分子量的多肽。3马鹿茸多肽（A～E）促进骨髓间充质干细胞BMSCs的增殖和骨向分化;且分子量为200-3000 Da的多肽A的效果明显优于其他分子量的多肽;其作用机制可能是与其上调Bmp-2、Smad1、Smad5、Runx2信号转导通路有关。4马鹿茸多肽A能防治大鼠肾虚型骨质疏松症。作用机制可能是其激活Bmp-2、Smad1、Smad5、Runx2信号转导通路。5采用HPLC-MS技术分析马鹿茸多肽A有72个多肽片段,结合网络药理学的方法和生物信息学方法,发现了骨质疏松症相关的直接和间接的靶蛋白和靶基因,及其他信号通路,靶基因靶蛋白及多条信号通路协调作用,能预防治疗骨质疏松症的发生。6采用原子力显微镜（AFM）从微观角度分析马鹿茸多肽A的表面结构,表面有凹凸不平的的椎体状,不规律地分布在分子表面,推测可能是多肽的不规则的锥形结构促使多肽A更容易进入细胞,发挥药效作用;且多肽A溶液的的浓度越低,越能清晰地观察的表面形貌。AFM对多肽A结构的深入分析,为研究马鹿茸多肽的构效关系奠定基础。
吴珺[4]（2019）在《敲除SM22α对小鼠心脏功能的影响及其机制研究》文中认为目的:SM22α是calponin家族中的一种actin结合蛋白,可以促进actin肌丝成束。有证据表明SM22α在平滑肌细胞中能够发挥张力感应的作用。多项研究表明,小凹（caveolae）和横管（T-Tubules）是心肌细胞的重要张力转导结构。本文旨在研究SM22α敲除对小鼠心脏功能的影响及其潜在机制。方法:以SM22α敲除小鼠为对象,复制主动脉弓缩窄模型（transverse aortic constriction,TAC）。通过心脏超声技术评估小鼠心功能,western blotting,RT-PCR,免疫荧光等技术研究相关分子的表达与分布特征,运用免疫共沉淀技术研究SM22α与心脏小凹（caveolae）标志蛋白caveolin-3的相互作用,运用荧光共聚焦显微镜记录心肌细胞横管（transverse tubular systems,T-Tubules）系统完整性以及钙离子释放情况,透射电子显微镜技术分析小凹结构特征,利用IonOptix系统检测完整心肌细胞的收缩功能以及肌小节钙敏感性。利用共聚焦显微镜技术检测透化后的肌小节钙敏感性。结果:1.SM22α敲除小鼠心脏功能减弱1.1野生型成年小鼠心肌细胞中表达SM22α为研究SM22α在心脏中的功能,首先需明确心脏中是否有SM22α的表达。由于心脏中存在着高密度的冠状血管系统,而血管平滑肌富含SM22α,为排除心脏冠状血管对实验结果的影响,我们用急性分离并纯化心肌细胞进行检测比较。通过western blotting技术我们在野生型成年小鼠的心脏组织匀浆以及心室肌细胞匀浆中检测到了 SM22α蛋白的表达。1.2 SM22α敲除小鼠心脏功能降低正常状态下的成年SM22α敲除小鼠左室射血分数（52.805±0.658%,n=162）略低于野生型小鼠左室射血分数（55.469±0.611%,n=150）约5%,该差别具统计学意义（P<0.01）。SM22α敲除小鼠收缩末期左室后壁厚度（left ventricular posterior wall,systolic;LVPW,s）（0.812 ± 0.009 mm,n=162）显着性小于野生型小鼠 LVPW,s（0.875±0.012 mm,n=145,P<0.001）。SM22α敲除小鼠ANP,BNP,β-MHC的mRNA水平显着性上升,提示心脏张力应激状态异常。1.3心脏负荷过载（pressure overload）导致SM22α敲除小鼠更快发展为心衰前面的数据提示,尽管敲除小鼠心功能仍在正常范围,但已处于应激状态,因此在面对心脏负荷过载（pressure overload）的情况时可能会出现更严重的问题。为了验证我们的猜测,通过主动脉弓缩窄术（transverse aortic constriction,TAC）增加小鼠心脏后负荷,以检验SM22α敲除小鼠是否更倾向于发展为心衰。TAC后两周时的野生型小鼠心功能无明显变化,但SM22α敲除小鼠在TAC后两周就出现明显心功能降低,TAC前左心室射血分数为55.20 ±1.73%,TAC两周后降为48.42 ±1.44%（n=35,P<0.0101 vs.SM22αKO control;P<0.001 vs.WT）。TAC后四周的野生型小鼠心功能显着性下降,左心室射血分数降至 49.29 ± 1.18%（P<0.001 vs.WT control）,SM22α敲除小鼠心脏功能进一步下降,左心室射血分数降至43.76±3.15%（P<0.05 vs.WT,P<0.001 vs.SM22α KO control）。生存曲线分析表明 SM22α敲除小鼠TAC以后死亡率大于野生型小鼠（WT,3/20;SM22α KO,11/26;Fig.1-3C）。主动脉弓缩窄四周导致SM22α敲除小鼠HW/BW,LW/BW主动脉弓缩窄后的变化均显着性高于野生型小鼠。我们的数据提示,尽管野生型小鼠和敲除小鼠通过长期（八周）负荷过载均发展为心衰且无显着性差异,但敲除小鼠心功能下降的速度明显快于野生型小鼠。1.4野生型小鼠长期负荷过载导致SM22α表达增多。接下来我们比较了野生型小鼠TAC后心肌细胞内SM22α的表达情况。Western blot结果显示,TAC后4周,心肌细胞内SM22α表达增多约70%（Sham 组,SM22α/GAPDH:0.36 ± 0.05,n=5;TAC 后,SM22α/GAPDH:0.63 ± 0.09,n=5,P<0.05）。RT-PCR 结果显示,TAC四周心肌细胞内SM22α显着性升高约60%（Sham组:1.00±0.10,n=21;TAC后:1.63±0.14,n=12,P<0.001）。我们的数据表明,长期负荷过载可导致野生型小鼠心肌细胞SM22α表达水平增加。2.缺失SM22α降低小凹依赖的心肌细胞张力感应,导致收缩动力学异常2.1 SM22α敲除小鼠心肌细胞小凹数量减少,结构异常透射电镜结果显示,SM22α敲除小鼠心肌细胞小凹密度约为野生型小鼠的53%,且SM22α敲除小鼠心肌细胞小凹结构发生显着性改变,小凹开口直径变大,为野生型小凹的两倍。由于小凹密度与结构在细胞张力感受方面发挥的重要作用,我们的结果提示SM22α敲除小鼠心肌细胞的张力感受能力异常。2.2 SM22α敲除小鼠心脏中CAV3与actin的结合显着减少心肌细胞中促进小凹形成及维持小凹结构稳定的关键分子为caveolin-3（CAV3）,CAV3通过与皮层肌动蛋白肌丝相互作用维持小凹结构稳定。因此接下来我们在野生型小鼠与SM22α敲除小鼠心脏中运用免疫共沉淀技术检测了 SM22α是否可以与CAV3结合,以及CAV3、actin与SM22α间的相互关系。Co-IP结果显示,野生型小鼠心脏蛋白裂解液中,用actin或者SM22α的抗体可将CAV3沉降下来,反之亦然。SM22α敲除小鼠心脏中CAV3与actin的结合显着减少,提示SM22α参与actin介导的小凹形成。2.3 SM22α敲除小鼠心肌TCAP定位改变,提示张力感应异常Telethonin（Tcap）是一个主要存在于心肌和骨骼肌Z line的结构蛋白,对于心肌细胞张力感应调节发挥重要的作用。接下来我们利用WB技术检测野生型小鼠及SM22α敲除小鼠心脏中Tcap表达以及分布情况。结果表明,虽然张力感应相关分子Tcap的mRNA以及蛋白表达水平在野生型小鼠及SM22α敲除小鼠心肌细胞中均无显着性差异,但其细胞内分布发生显着性变化。野生型小鼠Tcap沿着Z线规律性分布,但SM22α敲除小鼠心肌细胞Tcap分布紊乱胞浆内散在出现很多Tcap荧光信号,细胞核内也检测到Tcap荧光信号,提示Tcap入核。2.4 SM22α敲除小鼠心肌细胞收缩能力变（略）弱,动力学参数改变接下来我们利用IonOptix心肌细胞收缩及离子浓度同步测量系统检测单个心肌细胞的收缩功能。我们发现SM22α敲除小鼠心肌细胞的收缩幅度略低于对照组野生型小鼠,但差异无统计学意义。但是,SM22α缺失的心肌细胞肌小节收缩速率（1.455±0.123）显着性高于对照组（1.147± 0.077,P<0.05）,且到达峰值时间缩短（WT:0.080±0.004;SM22α KO:0.059±0.003,P<0.001）,提示SM22α缺失导致肌小节钙敏感性异常。2.5 SM22α敲除小鼠心肌细胞肌小节钙敏感性升高,最大收缩幅度降低利用完整的以及saponin透化的小鼠心肌细胞测量得到小鼠心肌细胞肌小节长度的钙敏感性曲线,我们发现SM22α缺失的心肌细胞肌小节钙敏感性高于对照组,但最大反应幅度则低于对照组。3.缺失SM22α的心肌细胞横管结构紊乱,钙释放异常3.1 SM22α敲除小鼠心肌细胞横管结构完整性被破坏横管系统（transverse tubular systems,T-Tubules）是心肌细胞中维持钙调控的重要膜结构,横管的破坏是导致心衰的重要原因之一。我们的结果表明,野生型小鼠心肌细胞横管结构完整,而SM22α敲除小鼠横管系统完整性破坏严重。维持心肌细胞横管与肌浆网靠近的结构分子j unctophilin-2（JPH2）,是横管成熟的重要分子。在SM22α敲除小鼠心肌细胞中JPH2的mRNA较野生型小鼠下降60%,蛋白水平下降约30%。Co-Ip结果表明,SM22α与JPH2存在相互作用。3.2 SM22α敲除小鼠心肌细胞钙瞬变同步性破坏完整横管结构是保证钙瞬变同步的前提。接下来我们检测SM22α敲除小鼠心肌细胞钙瞬变情况。共聚焦显微镜钙成像结果显示,尽管幅度并未降低,SM22α敲除小鼠心肌细胞钙瞬变（calcium transient）同步性显着性下降,且达峰时间显着性延迟。我们的数据提示基础状态下,SM22α敲除小鼠心肌细胞钙瞬变同步性破坏,该数据与SM22α敲除小鼠心肌细胞横管结构完整性破坏相一致。3.3 SM22α敲除小鼠心肌细胞钙稳态失衡横管的破坏还会直接导致心肌细胞内二联体（dyad）,又称钙释放单元（calcium release unit,CRU）的解体,会引起心肌细胞钙紊乱。接下来我们进一步分析SM22α敲除小鼠心肌细胞的钙稳态及钙火花。野生型心肌细胞钙火花频率（calcium sparks frequency,CaSpF）为 1.84±0.70 sparks/100 μm/s,而SM22α敲除鼠心肌细胞钙火花频率显着增多,为6.13± 1.01 sparks/100 μm/s（P<0.05）。钙火花频率升高会导致舒张期肌浆网钙流失,从而降低肌浆网钙储备。我们的结果表明,SM22α敲除的心肌细胞钙储备显着性降低。结论:SM22α缺失小鼠基础状态心脏功能略降低,心室壁厚度变薄。在心脏负荷增加的情况下SM22α缺失的小鼠更容易出现心衰症状。SM22α缺失对心肌细胞张力敏感性结构caveolae的密度和结构以及T-Tubules均产生显着性影响,而且改变了心肌细胞收缩装置的动力学参数以及钙敏感性,使基础状态下心脏处于应激状态,可能是导致心肌细胞对负荷改变适应能力降低的主要原因。
刘飞[5]（2017）在《胞内钙重分布在镉所诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡与自噬中的作用》文中研究表明镉是环境中一种常见的重金属污染物,对机体的损伤呈多系统性和多器官性。肾脏是镉毒性损伤的重要靶器官,而肾小管是镉肾毒性损伤的靶部位。前期研究表明,氧化应激所介导的细胞凋亡在镉染毒所致原代大鼠肾小管上皮细胞毒性损伤中发挥主导作用,且该过程中伴随着胞浆钙超载。钙离子（Ca2+）作为一种重要的胞内第二信使,对细胞凋亡和细胞自噬具有重要的调控作用。然而,镉暴露所致胞浆钙超载的来源、Ca2+对镉所诱导肾小管上皮细胞凋亡及细胞自噬的调控作用尚未见报道。鉴于此,本论文重点研究胞内钙重分布在镉所诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡与自噬中的作用,为镉的肾毒性机制研究提供重要的理论依据。首先,对镉诱导胞浆钙超载的来源进行了探究。在本实验中,用胞浆Ca2+特异性探针Fluo-4-AM,线粒体Ca2+特异性探针dihydro-Rhod-2-AM和内质网Ca2+特异性探针Mag-Fluo-4-AM分别检测胞浆、线粒体和内质网Ca2+水平。通过rPT细胞在含钙和无钙两种培养体系中进行不同时间的镉暴露,对胞浆钙浓度的变化进行检测。接着检测了镉暴露对胞浆、线粒体和内质网Ca2+水平的影响。随后镉与2-APB共孵育12 h,检测2-APB对镉诱导的胞内钙重分布的影响。最后采用放射免疫分析法和免疫印迹法分别检测镉染毒对IP3含量和IP3R（IP3R-1与IP3R-2）蛋白表达水平的影响。结果表明镉暴露导致胞内钙重分布,且IP3-IP3R通路激活导致的内质网钙库释放是胞浆钙超载的主要来源。其次,探讨了镉诱导的胞浆钙超载对细胞凋亡的调节作用。用TG、BAPTA-AM及2-APB对细胞进行处理,对胞浆钙超载与细胞凋亡的关系进行研究。首先通过Hoechst33258染色来观察细胞核凋亡的形态变化,同时用细胞流式技术对细胞凋亡率进行检测,最后通过CCK-8检测细胞存活率。结果表明镉诱导的胞浆钙超载可促进细胞凋亡,导致细胞毒性。再次,对镉诱导的胞浆钙超载与细胞自噬的关系展开研究。首先对LC3、p62的蛋白表达水平进行了检测,接着使用RFP-GFP-LC3与GFP-LC3对细胞进行转染,观察镉诱导的胞浆钙超载对自噬流以及自噬小体数量的影响。结果表明在镉处理的肾小管上皮细胞中,胞浆钙超载抑制自噬流并且阻碍自噬小体的降解。随后,采用免疫荧光技术对LC3与LAMP-1及LC3与Rab7的共定位情况进行检测,结果显示镉诱导的胞浆钙超载可阻碍自噬小体与溶酶体的融合,主要原因是Rab7对自噬小体的载运功能失效。最后,对氧化应激与自噬之间的联系展开了研究。首先用三种胞浆钙调控剂对胞浆钙超载与氧化应激之间的联系进行了检测。随后采用ROS清除剂NAC对细胞进行处理。先对LC3和P62蛋白表达量进行分析。再采用免疫荧光技术对LC3与LAMP1及LC3与Rab7进行共定位分析。结果表明在镉处理的大鼠肾小管上皮细胞中,胞浆钙超载促进氧化应激的产生,且氧化应激参与镉诱导的自噬流损伤。综上所述,镉暴露导致胞内钙重分布,即胞浆钙超载同时伴随线粒体钙超载与内质网钙外流;IP3激活的IP3R通路导致的内质网钙库释放是胞浆钙超载的主要来源。镉诱导的胞浆钙超载在促进细胞凋亡的同时抑制自噬流,提示我们胞浆钙超载在自噬和凋亡中的起到双重调节作用。升高的胞浆钙离子主要通过抑制Rab7对自噬小体的载运作用来抑制自噬小体与溶酶体的融合从而导致自噬流抑制,造成自噬小体的蓄积。镉诱导的胞浆钙超载可激活氧化应激,且氧化应激可诱导自噬流损伤。
秦瑶[6]（2011）在《CaMKⅡδ对心房肌细胞钙离子流影响的研究》文中认为研究背景钙离子是一种细胞内重要的电荷载流子,同时作为一种普遍的介质参与各种细胞过程。在心肌细胞里,这些过程包括基因转录、兴奋-收缩耦联及凋亡。众所周知,细胞内钙离子传递电信号到机械活动,造成单个心肌细胞的短缩进而整个心脏的收缩。然而,近期的研究结果越来越多的证据显示细胞内钙超载会导致许多心脏疾病,如心肌病、心功能不全和心律失常。钙/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它可以磷酸化细胞内的许多种蛋白,从而使得细胞内的钙离子浓度提高。CaMKⅡ在正常的心肌细胞以及病理状态下的心肌细胞里的钙循环都起着重要的调控作用。而且,近期证实,CaMKⅡ有可能成为一个针对心脏疾病治疗的潜在药物靶标。许多报道证实在心肌肥厚、心力衰竭和心律失常的病例中,CaMKⅡ的活性增加、表达上调。在心脏疾病中,CaMKⅡ蛋白的含量和活性程度会随着离子通道的高表达而得到激活和提高。CaMKⅡ有四种亚型α、β、γ及δ,其中δ亚型是CaMKⅡ在心脏最主要的表型。心肌细胞的动作电位有一个独特的以平台期为特征的延长的除极电位,它的形成主要是钙离子内流与钾离子外流动态平衡的结果。在很多心脏疾病中心肌细胞的电活动的改变是由于钙信号蛋白的重塑和其它离子通道蛋白的改变而发生的。CaMKⅡ是一种广为人知的调控细胞内钙离子迁移的频率和幅度的蛋白激酶,能被细胞CaMKⅡ内较高浓度的钙离子激活,比如当心率加快时,细胞内钙增加,激活CaMKⅡ,活化后的CaMKⅡ可以磷酸化许多种丝氨酸/苏氨酸钙调控蛋白,诸如L型钙离子通道（LTCC）、软诺丁受体（RyR2）、基质网钙离子受体2a抑制蛋白（PLN）。心肌细胞内CaMKⅡ通过调控细胞内钙离子浓度而改变动作电位的时程,因此,CaMKⅡ被认为可能与增加心律失常的发生机会有关。但其中的机制还在不断探求中。心房纤颤（房颤）是一种临床上最为常见的心律失常,它的发生伴随着血栓栓塞事件的增加和住院率的增加等危害,具有较多的致死率和致残率。心房纤颤发生的潜在电生理机制是快速的异位触发心律和折返机制,而究其发生主要是由于延长的动作电位时程及决定于心肌细胞减慢的电传导和/或缩短的心房肌细胞不应期。临床上,在心房纤颤的患者的心房肌细胞里,发现存在有异常增高的细胞内钙蓄积,并且研究证实心肌细胞内钙超载,在心律失常的发生中起着关键的作用。同时,在房颤患者的心房肌细胞里也发现有CaMKⅡ的异常高表达。最近,更多的研究者在关注CaMKⅡ与各种心律失常的联系机制,但更多的试验正在涉及到确认是否心房纤颤的发生及维持与CaMKⅡ直接相关。给予培养的原代心房肌细胞以快速的电场刺激,被用来模拟在体外心房纤颤的细胞微环境,且电场刺激被证实通过缩短动作电位时程致易于发生房颤使得心房肌发生电重构。但在这一过程中CaMKⅡ的功能及作用还未被明确。我们设想增加心房肌细胞内CaMKⅡδ的表达量会影响到基质网的钙释放以及L型钙通道钙离子内流,而快速的电场刺激模拟增加的心率致细胞内钙短暂增加而激活CaMKⅡδ,从而改变细胞内钙离子稳态,致房颤的发生。本研究通过改变CaMKⅡδ表达量来探索其在电场刺激导致心肌细胞钙变化中的作用,可以为房颤的治疗提供一定的理论基础。实验方法病毒载体构建和病毒制备:大鼠CaMKⅡδ（NM012519）的cDNA从Open Biosystems购买（7939424）。开放阅读框通过PCR的方法连接到慢病毒载体LV-IRES-RFP中,得到质粒LV-CaMKⅡδ-IRES-RFP. CaMKⅡδ通过CMV启动子驱动表达。为了下调CaMKⅡδ表达,我们设计了三对siRNA,并且连入慢病毒载体,此载体中siRNA通过双向启动子表达。所有质粒都通过测序验证。慢病毒颗粒通过将包装质粒和病毒载体共转染293FT细胞获得,粗制的病毒液收集后超速离心可获得滴度108 TU/ml的病毒液,用于后继实验。原代心肌细胞培养和转染:从新生大鼠（1-2天）上快速分离心脏,再将心室分离并用0.125%胰酶和0.1%胶原酶I消化。收集单细胞悬液,按0.5～1×104/cm2的密度接种于6孔板或玻片上。48小时后,按MOI=10加入慢病毒。培养48小时后,将培养基换为新鲜DMEM,继续培养细胞待后继使用。心肌细胞电场刺激:培养的原代心肌细胞置于培养箱内,加上连续电场刺激24小时。电场由计算机控制,电波频率10Hz,电压1.5 V/cm。细胞钙检测:咖啡因刺激的钙流通过扫描共聚焦显微镜进行观察。L型钙离子通道电流通过膜片钳检测。挑选带有红色荧光的心肌细胞进行检测。为了消除细胞大小差异的影响,电流强度定义为电流密度除以细胞电容。结果成功构建了CaMKⅡδ基因的表达慢病毒载体,通过转染293FT细胞制备慢病毒,可以得到高滴度的病毒液,用此病毒转染原代心肌细胞,能够在细胞内获得较好的基因表达。另一方面设计了三条干扰序列,通过转染293FT细胞并用Western blot检测筛选出2#序列具有较好的干扰效率,将此序列构建到慢病毒载体中获得了干扰CaMKⅡδ的病毒载体。成功从新生大鼠心脏分离培养出原代心肌细胞,并通过免疫组化和免疫荧光鉴定培养的心肌细胞纯度可达到90%以上。将制备的慢病毒浓缩到108 TU/ml以上,按MOI=10转染原代心肌细胞,通过荧光显微镜及流式细胞仪检测感染率可以达到70%。而进一步通过western blot和qPCR检测过表达及干扰病毒的效果,发现过表达病毒转染的细胞CaMKⅡδ表达为对照病毒的两倍,而干扰病毒转染后,CaMKⅡδ表达约为对照病毒的50%。从而成功的在原代细胞中获得了CaMKⅡδ的过表达和干扰。对原代心肌细胞进行电场刺激后检测CaMKⅡδ变化,发现CaMKⅡδ的活性增加,但是表达量未发生变化。进一步检测过表达和干扰CaMKⅡδ的细胞,其表达量在电场刺激前后均未发生变化。在未刺激情况下,CaMKⅡδ的表达变化会导致内质网钙释放和L型钙流的变化。高表达细胞中,L钙流增加了约25%;而低表达细胞中,其下降了约28%。在电场刺激情况下,CaMKⅡδ表达依然导致了胞内钙的变化。L钙流在高表达细胞中增加了23%,而在低表达细胞中降低了26%。降低CaMKⅡδ表达量,可以将电刺激导致的钙流增强降低到正常水平。结论本研究主要结论:电场刺激导致原代心肌细胞内钙变化,此过程中CaMKⅡδ活性增加,但表达量未变化。通过过表达或RNA干扰改变CaMKⅡδ表达量,可以调节电场刺激导致的钙变化,从而改善电异常环境下的胞内钙。
李治平[7]（2005）在《培养细胞对糖代谢异常环境的基因应答研究》文中研究指明目的:通过研究体外培养细胞在严格控制的条件下对微环境内、外糖代谢基本物质含量变化的基因应答,深入探索发生在糖尿病视网膜病变中的糖生物学调控机制。 方法:建立稳定的正常人二倍体成纤维细胞与各物种血管内皮细胞的无糖培养环境,为单因素分析实验打下基础;在模拟生理条件激活细胞膜糖转运系统后,精确改变培养环境内基本糖代谢物质以及关键中间产物的含量,了解上述细胞的生物学行为应答;运用DNA分子杂交原理与抑制性PCR技术构建样本间差异表达基因的cDNA克隆文库。 结果:人成纤维细胞和各种血管内皮细胞能够在传代期以无糖培养基替换原有培养基必要的时间而不影响细胞增殖,这将有利于其后药物刺激实验的精确进行和差异表达基因的克隆。与对照组比较,20mM葡萄糖培养环境对各种细胞的生长特性产生不良影响,作用4小时后使细胞膜收缩,形态变圆,贴壁质量下降,细胞数量减少;使用消减杂交技术成功构建出人血管内皮细胞样本间差异表达基因的cDNA文库,转染Top10大肠肝菌后从T载体内克隆出特异性的差异cDNA,表明培养细胞在转录水平发生了活跃的改变;2mM氨基葡萄糖-6-P或乙酰氨基葡萄糖-6-P在作用4小时后严重改变了正常人二倍体成纤维细胞的生存状态,使之无法继续贴壁生长,血管内皮细胞则虽然发生形态改变,却仍然保持贴壁,显示出明显的毒性耐受能力。 结论:高浓度的葡萄糖或其活性代谢产物对培养细胞产生的毒性作用与其对转录水平的调控有关,氨基己糖生物合成途径产物对糖尿病视网膜微血管并发症的出现具有很强的刺激能力,血管内皮细胞对毒性代谢产物的基因应答可能在糖网病的发生机制中占据核心地位。作为连接蛋白质翻译后乙酰胺糖基化修饰体系的底物合成和糖缀合物分解产物进入三羧酸循环产生能量之间的唯一调节通道,磷酸氨基葡萄糖脱氨旁路对保持能量代谢和糖生物学调节平衡具有重大意义。本研究结合编码基因抑制性消减杂交技术和糖尿病视网膜病变发病机制研究的最新进展,在已取得的实验结果基础上提出UDP-GlcNAc代谢池的阀门控制模式假设,为探索糖缀合物代谢与蛋白质翻译后修饰参与糖尿病视网膜病变的机制及新的诊治方法奠定基础。
喻林华[8]（2004）在《小鼠早期胚胎发育过程中iNOS和nNOSmRNA的表达》文中进行了进一步梳理一氧化氮（nitric oxide，NO）是一种具有自由基性质的生物活性分子，能溶于水并具有脂溶性，化学性质非常活跃，作为一种小分子气体信号分子，NO在机体防御、神经信号传导、血管扩张等生理过程中发挥着重要的作用。生物体内的一氧化氮由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化L-精氨酸（L-arginine，L-Aig）脱胍基产生L-胍氨酸（L-citrulline，L-Cit）而成，哺乳动物有三种不同构型的NOS，即神经型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）、内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、诱导型一氧化氮合酶（inflammatory or macrophage nitric oxide synthase，iNOS）。NOS是一氧化氮生成过成中的限速酶，因此某一组织中NOS的量能线性反应出该组织中NO的量。 近年来有许多研究表明NO在体内外早期胚胎发育中具有重要的调节作用。动物早期胚胎的发育是个体发育的重要阶段，其发育过程受体内许多因素（包括NO）的调节和影响。人们已从多个方面对早期胚胎发育过程作了大量的研究，然而对NO在早期胚胎中可能产生的生理调节作用了解较少。为了探讨NO对小鼠附植前胚胎发育的影响，采用反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase RT-PCR）方法检测了附植前各发育时期胚胎中nNOS和iNOS的mRNA的表达情况，用目的基因与内参照管家基因β-actin的引物共同扩增cDNA后，进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，可见692bp和554bp处有明显的两条带。结果表明：小鼠囊胚中观察到有iNOS mRNA的表达，小鼠1-细胞期、2-细胞期、4-细胞期和8-细胞期胚胎以及桑椹胚中没有观察到iNOS mRNA的表达；而1-细胞期、2-细胞期胚胎中nNOS mRNA表达明显，且1-细胞期胚胎比2-细胞期胚胎表达量稍高。这表明NO参与了小鼠附植前胚胎的发育，并可能与附植前胚胎的信号传递及早期分化有关。
喻林华,薛立群,袁安文,许道军,向建洲,刘扬[9]（2004）在《小鼠附植前胚胎发育过程中nNOS and iNOS mRNA的表达》文中认为为了探讨NO（一氧化氮）对小鼠附植前胚胎发育影响,采用RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）方法检测了附植前各发育时期胚胎中nNOS（神经型一氧化氮合酶）和iNOS（诱导型一氧化氮合酶）mRNA的表达情况。结果表明:小鼠囊胚中观察到有iNOS mRNA的表达,小鼠1-细胞期、2-细胞期、4-细胞期和8-细胞期胚胎以及桑椹胚中没有观察到iNOS mRNA的表达:而1-细胞期、2-细胞期胚胎中nNOSmRNA表达明显,且1-细胞期胚胎比2-细胞期胚胎表达量稍高。这表明NO参与了小鼠附植前胚胎的发育,并可能与附植前胚胎的信号传递及早期分化有关。
罗晓艳,黄秀英,孙方臻[10]（2002）在《小鼠早期受精胚细胞核诱导成熟卵母细胞Ca2+释放活性的研究》文中进行了进一步梳理在受精过程中,哺乳动物卵子细胞内的钙离子浓度呈现连续性反复升高.有证据表明:将受精的1-和2-细胞期的胚胎细胞核移植到未受精卵中能导致卵子产生钙升高并使该重构胚激活 然而,尚不清楚胚胎细胞核这种诱导卵子内钙升高的能力是如何获得的,是否处于不同发育阶段的早期胚胎细胞核都具有这种能力.利用细胞核移植技术,将小鼠受精早期胚胎细胞核移植到成熟卵母细胞中,并测定该重构胚细胞内钙含量变化,结果表明,受精1-和2-细胞期的细胞核具有诱导成熟卵子钙释放活性的功能,而4-和8-细胞期细胞核、融合的2或3个小细胞期的细胞核及乙醇孤雌活化的原核均不具有这种能力.结果说明,胚胎细胞核诱导卵子细胞内钙升高的能力是受精过程中产生的,是受精胚特有的,它存在于早期受精胚的特殊发育阶段.这暗示早期受精胚这一特有的能力对胚胎的正常发育具有重要意义.
二、Calcium-releasing activity induced by nuclei of mouse fertilized early embryos（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Calcium-releasing activity induced by nuclei of mouse fertilized early embryos（论文提纲范文）
（1）Piezo1介导特发性肺动脉高压患者来源的肺动脉平滑肌细胞增殖的机制研究（论文提纲范文）
| 中英文词汇对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 Piezo1 对正常PASMCs钙稳态的调节作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 第二部分 探究Piezo1 对正常PASMCs收缩及增殖表型的作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 第三部分 Piezo1 的钙调节作用对IPAH-PASMCs增殖的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 右心与肺动脉高压 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）内质网-线粒体相关膜在低氧诱导的平滑肌细胞增殖和内皮细胞损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 低氧对MAMs形成的影响及其在平滑肌细胞增殖中的作用 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 低氧时MAMs界面的蛋白组学表征及其在平滑肌细胞内钙转移调控中的作用分析 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 Nogo-B/Nogo-B receptor对平滑肌细胞MAMs形成和内质网-线粒体钙转移通路的调控作用 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 低氧对血管内皮细胞MAMs形成的影响及其在内皮细胞损伤中的作用 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 内质网-线粒体相关膜在肺动脉高压中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（3）马鹿茸多肽“补肾健骨”作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 肽的分离与纯化 |
| 第一节 肽的分离与纯化 |
| 第二节 高效凝胶过滤色谱法测定马鹿茸多肽的分子量 |
| 第三节 SDS-PAGE法测定马鹿茸多肽分子量的分布 |
| 第二章 马鹿茸多肽对成骨细胞的增殖和分化的作用 |
| 第三章 马鹿茸多肽对骨髓间充质干细胞的增殖和骨向分化的作用 |
| 第一节 马鹿茸多肽对骨髓间充质干细胞的增殖和分化的作用 |
| 第二节 马鹿茸多肽促骨髓间充质干细胞骨向分化的机制研究 |
| 第四章 马鹿茸多肽对大鼠肾虚型骨质疏松症的作用 |
| 第五章 马鹿茸多肽A的组分研究 |
| 第一节 马鹿茸多肽A中的氨基酸的组分分析 |
| 第二节 HPL-MS测定马鹿茸多肽A的组分分析 |
| 第三节 马鹿茸多肽A的表面结构研究 |
| 第四节 马鹿茸多肽A的网络药理学研究 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述一 中药防治骨质疏松症的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 多肽类物质的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（4）敲除SM22α对小鼠心脏功能的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 SM22α敲除小鼠心脏功能减弱 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 缺失SM22α降低小凹依赖的心肌细胞张力感应,导致收缩动力学改变 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 缺失SM22α的心肌细胞横管结构紊乱,钙释放异常 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 心脏横管的结构与功能 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）胞内钙重分布在镉所诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡与自噬中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 镉的污染状况及毒性研究进展 |
| 1.1.1 镉的理化性质 |
| 1.1.2 镉的污染状况 |
| 1.1.3 镉的肾毒性研究进展 |
| 1.2 细胞凋亡 |
| 1.2.1 死亡受体通路 |
| 1.2.2 线粒体凋亡途径 |
| 1.2.3 内质网凋亡信号通路 |
| 1.3 细胞自噬 |
| 1.3.1 自噬检测的困扰 |
| 1.3.2 自噬的过程 |
| 1.3.3 细胞自噬活性的检测 |
| 1.3.4 自噬小体数量的检测 |
| 1.3.5 自噬流的检测 |
| 1.3.6 LC3转化率分析 |
| 1.4 钙信号 |
| 1.4.1 胞内钙分布状况 |
| 1.4.2 胞内钙稳态 |
| 1.4.3 钙信号与细胞凋亡 |
| 1.4.4 钙信号与细胞自噬 |
| 1.5 氧化应激 |
| 1.5.1 氧化应激与细胞凋亡 |
| 1.5.2 氧化应激与细胞自噬 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器： |
| 2.4 相关实验试剂的配置 |
| 2.4.1 磷酸盐平衡液（PBS）的配置 |
| 2.4.2 消毒液酸液（次强酸）的配置 |
| 2.4.3 血清的处理 |
| 2.4.4 醋酸镉毒液配制 |
| 2.4.5 含钙及无钙DMEM-F12原代细胞培养基的配制与除菌 |
| 2.4.6 配制 1.0 M NaOH和 1.0 M HCl溶液 |
| 2.4.7 配制 2-APB |
| 2.4.8 BAPTA-AM的配制 |
| 2.4.9 配制TG |
| 2.4.10 NAC的配制 |
| 2.4.11 鼠尾胶原的制备 |
| 2.4.12 Western Blot相关溶液的配置 |
| 2.5 试验方法 |
| 2.5.1 原代培养及传代培养SD大鼠肾小管上皮细胞 |
| 2.5.2 染毒处理 |
| 2.5.3 胞浆钙离子浓度[Ca2+]c的检测 |
| 2.5.4 线粒体钙离子浓度[Ca2+]mit的检测 |
| 2.5.5 内质网钙离子浓度[Ca2+]ER的检测 |
| 2.5.6 IP_3含量的检测 |
| 2.5.7 检测细胞凋亡率 |
| 2.5.8 蛋白质免疫印迹试验（Western Blot） |
| 2.5.9 免疫荧光法鉴定LC3与LAMP-1 及LC3与Rab7的共定位情况 |
| 2.5.10 CCK-8 法检测细胞活性 |
| 2.5.11 细胞内ROS的水平测定 |
| 2.5.12 细胞转染 |
| 2.5.13 统计学分析 |
| 3 结果及分析 |
| 3.1 镉诱导大鼠肾小管上皮细胞胞浆钙离子超载主要来自细胞内 |
| 3.2 镉处理对肾小管上皮细胞胞内钙重分布的影响 |
| 3.3 镉诱导的胞浆钙离子升高主要来源于内质网 |
| 3.4 镉暴露激活IP_3-IP_3R通路使内质网钙外流导致胞浆钙超载 |
| 3.5 三种钙信号转导抑制剂对镉所致胞浆钙浓度的调控作用 |
| 3.5.1 采用流式细胞仪检测钙信号转导剂对胞浆钙浓度的影响 |
| 3.5.2 三种钙离子调控剂对calpain-1 蛋白表达的调控 |
| 3.6 三种钙离子调控剂对镉诱导的细胞毒性的影响 |
| 3.6.1 2-APB对镉诱导的细胞毒性的影响 |
| 3.6.2 TG对镉诱导的细胞毒性的影响 |
| 3.6.3 BAPTA-AM对镉诱导的细胞毒性的影响 |
| 3.7 镉诱导的胞浆钙超载对细胞凋亡的影响 |
| 3.7.1 2-APB对镉诱导的细胞凋亡的影响 |
| 3.7.2 TG对镉诱导的细胞凋亡的影响 |
| 3.7.3 BAPTA-AM对镉诱导的细胞凋亡的影响 |
| 3.8 镉浓度与时间对自噬标志蛋白的影响 |
| 3.9 镉诱导的胞浆钙超载抑制自噬流 |
| 3.10 钙信号调控剂对镉所诱导肾小管上皮细胞自噬小体蓄积的影响 |
| 3.11 镉染毒及药物处理后对自噬小体与溶酶体融合的影响 |
| 3.12 镉染毒及药物处理后对LC3与Rab7共定位的影响 |
| 3.13 镉诱导的胞浆钙超载与氧化应激的关系 |
| 3.14 氧化应激参与镉诱导的肾小管上皮细胞自噬抑制 |
| 3.15 氧化应激参与镉诱导的肾小管上皮细胞自噬体与溶酶体的融合抑制 |
| 3.15.1 NAC可恢复自噬小体与溶酶体融合 |
| 3.15.2 NAC可恢复自噬小体与Rab7融合 |
| 4 讨论 |
| 4.1 胞浆钙超载的来源 |
| 4.2 胞浆钙超载与细胞凋亡 |
| 4.3 镉与自噬抑制 |
| 4.4 胞浆钙超载与细胞自噬 |
| 4.5 氧化应激与自噬抑制 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
（6）CaMKⅡδ对心房肌细胞钙离子流影响的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 CaMKⅡδ过表达及siRNA 慢病毒载体的构建 |
| 第一节 基于HIV 的CaMKⅡδ质粒构建及病毒包装 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第二节 基于 FIV 的 CaMKⅡδ 相关 siRNA 质粒构建与病毒包装 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 乳鼠心房肌细胞原代培养及慢病毒感染 |
| 第一节 鼠心房肌细胞的原代培养与鉴定 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第二节 慢病毒颗粒感染原代培养的乳鼠心房肌细胞 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 电场刺激对CaMKⅡδ调节钙离子流影响 |
| 第一节 电场刺激对CaMKⅡδ的表达及激酶活性的影响 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第二节 激光共聚焦检测电场刺激对CaMKⅡδ调节细胞内钙流的影响 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第三节 膜片钳检测电场刺激对CaMKⅡδ调节细胞内钙流影响 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 慢病毒在体感染鼠心脏实验的初步探索 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 CAMKⅡ调控CA~(2+)与心房纤颤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
（7）培养细胞对糖代谢异常环境的基因应答研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 正常人二倍体成纤维细胞及常见物种血管内皮细胞的无糖化培养 |
| 第二部分 葡萄糖及其代谢衍生物对高严谨条件下培养细胞的刺激实验 |
| 第三部分 用抑制性消减杂交技术克隆培养人血管内皮细胞差异表达基因 |
| 参考文献 |
| 附录一：常用试剂与仪器 |
| 附录二：细胞培养基成分 |
| 附录三：论文发表情况 |
| 附录四：获得研究资助情况 |
| 附录五：学术奖励情况 |
| 附录六：文献综述 |
| 附录七：常用英文缩写表 |
| 后记 |
| 论文独创性声明 |
| 论文使用授权声明 |
（8）小鼠早期胚胎发育过程中iNOS和nNOSmRNA的表达（论文提纲范文）
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 结果与分析 |
| 1 早期胚胎的获取 |
| 2 总RNA样品的检测 |
| 3 cDNA的检测 |
| 4 目的基因PCR扩增电泳产物的琼脂糖电泳 |
| 5 PCR产物的定量 |
| 讨论 |
| 1 早期胚胎的采集 |
| 2 总RNA的提取 |
| 3 总RNA样品的检测 |
| 4 PCR引物 |
| 5 RT-PCR |
| 6 电泳 |
| 7 NO对早期胚胎发育及附植的影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）小鼠早期受精胚细胞核诱导成熟卵母细胞Ca2+释放活性的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| (ⅰ)材料. |
| (ⅱ)受体小鼠成熟卵母细胞(简称MⅡ卵)的获得. |
| (ⅲ)供体不同发育阶段胚胎的获得. |
| (ⅳ)供体乙醇孤雌活化原核胚的获得. |
| (ⅴ)供体4-细胞期胚细胞融合合胞体的获得. |
| (ⅵ)显微操作方法. |
| (ⅶ)细胞融合. |
| (ⅷ)细胞内游离钙离子(Ca2+)浓度的测定. |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
四、Calcium-releasing activity induced by nuclei of mouse fertilized early embryos（论文参考文献）
- [1]Piezo1介导特发性肺动脉高压患者来源的肺动脉平滑肌细胞增殖的机制研究[D]. 廖静. 广州医科大学, 2021(02)
- [2]内质网-线粒体相关膜在低氧诱导的平滑肌细胞增殖和内皮细胞损伤中的作用及机制研究[D]. 阳一栋. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [3]马鹿茸多肽“补肾健骨”作用与机制研究[D]. 任聪. 辽宁中医药大学, 2019(01)
- [4]敲除SM22α对小鼠心脏功能的影响及其机制研究[D]. 吴珺. 河北医科大学, 2019(02)
- [5]胞内钙重分布在镉所诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡与自噬中的作用[D]. 刘飞. 山东农业大学, 2017(02)
- [6]CaMKⅡδ对心房肌细胞钙离子流影响的研究[D]. 秦瑶. 第三军医大学, 2011(07)
- [7]培养细胞对糖代谢异常环境的基因应答研究[D]. 李治平. 复旦大学, 2005(07)
- [8]小鼠早期胚胎发育过程中iNOS和nNOSmRNA的表达[D]. 喻林华. 湖南农业大学, 2004(04)
- [9]小鼠附植前胚胎发育过程中nNOS and iNOS mRNA的表达[A]. 喻林华,薛立群,袁安文,许道军,向建洲,刘扬. 全国首届动物生物技术学术研讨会论文集, 2004
- [10]小鼠早期受精胚细胞核诱导成熟卵母细胞Ca2+释放活性的研究[J]. 罗晓艳,黄秀英,孙方臻. 科学通报, 2002(19)