一、结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性的噬菌体测定（论文文献综述）
魏清雯[1]（2021）在《MDR1基因多态性与耐药结核的相关性研究》文中研究表明研究目的:我国是耐药肺结核全球第二高负担国家,耐药结核病的治疗成功率仅54%,其病死率更是高达16%,耐药结核对人类的危害更大。人群感染结核菌后仅有约10%发病,人类宿主易感基因研究对于耐药结核防控有重要意义,多药耐药基因1（multidrug resistance gene1,MDR1）编码的P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）,在药物吸收情况、药物分布和代谢及药物清除方面具有重要意义。MDR1基因多态性可以影响P-gp功能,本研究将对MDR1基因多态性与耐药结核的关系进行研究,以期找出耐药结核易感基因,对耐药结核的早期诊断、早期治疗提供帮助。方法:采用病例对照研究,收集兰州市肺科医院2020年10月至2021年1月门诊病人共97例,均汉族,其中耐药肺结核59例,敏感肺结核38例,录入资料,抽取5ml静脉血,提取DNA,设计引物,聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）,送北京诺赛基因公司测序MDR1基因c.1236C>T（rs1128503）位点、c.2677G>T/A（rs2032582）位点和c.3435C>T（rs1045642）位点的基因多态性,用SPSS22.0进行统计分析,比较耐药组与非耐药组在基因频率和等位基因频率方面的分布差异,以P<0.05为有统计学意义。结果:在汉族人群耐药肺结核组与肺结核敏感组、利福平耐药组与利福平敏感组、乙胺丁醇耐药组和乙胺丁醇敏感组间分别比较MDR1基因rs1128503、rs2032582和rs10456423 3个位点的基因型频率和等位基因频率,P均>0.05,各组间差异无统计学意义。结论:MDR1基因多态性可能与汉族人群耐药结核、利福平耐药、乙胺丁醇耐药的易感基因无关。
任琦[2]（2020）在《结核分枝杆菌耐药特征及其与DNA修复系统Nth基因的关系研究》文中研究说明目的了解唐山地区结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）的耐药特征和药物靶基因突变特征;明确MTB的DNA修复系统基因和蛋白在不同临床株中的表达水平;分析临床分离菌株耐药特征与药物靶基因突变和MTB的DNA修复系统表达水平的关系;比较缺失和过表达DNA修复系统重要基因Nth与药物靶基因突变和MTB耐药性产生的相关性,进一步明确结核分枝杆菌的耐药机制。方法选择2015年10月2016年11月经唐山市第四医院确诊并住院治疗的肺结核患者193例为研究对象,对其一般情况进行调查。对患者痰液中的细菌进行分离培养,并采用抗酸染色法鉴定结核分枝杆菌。采用药敏试剂盒对临床分离的结核分枝杆菌进行药敏鉴定,根据文献报道,选择四种一线抗结核药物的15个作用靶基因位点进行测序,对上述两项结果进行描述性分析,以明确唐山地区MTB的耐药特征和靶基因位点突变特征。DNA修复系统基因和蛋白表达水平变化可能是基因突变和耐药产生的原因之一。采用RT-PCR和Western Blot方法对MTB的DNA修复系统主要基因mRNA和蛋白进行检测,分析不同药敏类型菌株中两者的表达水平,并探讨其表达与药物靶基因位点突变的关系。采用噬菌体介导的同源重组基因敲除方法和无缝克隆连接技术,对从临床株中检测出的特异基因Nth基因进行敲除和回补过表达实验,PCR技术及细菌培养验证试验结果。采用四种一线抗结核药物（异烟肼、利福平、乙胺丁醇和链霉素）对标准株H37Rv、Nth基因敲除菌株和Nth基因过表达菌株实施耐药诱导,药物浓度的选择参考了临床用药剂量和药敏实验浓度。960全自动结核分枝杆菌培养系统鉴定耐药诱导结果。测量并记录标准株H37Rv、Nth敲除株和Nth过表达株的生长曲线,微量肉汤稀释法鉴定三种菌株的最低抑菌浓度,进一步明确Nth基因对MTB耐药性的影响。对耐药诱导成功的菌株进行药物靶点测序,比较基因突变情况。结果193株临床分离菌株中,96.37%为人型株;对一线和二线抗结核药物的耐药率分别为37.37%和75.65%,其中耐多药菌株比例为3.63%,多耐药菌株比例为15.54%;异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇耐药率分别为12.44%、12.95%、21.76%和17.62%;宿主的体质指数、职业、结核病治疗史是耐药性结核病的影响因素;15个药物靶基因位点中EmbB 306、RpoB 531和RpoB 526位点突变率较高,分别为80.66%、72.62%和55.36%,其余位点的突变率均低于50%;DNA修复系统部分基因mRNA和蛋白表达水平在不同药敏类型菌株中差异明显,其中End、Nth、Nei、Mpg这4个基因的mRNA和蛋白表达趋势一致,在敏感株中的表达均高于耐药菌株（P<0.05）;而表达趋势相反的有SigA、DnaQ和DnaE1这3个成员;靶基因位点突变与修复基因表达水平的相关性分析结果显示,在利福平靶基因RpoB 531位点突变组和未突变组中,Nth基因mRNA和蛋白表达水平的差异具有统计学意义（P<0.05）;对标准株H37Rv、Nth敲除株和Nth过表达株实施耐药诱导,结果显示缺失Nth基因的菌株在药物环境中进入对数生长期和平台期的时间均早于H37Rv和Nth过表达菌株;对三种菌株进行单药耐药诱导时,仅有Nth过表达菌株在高浓度利福平和乙胺丁醇中未检测到细菌生长,其他菌株对所有药物均产生耐药;两药联合应用时,Nth敲除菌株和标准株H37Rv对低浓度药物均产生耐药;三药联合应用时,Nth过表达菌株在所有药物环境中均未检测到生长,仅有Nth敲除株对低浓度药物产生耐药;在三药联合应用的环境中,菌株的存活率明显低于两药联合和单药的用药环境;Nth过表达菌株在利福平参与的药物环境中更难以产生耐药性;Nth过表达菌株对利福平的最低抑菌浓度是标准株H37Rv的5.29倍,是Nth敲除菌株的9.25倍;在成功诱导耐药的菌株中,只有4株被检测到基因突变,且均为Nth敲除株。结论1唐山地区临床分离结核分枝杆菌对一线和二线药物的耐药率均较高,药物靶基因突变水平与全国平均水平相近;体质指数、职业、结核病治疗史是耐药性结核病的影响因素;2 DNA修复系统部分基因mRNA和蛋白表达差异与MTB耐药性产生有关,该系统Nth基因水平变化与细菌耐药及利福平靶基因RpoB 531位点突变相关;3缺失、过表达Nth基因与MTB生长情况、药物靶点突变和耐药产生均相关;4多药联合应用可减弱MTB在药物环境中的生长趋势。图33幅;表32个;参292篇。
魏家玮[3]（2020）在《结核分枝杆菌Cas1和RNA结合蛋白在结核致病及免疫逃逸中的作用》文中提出研究背景:结核是由结核分枝杆菌引起的一种严重的传染性疾病,至今为止它仍然是全球十大致死原因之一,同样也是单一传染源导致的感染性疾病中最主要的死因。目前结核治疗中面临的两大最主要困难是治疗过程中的结核耐药和结核免疫逃逸,正是这两大因素导致结核治疗困难、化疗程长且容易复发。我们通过研究结核分枝杆菌CRISPR-Cas系统中一个关键蛋白Cas1和结核感染过程中诱导机体产生的RNA结合蛋白,探讨结核治疗中耐药发生的机制及逃避机体初级免疫的机制。研究方法:1.我们通过收集来自重庆医科大学附属第一医院初次确诊肺结核,且痰培养阳性的临床分类结核样本,通过PCR检测其Cas1基因及其侧翼序列的缺失情况。2.利用分枝杆菌噬菌体D29感染BCG构建共感染模型,利用高通量测序技术检测BCG受到分枝杆菌噬菌体D29感染后的CRISPR插入序列的变化情况,研究CRISPR-Cas在分枝杆菌噬菌体抵抗中的作用。3.构建分枝杆菌穿梭质粒在M.smegmatis中异源性表达结核分枝杆菌Cas1蛋白。4.通过H2O2,SDS和酸化培养基模拟环境压力条件,分别计算重组M.smegmatis在不同压力条件下生存率的变化情况,研究结核分枝杆菌Cas1蛋白对环境压力应激的影响。5.利用刃天青微量滴定法,研究Cas1蛋白对重组M.smegmatis抗生素敏感性的影响。6.利用体外表达纯化的结核分枝杆菌RpfE,通过计算复苏指数RI,研究Cas1蛋白对抗生素压力下的重组M.smegmatis滞留状态的影响。7.分别利用DNA损伤剂顺铂和丝裂霉素C诱导重组M.smegmatis产生DNA损伤,研究Cas1蛋白对重组M.smegmatis DNA损伤修复的影响。8.通过转录组测序,分析Cas1蛋白影响重组M.smegmatis DNA损伤修复可能的分子机制。9.利用体外表达纯化的结核分枝杆菌Cas1蛋白,与来源于结核分枝杆菌CRISPR插入序列的300bp双链DNA和CRISPR间隔序列来源62bp的双链DNA相互作用,研究其DNA结合活性和DNA酶切活性。10.通过Zfp36+/-和Zfp36 flox/flox转基因鼠杂交,得到髓系细胞选择性Zfp36基因敲除的转基因鼠。11.使用Mtb/BCG感染小鼠骨髓巨噬细胞,通过WB和qt-PCR研究结核感染如何诱导RNA结合蛋白TTP在巨噬细胞中表达。12.利用髓系细胞选择性Zfp36基因敲除的小鼠巨噬细胞,并以BCG为替代模型,感染小鼠巨噬细胞,通过qt-PCR研究TTP对感染巨噬细胞细胞因子谱产生的影响。13.分别利用氢-3标记的尿嘧啶掺入BCG生长抑制试验和BCG侵染巨噬细胞菌落形成单位测定,研究TTP对巨噬细胞抑菌作用和杀菌作用的影响。14.利用Zfp36基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞,利用血清剥夺和雷帕霉素诱导自噬,通过WB检测微管相关蛋白轻链3,免疫荧光染色探测细胞内自噬小体的形成,研究TTP对自噬过程的影响。15.分别使用MAPK抑制剂SB203580,mTOR通路阻断剂雷帕霉素、AZD8055和PP242研究mTOR通路对TTP转录和表达的影响。并进一步利用λ蛋白磷酸酶去除TTP的磷酸化修饰,研究mTOR通路对TTP磷酸化修饰的影响。16.通过利用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺阻断蛋白合成,研究mTOR通路对TTP蛋白稳定性的影响。17.通过利用蛋白酶体抑制剂MG132阻断泛素-蛋白酶通路介导的蛋白降解作用,研究mTOR-泛素-蛋白酶体通路在调节TTP蛋白稳定性中起到的作用。18.通过免疫共沉淀法研究TTP蛋白的泛素化修饰作用。研究结果:1.35株临床分离的结核分枝杆菌样本中,20例（57.14%）出现Cas1基因的缺失及其侧翼序列的改变。2.分枝杆菌噬菌体D29并不能完全杀灭体外培养的BCG,侵染30天后对BCG的CRISPR序列高通量测序,插入序列中检测不到与D29基因组相匹配的序列。3.通过转染分枝杆菌穿梭质粒,结核分枝杆菌的Cas1蛋白能够在重组M.smegmatis中异源性表达。4.表达Cas1的重组M.smegmatis的形态和生长情况发生变化,表达Cas1蛋白的M.smegmatis相对于空载体对照菌落形态更加光滑及湿润,并且在液体培养基中也更容易聚集成团,电镜下表面皱劈更少。表达Cas1蛋白的重组M.smegmatis相对于空载体对照生长更缓慢,达平台期时间更长,但是达到平台期以后的OD600值更高,平台期的细菌密度更大。5.表达Cas1蛋白的M.smegmatis相对于空载体对照在H2O2,SDS和酸化培养基模拟的环境压力下生存率更低。6.表达Cas1蛋白的M.smegmatis相对于空载体对照对利福平、乙胺丁醇和左氧氟沙星的敏感性提高,但对链霉素敏感性影响不大。7.表达Cas1蛋白的M.smegmatis相对于空载体对照在半致死剂量的利福平、乙胺丁醇和左氧氟沙星抗生素压力下,进入滞留状态的细菌更少。8.表达Cas1蛋白的M.smegmatis相对于空载对照对顺铂和丝裂霉素C诱导产生的DNA损伤更加敏感。9.表达Cas1蛋白的M.smegmatis相对于空载对照其DNA损伤修复相关基因表达明显下调,其中包括主要RuvAB复合物、重组蛋白F、核酸内切酶IV、ATP依赖的DNA螺旋酶、尿嘧啶DNA糖苷酶、重组酶A、重组调节蛋白RecX、DNA修复ATP酶、DNA修复外切酶、烷基化DNA修复蛋白、DNA修复蛋白RadA、DNA完整性扫描蛋白DisA、核酸内切酶Ⅲ和DNA聚合酶IV。10.重组结核分枝杆菌Cas1蛋白体外表现出金属离子依赖的DNA酶活性。11.通过Zfp36+/-和Zfp36 flox/flox转基因鼠杂交,能使TTP在小鼠巨噬细胞中选择性敲除。12.Mtb和BCG感染均可诱导小鼠巨噬细胞产生TTP,选择性删除TTP蛋白的巨噬细胞受到感染后能产生更多促炎细胞因子,巨噬细胞杀菌作用增强,BCG在巨噬细胞内生长被抑制。13.TTP能够抑制小鼠胚胎纤维细胞在血清剥夺诱导下的自噬发生,但对雷帕霉素诱导的自噬效果不明显。14.BCG感染能够激活小鼠巨噬细胞mTOR通路,MAPK抑制剂SB203580和mTOR通路抑制剂雷帕霉素、AZD8055以及PP242能够抑制BCG感染引起的巨噬细胞TTP表达。15.mTOR通路抑制剂能加速TTP在巨噬细胞内降解。蛋白酶体抑制剂MG132能阻断mTOR抑制导致的TTP降解。16.mTOR通路是通过泛素化-蛋白酶体依赖途径来调节TTP的细胞内降解,mTOR通路抑制剂雷帕霉素能加速TTP的泛素化从而促进其蛋白酶体途径的降解。研究结论:1.分枝杆菌对其噬菌体的抗性可能并不主要依赖于CRISPR-Cas系统介导的插入序列而获得的。2.Cas1的丢失对结核分枝杆菌的环境压力抵抗、DNA修复以及抗生素耐药可能产生广泛的影响,这可能是不含Cas1基因的结核杆菌北京家系在特定地区高流行的原因。3.Mtb/BCG感染巨噬细胞后能诱导细胞产生RNA结合蛋白TTP,从而抑制感染巨噬细胞的杀菌作用,达到逃避初级免疫杀灭的目的。4.TTP的稳定性受到mTOR-泛素化-蛋白酶体通路的调节,mTOR抑制剂通过促进TTP泛素化从而加速其蛋白酶体途径的降解,增强巨噬细胞的杀菌作用。
许峻旗[4]（2020）在《分枝杆菌三个耐药新基因的鉴定与功能研究》文中提出结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）仍然是全球最成功的致病菌之一。结核病难以治疗的症结在于结核菌的持留性、耐药性和毒力性,其中耐药性结核分枝杆菌是治疗的重难点。据世界卫生组织估计,2019年由吡嗪酰胺（Pyrazinamide）和氟喹诺酮类（Fluoroquinolone）耐药结核菌引起的新发结核病例至少为630万例,而其中多耐药病例为49万例。此外,由于多耐药（MDR）和广耐药（XDR）结核病的发病率越来越高,可用于治疗结核病的抗生素越来越少。为了更有效治愈结核病患者,必须开发新的治疗方案。结核分枝杆菌细胞壁和细胞膜是结核菌抵抗抗生素和宿主免疫杀菌的重要屏障。分枝杆菌细胞膜是一种复杂的多层结构,主要由5个重要部分组成:质膜（Plasma Membrane,PM）、肽聚糖（Peptidoglycan,PG）、阿拉伯半乳聚糖（Arabinogalactan,AG）、外膜（Outer membrane,OM）和分枝菌酸（Mycolic Acid,MA）。细胞壁则主要由肽聚糖（PG）组成。细胞壁和细胞膜在支持细胞生长,发挥细胞毒力和逃避宿主免疫等方面至关重要。特别是细胞膜合成和组装的过程十分复杂,为开发抗结核药物提供了大量候选靶点。因此,细胞壁和细胞膜组分是新药研发值得关注的靶标来源。在本研究中我利用Tn7转座子构建了包含10000株基因突变菌株的耻垢分枝杆菌突变库,通过筛选我发现编号为M492的突变菌对吡嗪酰胺的敏感（PZA）性上升。我通过质粒拯救的方法,进一步鉴定发现M492的突变基因为MSMEG3314（膜转运蛋白）。比对发现MSMEG3314在海分枝杆菌（M.marinum）,麻风分枝杆菌（M.leprae）,耻垢分枝杆菌（M.smegmatis）,牛分枝杆菌（M.bovis）,鸟分枝杆菌（M.avium）,和脓肿分枝杆菌（M.abscess）中均保守存在,其一致性均高于60%。MSMEG3314的缺失改变了细胞膜的质子浓度梯度差（pH差）,增强了氟喹诺酮类药物的杀菌效率。同时,添加活性氧（ROS）清除剂（硫脲和联吡啶）可以减弱莫西沙星的杀菌能力,证明了M492突变菌对氟喹诺酮类药物的敏感与ROS的产生有关。溴化乙锭荧光染色积累和流出实验结果表明,缺失MSMEG3314会导致细胞膜透性显着增加。然后我在M492里回补表达了MSMEG3314蛋白,经过实验验证,基因功能得到了恢复。综上所述,M.smegmatismc2155 MSMEG3314在清除ROS和维持细胞膜稳定性方面具有重要作用,并影响耻垢分枝杆菌对PZA和氟喹诺酮类抗生素的耐药性。同时,通过生物信息学预测影响细菌细胞膜和细胞壁生物功能的基因发现:结核分枝杆菌丝氨酸蛋白酶Rv2224c在应对多种抗生素压力时均明显差异表达,包括异烟肼、莫西沙星、万古霉素和利福平等。然后我利用同源重组技术在耻垢分枝杆菌中敲除了该基因的同源基因MSMEG4296。敲除菌对SDS更加敏感,并且其生物膜形成能力和滑动能力有缺陷,电镜扫描也发现MSMEG4296敲除菌表面形成的脊状突起明显减少,说明MSMEG4296是影响细菌生物膜形成的重要基因。抗生素MIC实验发现敲除菌对万古霉素的敏感性增加。由于细胞壁重要组分D-Ala-D-Ala是万古霉素的靶点,因此我从大肠杆菌中纯化异源表达的结核分枝杆菌Rv2224c蛋白,并与D-Ala-D-Ala相孵育,结果发现Rv2224c蛋白可以水解D-Ala-D-Ala,从而改变耻垢分枝杆菌对万古霉素的敏感性。最后,我探索了细胞壁相关蛋白对金属离子的影响。细胞壁上有多种金属离子转运蛋白,这些蛋白对维持胞内环境稳态具有重大意义。在基因突变文库中我发现了一株对铜离子含量特别敏感的突变菌株,鉴定其突变基因为MSMEG4702,对应结核分枝杆菌同源基因为Rv0102。同样,我在耻垢分枝杆菌中主动敲除了MSMEG4702基因。MSMEG4702敲除菌在低铜离子浓度下的生长变慢,但是在高铜离子浓度下的存活能力增强,提示MSMEG4702是负责摄入外源铜离子的蛋白。铜（Cu）对宿主免疫细胞内病原体如结核分枝杆菌（Mtb）是必不可少的。Western-blot实验结果表明Rv0102蛋白定位在细菌的细胞壁上,利用胞内铜离子检测试剂盒,我发现Rv0102同源基因MSMEG4702缺失的耻垢分枝杆菌胞内铜积累较少,仅为野生型耻垢分枝杆菌的三分之一。同时,MSMEG4702缺失突变体的铁硫簇代谢相关基因表达降低,对氟喹诺酮类抗生素莫西沙星的耐药性增强,这表明铜吸收减少与铁硫簇蛋白和细胞内活性氧（ROS）的产生有关。铜在巨噬细胞的免疫应答中起关键作用。MSMEG4702缺失耻垢分枝杆菌突变体在THP-1巨噬细胞中的存活能力是野生型耻垢分枝杆菌的四倍,该缺失突变体明显抑制了巨噬细胞的凋亡。这表明Rv0102是一种被证实的铜摄取蛋白,对分枝杆菌的生存和应激反应起重要作用。本研究首次证明Mtb膜蛋白Rv0102是一种铜吸收分枝杆菌蛋白（Mycobacterium copper uptake protein A,McuA）。这与之前发现的MctB和CtpV铜离子外排蛋白共同组成了结核分枝杆菌细胞壁铜转运系统。综上所述,本文从细胞膜通透性、生物膜形成能力和胞内铜离子浓度稳态三个方面鉴定了三个抗生素耐药新基因并确定了其功能,为认识抗生素耐药新机理,新药物靶标提供了基础。
高敏[5]（2020）在《基于全基因组测序的结核病传播及耐药特征分析》文中研究说明第一部分基于全基因组测序的西藏结核病传播特征分析目的利用全基因组测序技术分析西藏地区结核病近期传播及其相关影响因素和跨区传播情况,为当地相关部门制定防治管理措施提供参考依据。方法收集西藏2006、2009和2010年的结核分枝杆菌菌株576株,通过流行病学调查获取每株菌株的社会人口学信息、临床特征等信息。利用全基因组测序技术回顾性分析西藏的结核病的传播情况,并分析影响西藏结核病传播的相关因素、跨区传播的情况。结果（1）以5个和12个SNP为界,在540株MTB中分别鉴定到196株（36.3%）和308株（57.0%）成簇菌株。（2）单因素分析结果显示2010年、痰涂片（+）、北京基因型、RR/MDR均为成簇的影响因子（P值均<0.05）;多因素分析结果提示无论以SNP≤5还是SNP≤12定义成簇时,2010年（OR5=2.72,95%CI:1.70-4.48;OR12=1.88,95%CI:1.22-2.97）、北京基因型（ORSNP≤5=3.77,95%CI:1.72-9.49;OR SNP≤12=4.91,95%CI:2.48-10.47）、RR/MDR（OR SNP≤5=2.02,95%CI:1.39-2.49;OR SNP≤12=1.69,95%CI:1.17-2.94）均为成簇的危险因素（P值均<0.05）。（3）西藏地区所形成的区外联系（52.1%）略大于区内联系（47.8%）,各区内除拉萨以区内联系（66.1%）为主外,其他六个区皆以区外联系为主。（4）不同大小的传播簇簇中初复治病例分布具有统计学差异（=10.766,P=0.005）。2c结论西藏结核病近期传播较为严重,其与北京基因型、RR/MDR高度相关,且传播簇的大小与初复治有关。拉萨以区内传播为主,其他各区皆以区外跨区传播为主。第二部分基于全基因组测序的中国耐多药结核分枝杆菌耐药特征分析目的利用全基因组测序数据分析中国耐多药结核分枝杆菌的耐药相关基因突变谱和主要突变类型及其与菌株基因型的相关性。方法查询并下载NCBI数据库中截止2019年8月前已公开发表的中国结核分枝杆菌全基因组测序数据,利用全基因组数据预测菌株分子药敏结果,统计不同药物耐药相关基因的突变类型,并分析耐药突变类型与菌株基因型的相关性。结果（1）根据分子药敏结果从2019株菌株中鉴定出1122株利福平耐药株,其中1024株（91.3%）为耐多药菌株。（2）1024株耐多药菌株对常用抗结核药物的耐药相关基因主要突变类型分别为kat G S315T（73.2%,异烟肼）、rpo B S450L（63.1%,利福平）、rps L K43R（70.0%,链霉素）、emb B M306V（37.4%,乙胺丁醇）、pnc Apromoter T（-11）C（7.9%,吡嗪酰胺）、gyr A A90V（32.3%,氟喹诺酮类）、rrs A1401G（67.7%,二线注射类）、fab G1promoter C（-15）T（87.0%,乙硫异烟胺）、fol C I43T（30.4%,对氨基水杨酸）。（3）Geno Type MTBDRplus对INH和RFP的检测率分别为99.1%、90.0%,MTBDRs I对FQs和SLID的检测率分别为95.5%、88.2%。（4）kat G S315T、rps L K43R、emb B M306V、gyr A D94G在L2系菌株中的比例显着高于L4系菌株,fol C I43T仅在L2系菌株中发现;kat G S315T在古老北京型菌株中比例较高,而rps L K43R在现代北京型菌株中的比例更高,其差异均有统计学意义（P<0.05）。结论本研究提供了基于全基因组测序的中国耐多药结核分枝杆菌对多种常用抗结核药的耐药相关基因主要突变类型,为研发敏感、特异的快速分子检测方法提供了依据;同时也发现多种耐药相关基因主要突变类型与菌株基因型有关。
程成[6]（2019）在《西北部分地区牛源分枝杆菌的分离鉴定及耐药性分析》文中研究指明结核病是流行于世界各地、严重威胁人和动物健康的一类人畜共患传染病。牛作为人类生产生活资料的重要来源,在结核病的传播过程中有着重要地位。本研究对分离自宁夏和新疆为主的西北部分地区规模化奶牛场中PPD阳性奶牛的疑似致病菌,采用多位点PCR进行菌种鉴定。利用MIRU-VNTR基因分型技术探究牛源分离株的基因型。经过药物敏感试验了解牛源分离株的表型耐药情况。通过对耐药基因测序,研究耐药菌株耐药基因突变与表型耐药和基因型之间的相关性。运用基因测序技术,探究西北五省非结核分枝杆菌（nontuberculosis mycobacterium,NTM）的种类,为西北地区控制牛结核病提供可靠的理论依据。采用酸性罗氏无淀粉培养基对82株结核病疑似致病菌的冻存菌株进行复壮和传代培养,最终成功复壮80株分离株。经16SrRNA初步鉴定,80株临床分离株均属于分枝杆菌属。通过MPT64基因和多位点PCR鉴定出30株MTBC,其中一株为宁夏株,其余29株分离株均为新疆株。采用比例法进行一线抗结核药物（异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇）敏感试验,20株（20/30,66.7%）结核分枝杆菌对四种一线抗结核药均敏感,10株（10/30,33.3%）对至少一种药物耐药,其中9株（30.0%,9/30）为耐多药（MDR）菌株。RIF单耐药率为3.3%（1/30）,其他三种一线抗结核药（STR、INH和EMB）单耐药率均为0%。STR、INH、RIF和EMB的总耐药率分别为 30.0%（9/30）、30.0%（9/30）、33.3%（10/30）和 6.7%（2/30）。一线抗结核药相关耐药基因测序结果,10株耐药结核分枝杆菌中,rpoB1333位点的突变率为10.0%;katG1388位点的突变率为90.0%;inhA1812位点的突变率为70.0%,1714位点的突变率为10.0%;rrs932位点的突变率为10.0%;embB1333位点的突变率为90.0%;oxy R-ahp C和rps位点无突变。聚类分析15个MIRU-VNTR位点的基因分型结果,30株结核分枝杆菌聚集成四个基因群,呈现出18种VNTR基因型,其中14株为单一基因型,即一株菌代表一种基因型,占所有菌株的46.7%;16株（53.3%）聚集成4个基因簇,即C1、C2、C3、C4,每一簇分别包含3、2、5、6株分离株,菌株成簇率为46.7%。最大的基因群（均为新疆株）包含C3和C4基因簇,该基因群包含的菌株可能是新疆地区的优势菌株。将50株非结核分枝杆菌hsp65测序序列提交NCBI网站进行同源性比较发现6种NTM。不产色分枝杆菌（mycobacterium nonchromogenicum）32株（64.0%,32/50）,罕见分枝杆菌（mycobacterium peregrinum）4 株（8.0%,4/50）,鸟分枝杆菌（mycobacterium alvei）8 株（16.0%,8/50）,恩氏分枝杆菌（mycobacterium engbaekii）3株（6.0%,3/50）,偶发分枝杆菌（mycobacterium fortuitum）2株（4.0%,2/50）,mycobacterium arupense 1株（2.0%,1/50）。牛群中流行的主要非结核分枝杆菌可能是不产色分枝杆菌。
朱晨[7]（2018）在《乙胺丁醇与异烟肼协同抑制结核分枝杆菌生长的分子机制研究》文中认为半个多世纪以来,异烟肼（INH）和乙胺丁醇（EMB）一直是治疗结核病（TB）的两种主要一线药物,这两种药物的联合使用有效地遏制了结核病的蔓延。然而,虽然异烟肼和乙胺丁醇在临床上联合使用非常普遍,但是它们之间潜在的协同作用机制却十分不清楚。实验室前期研究发现:在非致死剂量EMB存在下,转录因子EtbR的表达水平显着影响INH对结核分枝杆菌的杀菌能力。本论文在此基础之上,针对转录因子介导的两种药物协同作用的分子机制展开了系统研究,取得了如下结果:（1）在非致死剂量EMB存在下,转录因子EtbR的过量表达使结核分枝杆菌对INH更敏感,最小抑菌浓度（MIC）显着降低。EtbR属于TetR/AcrR家族的转录因子,本研究用刃天青显色法测定了INH对M.tuberculosis H37Ra野生型菌株和etbR超表达菌株的最小抑菌浓度,结果发现INH对超表达菌株的最小抑菌浓度比对野生型菌株的下降了1倍;而当加入非致死浓度EMB时,INH对etbR超表达菌株的最小抑菌浓度相比则下降了3倍。（2）EtbR识别其自身及inhA基因上游的一个保守结合位点并抑制基因的表达,EMB能够直接与EtbR结合并增强其DNA结合活性。利用ChIP、EMSA和DNaseⅠfootprinting实验发现EtbR识别自身启动子和inhA基因上游序列一个20bp的保守结合位点;实时定量PCR结果和β-半乳糖甘酶活性实验显示EtbR抑制自身及inhA启动子活性,说明EtbR作为转录抑制子负调控自身及inhA基因的表达。通过ITC（等温量热滴定法）和SPR（表面等离子共振）发现EtbR与小分子EMB以1:1的比例结合;EMSA和SPR实验证明EMB能特异性地增强EtbR对靶启动子inhAp的结合活性;β-半乳糖甘酶活性以及实时定量PCR结果显示EMB促进EtbR对inhA基因的转录抑制作用。（3）在非致死剂量EMB存在下,etbR过量表达增强了INH对M.tuberculosis H37Ra、M.bovis BCG以及M.smegmatis MC2155的杀菌能力且超表达etbR降低了EMB+INH联合处理下分枝杆菌在感染小鼠巨噬细胞内的生存能力。通过构建相关重组菌株并检测单一药物及两个药物联合处理下细菌的生长曲线,结果显示:在0.02μg/mL INH胁迫下,与M.tuberculosis H37Ra、M.bovis BCG以及M.smegmatis MC2155野生型相比etbR的三个超表达菌株生长没有明显受到抑制,而在EMB（0.2μg/mL）+INH（0.025μg/mL）共同胁迫的条件下,etbR的三个超表达菌株生长受到了明显抑制。另外,通过测定M.tuberculosis H37Ra重组菌株在药物胁迫下在细胞中的生存率发现:与仅INH单一处理相比,EMB+INH联合处理下,野生型菌株在胞内的存活率有轻微地下降（P<0.05）;而etbR超表达菌株感染细胞后,同样的处理条件下,胞内存活的菌落数有显着的下降（P<0.01）,这说明超表达etbR降低了药物胁迫下分枝杆菌在胞内的生存能力。综上所述,本研究在分枝杆菌中首次发现一个由Rv0273c基因编码的转录因子能够通过结合EMB抑制inhA基因的表达增强了分枝杆菌在EMB协同下对INH的敏感性。这些结果揭示分枝杆菌转录因子介导的一线抗结核药物EMB和INH联合使用增强药效的分子机制,加深了我们对细菌抗药性形成机制的认识,为以转录因子作为药物靶标及开展新型抗菌疗法提供理论参考。
罗晶晶[8]（2018）在《贝达喹啉、德拉马尼和氯法齐明对非结核分枝杆菌体外抑菌活性的测定》文中研究表明目的:测定非结核分枝杆菌（Non-tuberculosis mycobacteria,NTM）标准株和临床分离株对贝达喹啉（Bedaquiline,Bdq）、德拉马尼（Delamanid,Dlm）和氯法齐明（Clofazimine,Cfz）三种抗结核药物的体外敏感性,并分析耐药基因突变与表型耐药的相关性。方法:本研究共检测了45种NTM标准菌株,205株NTM临床分离株。所有临床分离株均采用同源基因序列比对方法鉴定至种水平。菌株对Bdq、Dlm和Cfz的敏感性采用微孔板梯度稀释法检测最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration,MIC）。对耐药菌株进行Mar R基因和Atp E基因序列测定,分别分析其与Cfz和Bdq耐药的相关性。结果:应用同源基因序列比对法进行菌种鉴定,205株NTM临床分离株包括:35株胞内分枝杆菌,40株脓肿分枝杆菌,33株偶然分枝杆菌,22株鸟分枝杆菌,45株堪萨斯分枝杆菌,10株戈登分枝杆菌,20株其他少见分枝杆菌。药敏实验结果显示,Bdq对慢生长分枝杆菌（Slowly growing non-tuberculous mycobacteria,SGM）标准株表现出很强的抑菌活性,其中13株MIC<1μg/m L,仅2株≥2μg/m L;Bdq对快生长分枝杆菌（Rapid growing non-tuberculous mycobacteria,RGM）标准株也有较强的抑菌作用,30株RGM中有26株MIC≤1μg/m L,仅4株MIC≥2μg/m L。Dlm对SGM标准株的抑菌活性具有明显的菌种差异,15株SGM中8株分枝杆菌MIC<0.25μg/m L,6株MIC≥32μg/m L,1株MIC=2;但Dlm对RGM标准株的抑菌活性较弱,30株RGM中,24株MIC≥32μg/m L,仅3株MIC<1μg/m L。Cfz对SGM标准株表现出很强的抑菌活性,15株SGM中,14株MIC<1μg/m L,仅1株MIC>8μg/m L;而Cfz对RGM标准株的抑菌活性存在明显的菌种差异性,30株RGM中有18株MIC<1μg/m L,3株MIC≥4μg/m L。不同分枝杆菌菌种对Bdq的耐药率如下:胞内分枝杆菌11.43%（4/35）;偶然分枝杆菌9.09%（3/33）;脓肿分枝杆菌20.00%（8/40）;鸟分枝杆菌0%（0/22）;堪萨斯分枝杆菌2.22%（1/45）;戈登分枝杆菌20.00%（2/10）。不同分枝杆菌菌种对Cfz的耐药率如下:胞内分枝杆菌48.57%（17/35）;偶然分枝杆菌87.88%（29/33）;脓肿分枝杆菌90.00%（36/40）;鸟分枝杆菌22.73%（5/22）;萨斯分枝杆菌4.44%（2/45）;戈登分枝杆菌30.00%（3/10）。不同分枝杆菌菌种对Dlm的耐药率如下:胞内分枝杆菌91.43%（32/35）;偶然分枝杆菌100%（33/33）;脓肿分枝杆菌92.50%（37/40）;鸟分枝杆菌68.18%（15/22）;堪萨斯分枝杆菌13.33%（6/45）;戈登分枝杆菌40%（4/10）。依据MIC50和MIC90值比较,Bdq<Cfz<Dlm。测序分析Mar R基因发现17株胞内分枝杆菌耐药株中,2株存在氨基酸突变（Asp92Glu、Ala153Pro）,14株存在同义突变,1株无突变。5株鸟分枝杆菌耐药株中,1株存在同义突变,2株存在氨基酸突变（Asp127Asn）,2株无突变。分析Atp E基因发现,15株对Bdq耐药的胞内分枝杆菌、偶然分枝杆菌和脓肿分枝杆菌均不存在Atp E基因突变。结论:本研究中,Bdq具有最好的体外活性,其对大部分NTM临床株具有较好的抑制作用;Cfz对SGM表现出良好的抑菌活性,Dlm对SGM的抑菌活性较RGM好,对大多数RGM抑菌活性较差。根据MIC值分布范围,本研究初步定义了堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌对Cfz的流行病学临界值（ECOFF值）分别为0.5μg/m L,1μg/m L和2μg/m L,为设立药敏试验临界值标准提供了依据。生物信息学分析提示Bdq和Cfz耐药分子机制均与Rv0678同源基因突变有关。
米贤文[9]（2013）在《新型噬菌体压电传感器快速检测结核分枝杆菌的机理及其药敏应用效果的研究》文中进行了进一步梳理结核病是目前单因素引起发病率和死亡率最高的疾病。全球有三分之一的人群感染结核分枝杆菌，每年新增800万结核病人，有200万人死于结核病。世界卫生组织于1993年宣布：全球处于结核病紧急状态。引起结核病再次大流行的原因之一是不合理用药导致的耐药菌株的出现。为有效执行DOTS（Directly ObservedTreatment, Short-Course）策略，快速检测结核分枝杆菌和正确选择抗生素治疗成为防治结核病的关键。利用串联式压电石英传感器对环境电参数响应灵敏的特点，将其应用于微生物生长状态监测中，及早得到微生物的生长信息。用串联式压电传感器，分析培养基不同成分对微生物生长压电信号的影响；用单因素分析方法，分析不同成分对耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌生长曲线的影响。将M7H9培养基中成分的作用分为缓冲作用、合成代谢作用、生长促进因子作用，构建分枝杆菌压电检测体系。对压电频移曲线进行分类，将压电频移信号产生的物质基础分为分解代谢所分泌电导成分和合成代谢所吸收电导成分两种类型，分别产生向下的频移曲线和向上的频移曲线，提升对串联式压电微生物传感器频移信号的理论认识。用噬菌体成斑率为指标，研究噬菌体在环境中稳定的条件，保证噬菌体的感染效率；研究噬菌体最佳的灭活方法，减少实验过程出现假阳性。分析钙镁浓度对噬菌体吸附、顿挫感染的影响，得出最佳的钙离子浓度、杀毒剂硫酸亚铁胺浓度。用一步生长曲线研究噬菌体D29与耻垢分枝杆菌作用的特性，分析影响噬菌体生物放大作用的外部环境因素，优化出最适合结核分枝杆菌快速检测的培养基配方。综合考虑噬菌体的稳定条件、灭活条件、一步生长曲线的最优条件和耻垢分枝杆菌在M7H9培养基中压电信号的影响因素，选择适合构建噬菌体生物放大的压电传感器检测培养体系。结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌能被噬菌体D29感染，保护菌体内的噬菌体D29不被硫酸亚铁杀灭。样品中的结核分枝杆菌被作为载体，将加在样品处理液中的噬菌体D29转移到检测池。在检测池中，噬菌体D29裂解结核分枝杆菌释放子代噬菌体，子代噬菌体感染耻垢分枝杆菌，经历快速的感染、复制、裂解的循环过程。这个循环过程构成噬菌体链式生物放大反应，最终得到完全抑制耻垢分枝杆菌生长的结果。样品中结核分枝杆菌的浓度不同，转移到检测池中的噬菌体D29的也浓度不同，完全抑制耻垢分枝杆菌生长所需的循环次数不同，最终导致检测池中耻垢分枝杆菌生长程度不同。当样品中没有结核分枝杆菌充当噬菌体的载体时，则无噬菌体被转移到检测池中，耻垢分枝杆菌的生长不受噬菌体抑制。耻垢分枝杆菌在生长过程中，利用培养基中的电导成分，引起压电传感器产生频移响应信号。不同浓度的结核分枝杆菌引起不同强度的压电频移响应信号。在液体培养基中，充分发挥噬菌体的链式放大作用，提高检测方法灵敏度。应用压电传感器对电参数的灵敏响应，提高检测方法的灵敏度。通过噬菌体D29桥梁作用，将慢速生长的结核分枝杆菌检测，转换成快速生长的耻垢分枝杆菌的检测，大大提高检测速度。噬菌体对结核分枝杆菌的裂解作用，可降低实验风险，安全可靠。耻垢分枝杆菌检测所需要培养基和仪器要求低，成本低廉。用数学模型分析检出时间与溶液中噬菌体浓度的关系，得出检测时间与溶液中1-102pfu/mL噬菌体D29浓度成线性的结果。用双盲对照的原则研究样本处理对检测方法的影响，得出正确的样本处理方法，保证结果的准确度，避免假阳性和假阴性。该方法可以检测102cfu/mL的结核分枝杆菌，检测时间缩短到30小时，具有临床诊断实用价值。噬菌体放大多通道压电传感器法（PA-MSPQC）与Bactec MGIT960法的统计学比较结果，得出两者检测临床样本的灵敏度和特异度一致。但PA-MSPQC法检测时间只需30小时，优于培养法。PA-MSPQC法还可以通过提高噬菌体感染效率，进一步提高方法的灵敏度。防止耐药结核分枝杆菌的出现是控制结核病的关键措施，实现结核分枝杆菌菌株耐药的快速检测，对合理用药和防止耐药菌株的出现有非常重要的意义。我们根据噬菌体只能感染活的结核分枝杆菌的特点，将PA-MSPQC法应用于结核分枝杆菌耐药检测。建立PA-MSPQC法耐药结果的频移标准，根据实验条件和比例法耐药的判别标准，对利福平、异烟肼和乙胺丁醇三种药物，当耻垢分枝杆菌生长引起的频移小于121Hz时，认为菌株对药物耐受；对链霉素药物，当耻垢分枝杆菌引起的压电频移小于92Hz时，判定菌株对链霉素耐药。将双盲实验中，PA-MSPQC法所得的结果与MGIT960法所得结果进行统计学分析，得出PA-MSPQC法与MGIT960法没有统计学差异，能准确检测临床结核分枝杆菌菌株对利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素等一线抗结核药物的耐受情况。由于PA-MSPQC法能快速报告实验结果，可以替代传统的培养法用于临床结核分枝杆菌菌株的耐药实验。但是PA-MSPQC同样存在噬菌体感染效率的问题，有可能将未感染噬菌体的结核分枝杆菌当成耐药菌株，影响方法的准确度。因此，优化培养基成分是提高检测方法灵敏度，提高耐药实验准确度的关键。为建立微生物快速传感检测新方法，我们使用石墨烯新材料和核酸序列代替适配体进行初步实验。用化学气相沉积法在铜箔表面制备大面积石墨烯，用拉曼光谱分析在不同气体条件下形成石墨烯的质量，研究氢气流量、温度、基底材料对石墨烯质量的影响，直接制备出可用于电极分析的大面积单层石墨烯。用电化学阻抗谱和循环伏安法研究核酸序列在石墨烯电表面吸附和解离的条件，得出钠的浓度在100mmol/L、镁的浓度在5mmol/L，核酸序列通过π-π堆集作用而吸附，电极表面电子传递阻力增大；在钙、镁离子的存在条件下，吸附的核酸序列与互补序列作用解离，电极表面电子传递阻力减小；电极表面的电子传递阻力的拟合分析得出，电子传递阻力的改变与cDNA浓度成线性关系。适配体是与核酸序列同性质的DNA序列，石墨烯电极和适配体为目标分析物（如病原微生物）的快速传感检测提供可能。
Chinese Antituberculosis Association of Clinic Society[10]（2013）在《结核病临床诊治进展年度报告（2012年）（第一部分结核病临床诊断）》文中提出近一年来,国内外在结核病临床诊断方面取得了诸多进展,不少诊断新方法、新技术得以在临床上开展应用。在细菌学诊断方面,两种新技术包括等温微量热技术及爆轰纳米金刚石技术与传统的培养法相结合,提高了阳性检出率,具有速度快、敏感度和特异度高等优点。分子影像学在肺结核及肺外结核诊断中也取得了较大的进展。γ-干扰素释放试验在菌阴肺结核及肺外结核的诊断方面具有较大优势。2012年结核病分子生物学诊断仍集中在以核酸扩增为核心的检测技术上,而最引人注目的是Xpert Mtb/RIF技术,其在结核病和耐药结核病诊断中取得了丰硕的成果,在儿童结核病及Mtb与HIV双重感染的诊断方面也发挥了重要作用。RNA恒温扩增技术不仅可用于诊断结核病,还可用于疗效的监测。内镜介入诊断部分介绍了呼吸内镜在肺结核、气管支气管结核、纵隔淋巴结结核及胸膜结核诊断中的应用进展。其中支气管内镜超声引导下经支气管针吸活检术引起了国内外学者的极大关注,该方法以其操作技术简单、微创、定位准确、敏感度和特异度高,以及可重复性强等优势,在纵隔及肺门淋巴结结核的诊断中发挥了越来越大的作用。
二、结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性的噬菌体测定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性的噬菌体测定（论文提纲范文）
（1）MDR1基因多态性与耐药结核的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 第二章 MDR1 基因多态性与耐药结核的相关性研究 |
| 2.1 资料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 人类宿主易感基因多态性与结核病和耐药结核病相关的研究综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）结核分枝杆菌耐药特征及其与DNA修复系统Nth基因的关系研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第1章 唐山地区临床分离结核分枝杆菌耐药特征及药物靶基因突变情况分析 |
| 1.1 对象与方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 标本来源 |
| 1.1.3 主要仪器和试剂 |
| 1.1.4 研究方法 |
| 1.1.5 质量控制 |
| 1.1.6 统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 研究对象一般情况 |
| 1.2.2 临床分离菌株耐药情况 |
| 1.2.3 研究对象一般情况与耐药性结核病的相关性分析 |
| 1.2.4 研究对象一般情况与临床株对一线药物耐药的相关性分析 |
| 1.2.5 临床株一线抗结核药物靶基因突变情况 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 DNA修复系统与结核分枝杆菌耐药及基因突变的关系研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂 |
| 2.1.3 研究方法 |
| 2.1.4 质量控制 |
| 2.1.5 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 临床菌株DNA修复系统基因mRNA和蛋白表达水平比较 |
| 2.2.2 药物靶基因突变与DNA修复系统基因表达变化的相关性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 Nth基因与结核分枝杆菌耐药性产生的关系研究 |
| 3.1 对象与方法 |
| 3.1.1 实验对象 |
| 3.1.2 主要仪器和试剂 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 菌株保存 |
| 3.1.5 质量控制 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 标准株H37Rv Nth基因左右臂扩增 |
| 3.2.2 噬菌粒的构建 |
| 3.2.3 分枝杆菌噬菌体的构建 |
| 3.2.4 标准株H37Rv Nth基因敲除菌株的构建 |
| 3.2.5 Nth基因回补及过表达菌株的构建 |
| 3.2.6 单药对H37Rv、Nth敲除株和Nth回补株耐药诱导比较 |
| 3.2.7 单药耐药诱导菌株生长曲线测定和MIC比较 |
| 3.2.8 两药联合对H37Rv、Nth敲除株和Nth回补株耐药诱导比较 |
| 3.2.9 两药联合诱导菌株生长曲线比较 |
| 3.2.10 三药联合对H37Rv、Nth敲除株和Nth回补株耐药诱导比较 |
| 3.2.11 耐药诱导成功的菌株药物靶基因突变情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第4章 综述 |
| 耐药性结核病的威胁和修复系统在结核分枝杆菌中的功能 |
| 4.1 结核病和耐药性结核病流行病学概述 |
| 4.2 结核分枝杆菌耐药机制 |
| 4.3 结核分枝杆菌感染过程中DNA修复基因的表达变化 |
| 4.4 结核分枝杆菌耐药过程中DNA修复系统的表达变化 |
| 4.5 不同修复系统在结核分枝杆菌中的功能 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（3）结核分枝杆菌Cas1和RNA结合蛋白在结核致病及免疫逃逸中的作用（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 CAS1蛋白在结核致病中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 RNA结合蛋白在结核免疫逃逸中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述:结核的免疫逃逸机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士研究生期间发表的学术论文 |
| 攻读博士研究生期间参加的学术会议 |
（4）分枝杆菌三个耐药新基因的鉴定与功能研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 综述 |
| 1 结核菌与抗生素耐药 |
| 2 分枝杆菌细胞膜和细胞壁的重要性 |
| 3 细胞壁结构概述 |
| 3.1 细胞被膜生物合成膜结合蛋白的空间定位 |
| 3.2 其他参与膜结合的蛋白 |
| 3.3 脂肪酸合成 |
| 4 分枝杆菌细胞壁组成 |
| 4.1 肽聚糖 |
| 4.2 阿拉伯半乳聚糖生物合成 |
| 4.3 分枝菌酸 |
| 5 分枝杆菌细胞壁靶点 |
| 5.1 细菌信号转导:磷酸化信号分子 |
| 5.2 分枝杆菌STPKs和磷酸酶 |
| 5.3 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和磷酸酶 |
| 5.4 双组分信号系统 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第2章 绪论 |
| 1 研究目的、选题依据与意义 |
| 2 科学问题 |
| 3 研究内容与技术路线 |
| 第3章 吡嗪酰胺耐药基因的筛选和机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 质粒与菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态的制备 |
| 2.2 吡嗪酰胺敏感菌株筛选 |
| 2.3 质粒拯救法确定突变菌株转座子插入位点 |
| 2.4 提取RNA及分析基因转录 |
| 2.5 构建回补菌株 |
| 2.6 电转耻垢分枝杆菌感受态 |
| 2.7 Western-Blot 检测蛋白表达 |
| 2.8 饥饿胁迫实验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 吡嗪酰胺敏感突变体M492的分离与鉴定 |
| 3.2 M492突变株对抗生素的敏感不是由于生长差异引起的 |
| 3.3 M492 突变株是耻垢分枝杆菌MSMEG_3314 缺失株 |
| 3.4 突变株M492的基因回补菌株的构建 |
| 3.5 MSMEG_3314 基因与结核分枝杆菌EmrB同源性高 |
| 3.6 MSMEG_3314基因缺失可引起氟喹诺酮类药物的杀伤力增强 |
| 3.7 MSMEG_3314基因参与抵抗过氧化氢的杀伤性 |
| 3.8 添加硫脲或2,2′-联吡啶可以抵消或减轻莫西沙星的杀伤力 |
| 3.9 MSMEG_3314基因的缺失与细胞膜通透性改变有关但没有改变细胞壁厚度 |
| 3.10 MSMEG_3314基因缺失增大耻垢分枝杆菌细胞膜电位差 |
| 3.11 RT-PCR发现乙醛酸循环与M492的PZA敏感有关 |
| 3.12 M492突变株的乙醛酸循环速率降低 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第4章 羧酸酯酶CAEA通过分解细胞壁D-ALA-D-ALA导致万古霉素耐受 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 质粒与菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要溶液及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 同源重组法敲除耻垢分枝杆菌MSMEG_4296基因 |
| 2.2 体外扩增结核分枝杆菌Rv2224c基因片段 |
| 2.3 PCR扩增产物的回收 |
| 2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.5 大肠杆菌的热激法转化 |
| 2.6 TA连接Rv2224c基因片段 |
| 2.7 菌液鉴定PCR |
| 2.8 提取T-Rv2224c重组质粒 |
| 2.9 构建pALACE-Rv2224c重组质粒 |
| 2.10 制备耻垢分枝杆菌感受态细胞 |
| 2.11 Western Blot验证Rv2224c在耻垢分枝杆菌中的重组蛋白诱导表达 |
| 2.12 蛋白纯化 |
| 2.13 测定生长曲线 |
| 2.14 滑动实验和菌落形态观察 |
| 2.15 重组耻垢分枝杆菌在不同胁迫下的生存能力分析 |
| 2.16 抑菌圈法测定重组耻垢分枝杆菌在SDS和H2O2压力下的抑菌圈直径 |
| 2.17 测定重组耻垢分枝杆菌在联胺条件下的CFU |
| 2.18 测定重组耻垢分枝杆菌在酸性条件下的CFU |
| 2.19 重组耻垢分枝杆菌耐药性分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Rv2224c基因功能域分析 |
| 3.2 Rv2224c保守性分析 |
| 3.3 耻垢分枝杆菌中MSMEG_4296敲除菌株质粒的构建 |
| 3.4 ΔMSMEG_4296 缺失菌株的筛选和鉴定 |
| 3.5 ΔMSMEG_4296 回补菌株的构建 |
| 3.6 MSMEG_4296敲除不影响生长 |
| 3.7 MSMEG_4296敲除改变分枝杆菌菌落形态 |
| 3.8 MSMEG_4296敲除增强了耻垢分枝杆菌的滑动能力 |
| 3.9 MSMEG_4296敲除减弱了耻垢分枝杆菌生物膜的形成 |
| 3.10 MSMEG_4296敲除能增强万古霉素对耻垢分枝杆菌的杀菌能力 |
| 3.11 Rv2224c过表达能增强耻垢分枝杆菌细胞壁通透性 |
| 3.12 MSMEG_4296敲除能减弱耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第5章 铜离子对结核分枝杆菌耐受莫西沙星等抗生素至关重要 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 质粒与菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂和溶液 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 培养条件与实验菌株 |
| 2.2 MIC测定 |
| 2.3 抗生素CFU检测 |
| 2.4 耻垢分枝杆菌突变体库的构建 |
| 2.5 测定细菌胞内NADH浓度 |
| 2.6 测定细菌胞内铜离子浓度 |
| 3 实验结果 |
| 3.1构建突变体库,筛选获得在高铜浓度下耐受的突变体X674 |
| 3.2 MSMEG_4702敲除后减弱了耻垢分枝杆菌的生长 |
| 3.3 添加铜离子能恢复MSMEG_4702敲除菌株的生长 |
| 3.4 添加铜离子能恢复MSMEG_4702敲除菌株的生长 |
| 3.5 MSMEG_4702敲除菌株细胞内铜离子浓度下降 |
| 3.6 耻垢分枝杆菌单菌落形态随胞内铜离子浓度而改变 |
| 3.7 MSMEG_4702负责铜离子的摄入而不是其它金属离子 |
| 3.8 敲除 MSMEG_4702增加对铁硫簇合成的保护作用 |
| 3.9 MSMEG_4702的敲除增强耻垢分枝杆菌对莫西沙星的耐受 |
| 3.10 MSMEG_4702的敲除增强巨噬细胞中耻垢分枝杆菌的生存 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 博士期间的学术成果 |
| 致谢 |
（5）基于全基因组测序的结核病传播及耐药特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 基于全基因组测序的西藏结核病传播特征分析 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 对象和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 西藏结核分枝杆菌菌株的基本信息 |
| 1.3.2 西藏成簇菌株影响因素分析 |
| 1.3.3 西藏结核病跨区传播情况 |
| 1.3.4 西藏结核病传播簇大小与初复治的相关性 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 基于全基因组测序的中国耐多药结核分枝杆菌耐药突变特征分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 对象和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 结核分枝杆菌中MDR菌株分布情况 |
| 2.3.2 MDR菌株耐药特点 |
| 2.3.3 GenoType MTBDRplus和 MTBDRsI检测效果评价 |
| 2.3.4 遗传背景与耐药突变的相关性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的科研成果 |
| 致谢 |
（6）西北部分地区牛源分枝杆菌的分离鉴定及耐药性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 牛结核病流行特征研究 |
| 1.2 结核分枝杆菌耐药性研究 |
| 1.3 结核分枝杆菌基因分型技术研究 |
| 1.4 非结核分枝杆菌的流行情况 |
| 1.5 本课题的研究意义 |
| 第二章 牛源分枝杆菌的复壮及初步鉴定 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 分析与讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛源结核分枝杆菌基因分型及表型耐药特征研究 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 牛源结核分枝杆菌相关耐药基因突变特征分析 |
| 4.1 材料及试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 牛源非结核分枝杆菌临床株的鉴定 |
| 5.1 材料及试剂 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 分析与讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一: 结核分枝杆菌MIRU-VNTR15位点拷贝数 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）乙胺丁醇与异烟肼协同抑制结核分枝杆菌生长的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 结核病及治疗策略 |
| 1.1.1 结核病治疗策略 |
| 1.1.2 联合用药的重要性 |
| 1.2 抗结核药物杀菌及分枝杆菌耐药机制 |
| 1.2.1 抗结核药物杀菌机制 |
| 1.2.2 结核分枝杆菌耐药菌株的产生 |
| 1.2.3 结核分枝杆菌耐药机制 |
| 1.3 基因表达调控与分枝杆菌耐药性的关系 |
| 1.3.1 基因表达调控及其分类 |
| 1.3.2 基因表达调控对分枝杆菌耐药性产生的贡献 |
| 1.4 TetR/AcrR家族转录因子 |
| 1.4.1 TetR/AcrR家族转录因子结构 |
| 1.4.2 TetR/AcrR家族转录因子调控机制 |
| 1.4.3 TetR/AcrR家族转录因子生理功能 |
| 1.5 转录因子作为新型药物靶标的前景 |
| 1.6 本研究目的、意义和思路 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 供试质粒 |
| 2.1.3 抗生素 |
| 2.1.4 酶和试剂盒 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.1.6 缓冲液及试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 EtbR和InhA相关基因的引物设计和PCR扩增反应 |
| 2.2.2 蛋白质表达纯化 |
| 2.2.3 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 2.2.4 凝胶迁移阻滞实验(EMSA) |
| 2.2.5 DNA足迹实验(DNaseⅠFootprinting) |
| 2.2.6 表面等离子共振(SPR) |
| 2.2.7 等温滴定量热实验(ITC) |
| 2.2.8 RNA抽提及实时定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.2.9 β-半乳糖甘酶活性分析 |
| 2.2.10 分枝杆菌的基因敲除实验 |
| 2.2.11 最小抑菌浓度测定(MIC) |
| 2.2.12 分枝杆菌生长曲线的测定 |
| 2.2.13 药物胁迫下胞内结核分枝杆菌生存率分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 非致死浓度的乙胺丁醇增加分枝杆菌的异烟肼敏感性 |
| 3.1.1 EtbR影响分枝杆菌的异烟肼敏感性 |
| 3.1.2 EtbR是一个TetR/AcrR家族转录因子 |
| 3.1.3 EtbR在分枝杆菌中高度保守 |
| 3.2 EtbR识别其自身及inhA基因上游一个20 bp的保守结合位点 |
| 3.2.1 EtbR蛋白质的纯化 |
| 3.2.2 EtbR在体外特异性结合自身启动子和inhA基因上游的调控序列 |
| 3.2.3 EtbR在细菌细胞内结合自身启动子和inhA基因上游的调控序列 |
| 3.2.4 EMSA截短实验鉴定EtbR的结合区域 |
| 3.2.5 DNA足迹法鉴定EtbR识别一个20 bp的保守结合位点 |
| 3.3 EtbR是一个转录抑制子,负调控inhA基因的表达 |
| 3.3.1 EtbR超表达菌株和敲除菌株的构建 |
| 3.3.2 实时定量PCR检测EtbR负调控inhA基因的表达 |
| 3.3.3 β-半乳糖甘酶活性实验检测EtbR负调控inhA基因的表达 |
| 3.4 EtbR能特异性结合乙胺丁醇 |
| 3.4.1 ITC(等温量热滴定法)证实EtbR与乙胺丁醇存在相互作用 |
| 3.4.2 SPR(表面等离子共振)证实EtbR与乙胺丁醇存在相互作用 |
| 3.5 EMB能促进EtbR的 DNA结合活性 |
| 3.5.1 EMSA实验证明EMB促进EtbR的 DNA结合活性 |
| 3.5.2 SPR实验证明EMB促进EtbR的 DNA结合活性 |
| 3.5.3 定量分析EMB促进EtbR的 DNA结合活性 |
| 3.6 EMB能促进EtbR的转录抑制活性 |
| 3.6.1 β-半乳糖甘酶活性实验验证EMB促进EtbR的转录抑制活性 |
| 3.6.2 qRT-PCR检测EMB胁迫下BCG中 inhA基因的表达水平 |
| 3.7 EtbR增强分枝杆菌中乙胺丁醇介导的异烟肼敏感性 |
| 3.7.1 EtbRMtb增强BCG对异烟肼的敏感性 |
| 3.7.2 EtbRMtb增强BCG中乙胺丁醇介导的异烟肼敏感性 |
| 3.7.3 EtbRMsm增强耻垢分枝杆菌对异烟肼的敏感性 |
| 3.7.4 EtbRMsm增强耻垢分枝杆菌中乙胺丁醇介导的异烟肼敏感性 |
| 3.8 超表达EtbR使药物胁迫下分枝杆菌在小鼠巨噬细胞中的存活率降低 |
| 4 总结与讨论 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 EtbR介导的乙胺丁醇和异烟肼联合使用机制 |
| 4.2.2 EtbR是一个新型的转录抑制子,结合EMB负调控inhA基因的表达. |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
（8）贝达喹啉、德拉马尼和氯法齐明对非结核分枝杆菌体外抑菌活性的测定（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 菌株来源 |
| 技术路线 |
| 第一部分 菌种鉴定与药物敏感性测定 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 药物 |
| 1.4 实验中各种溶液及培养基的配制 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 第二部分 基因突变与耐药的相关性分析 |
| 1.材料方法 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验中溶液及培养基的配制 |
| 1.4 实验方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 AtpE基因比对结果 |
| 2.2 MarR基因比对结果 |
| 3.讨论 |
| 综合结论 |
| 参考文献 |
| 非结核分枝杆菌药敏试验及其研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
（9）新型噬菌体压电传感器快速检测结核分枝杆菌的机理及其药敏应用效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景和意义 |
| 1.2 结核分枝杆菌检测的历史与现状 |
| 1.2.1 涂片检测 |
| 1.2.2 培养检测 |
| 1.2.3 血清学检测方法 |
| 1.2.4 分子生物学方法 |
| 1.3 结核分枝杆菌的耐药检测 |
| 1.3.1 结核分枝杆菌耐药的分子机理 |
| 1.3.2 耐药菌株的检测方法 |
| 1.4 压电传感技术的进展 |
| 1.4.1 压电传感器原理和构建 |
| 1.4.2 压电传感器的分类 |
| 1.4.3 触液式压电传感器的应用 |
| 1.4.4 气相压电传感器的响应特点和应用 |
| 1.5 本文研究的主要内容 |
| 第二章 结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌压电检测体系的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 分枝杆菌和耻垢分枝杆菌悬液的制备 |
| 2.2.2 不同糖类的YC培养基的制备 |
| 2.2.3 仪器设备 |
| 2.2.4 实验步骤 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 压电石英晶体传感器的构建和电参数响应特性 |
| 2.3.2 结核分枝杆菌在不同培养基中信号的代谢机理 |
| 2.3.3 耻垢分枝杆菌在不同培养基中信号的代谢机理 |
| 2.3.4 结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌在YC和M7H9 上的生长信号差异 |
| 2.3.5 耻垢分枝杆菌在M7H9 培养基中的响应机理 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 噬菌体D29 与耻垢分枝杆菌作用的生物学特性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 仪器与试剂 |
| 3.2.1 试剂与菌株 |
| 3.2.2 仪器与设备 |
| 3.3 实验部分 |
| 3.3.1 耻垢分枝杆菌增殖培养方法 |
| 3.3.2 结核分枝杆菌培养保存方法 |
| 3.3.3 噬菌体的增殖培养方法 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 噬菌体D29 的化学和物理特性 |
| 3.4.2 耻垢分枝杆菌吸附噬菌体D29 的位点分析 |
| 3.4.3 噬菌体D29 在耻垢分枝杆菌中的一步生长曲线 |
| 3.4.4 pH对噬菌体在不同培养基中稳定性的影响 |
| 3.4.5 阳离子对噬菌体D29 吸附宿主细胞的影响 |
| 3.4.6 Tween 80 对噬菌体D29 与耻垢分枝杆菌作用的影响 |
| 3.4.7 硫酸亚铁铵浓度的选择 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 噬菌体放大多通道压电石英传感器快速灵敏检测结核分枝杆菌 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 检测培养基和样品处理 |
| 4.2.2 MSPQC检测系统和BACTEC MGIT960 系统 |
| 4.2.3 实验步骤 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 噬菌体放大多通道压电传感器的构建 |
| 4.3.2 噬菌体D29 浓度对耻垢分枝杆菌生长信号的影响 |
| 4.3.3 耻垢分枝杆菌浓度对频移响应曲线的影响 |
| 4.3.4 钙离子对噬菌体D29 与耻垢分枝杆菌之间作用的影响 |
| 4.3.5 PA- MSPQC检测结核分枝杆菌的典型响应曲线 |
| 4.3.6 阳性样本鉴别标准和检测方法下限的确定 |
| 4.3.7 临床样本的检测 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 噬菌体压电传感器快速检测结核分枝杆菌药物敏感实验 |
| 5.1 引言 |
| 5.1.1 分子生物学检测方法 |
| 5.1.2 突变位点基因的检测方法 |
| 5.1.3 表型分析方法 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂与菌株 |
| 5.2.2 仪器与设备 |
| 5.3 实验步骤 |
| 5.3.1 噬菌体溶液的制备 |
| 5.3.2 耻垢分枝杆菌菌悬液 |
| 5.3.3 痰样试液的制备 |
| 5.3.4 实验菌株耐药的处理 |
| 5.3.5 药物作用效果的检测 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 药物敏感性判定的依据 |
| 5.4.2 四种抗结核药物的噬菌体压电响应曲线 |
| 5.4.3 结核菌株耐药和敏感的判定标准 |
| 5.4.4 PA-MSPQC法与MGIT法药敏结果的比较 |
| 5.4.5 PA-MSPQC法与MGIT 960 法检测临床菌株报告时间的比较 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 无标记ssDNA在大面积单层石墨烯电极上吸附解离的电化学阻抗谱分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验仪器与试剂 |
| 6.2.1 实验仪器 |
| 6.2.2 实验部分 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 化学气相沉积法在铜基底上制备石墨烯的原理 |
| 6.3.2 化学气相沉积法制备石墨烯的主要影响因素 |
| 6.3.3 氢气浓度对石墨烯质量的影响 |
| 6.3.4 石墨烯电极的循环伏安研究 |
| 6.3.5 石墨烯探针DNA电极与目标DNA作用的电化学阻抗谱 |
| 6.3.6 ssDNA在石墨烯表面吸附的影响因素 |
| 6.3.7 ssDNA在石墨烯表面吸附作用力分析 |
| 6.3.8 氧化石墨烯与石墨烯在与ssDNA作用上的差别 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读博士学位期间所发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）结核病临床诊治进展年度报告（2012年）（第一部分结核病临床诊断）（论文提纲范文）
| 一、结核病细菌学诊断 |
| (一) 涂片和培养法 |
| (二) 抗Mtb药物药敏试验 |
| 1. 传统抗Mtb药物药敏试验: |
| 2. 几种抗Mtb药物药敏检测新方法的评价: |
| 二、结核病影像学诊断 |
| (一) 活动性肺结核的影像学诊断 |
| (二) 肺结核与非结核分枝杆菌肺病的影像学诊断 |
| (三) 肺结核CT灌注成像 |
| (四) 尘肺合并肺结核的影像学诊断 |
| (五) 肺结核合并肺癌的影像学诊断 |
| (六) HIV感染和 (或) AIDS伴Mtb双重感染的影像学表现 |
| (七) MRI在胸部结核病诊断与鉴别中的应用 |
| (八) 氟代脱氧葡萄糖正电子发射计算机体层摄影术与计算机体层摄影术在结核病诊断及治疗中的应用 |
| (九) 肺外结核的影像学诊断 |
| 1. 结核性脑膜炎 (简称“结脑”) : |
| 2. 其他肺外结核: |
| (十) 分子影像学在肺结核及肺外结核诊断中的应用 |
| 三、结核病的免疫学诊断 |
| (一) 结核病细胞免疫学诊断 |
| 1. γ-干扰素释放试验 (interferon-gamma release assays, IGRAs) 在结核病诊断中的应用: |
| 2. 腺苷脱氨酶 (ADA) 联合IGRAs在结核病诊断中的应用: |
| 3. T细胞特异性抗原的应用: |
| 4. T细胞免疫相关细胞因子的测定: |
| (二) 结核病血清学诊断 |
| (三) 其他方法在结核病诊断中的应用 |
| 四、结核病分子生物学诊断 |
| (一) Xpert Mtb/RIF技术 |
| (二) 分子线性探针测定法 (molecular line probe assays) |
| (三) 多重PCR (multiplex PCR) 检测技术 |
| (四) 实时PCR技术 |
| (五) 恒温扩增检测技术 |
| (六) 基因芯片技术 |
| (七) 其他分子生物学方法 |
| 五、内镜介入诊断在结核病中的应用 |
| (一) 肺结核 |
| (二) 气管支气管结核 |
| (三) 纵隔及肺门淋巴结结核 |
| (四) 胸膜结核 |
四、结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性的噬菌体测定（论文参考文献）
- [1]MDR1基因多态性与耐药结核的相关性研究[D]. 魏清雯. 兰州大学, 2021(09)
- [2]结核分枝杆菌耐药特征及其与DNA修复系统Nth基因的关系研究[D]. 任琦. 华北理工大学, 2020(01)
- [3]结核分枝杆菌Cas1和RNA结合蛋白在结核致病及免疫逃逸中的作用[D]. 魏家玮. 重庆医科大学, 2020(01)
- [4]分枝杆菌三个耐药新基因的鉴定与功能研究[D]. 许峻旗. 西南大学, 2020
- [5]基于全基因组测序的结核病传播及耐药特征分析[D]. 高敏. 南华大学, 2020(01)
- [6]西北部分地区牛源分枝杆菌的分离鉴定及耐药性分析[D]. 程成. 宁夏大学, 2019
- [7]乙胺丁醇与异烟肼协同抑制结核分枝杆菌生长的分子机制研究[D]. 朱晨. 华中农业大学, 2018(01)
- [8]贝达喹啉、德拉马尼和氯法齐明对非结核分枝杆菌体外抑菌活性的测定[D]. 罗晶晶. 北京市结核病胸部肿瘤研究所, 2018(04)
- [9]新型噬菌体压电传感器快速检测结核分枝杆菌的机理及其药敏应用效果的研究[D]. 米贤文. 湖南大学, 2013(09)
- [10]结核病临床诊治进展年度报告（2012年）（第一部分结核病临床诊断）[J]. Chinese Antituberculosis Association of Clinic Society. 中国防痨杂志, 2013(06)