一、凋亡调节基因bcl-2和bax在肺鳞癌中的表达（论文文献综述）
方世旭[1]（2021）在《PAQR3逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药机制研究》文中提出目的:通过生物信息学及细胞实验验证PAQR3在非小细胞肺癌顺铂敏感株及顺铂耐药株的表达差异。通过实验探索PAQR3对非小细胞肺癌顺铂耐药株A549/DDP细胞增殖,迁移,凋亡及顺铂耐药的影响,并初步探讨该影响机制是否与Ras/Raf/MEK/ERK信号通路有关。方法:1.在GEO数据库中搜索基因芯片,筛选A549细胞及A549/DDP细胞中的差异表达基因,并选出存在差异表达的基因PAQR3进行研究。2.在Kaplan-Meier Plotter数据库中检索PAQR3在肺癌中的表达水平与患者预后的相关性。3.通过蛋白印迹（Western Blot,WB）及实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-q PCR）检测A549及A549/DDP细胞中PAQR3的表达水平。其次,用带有PAQR3高表达及低表达的慢病毒转染A549/DDP细胞,构建A549/DDP细胞的PAQR3高表达稳定转染细胞株（oe-PAQR3）、高表达对照组（oe-NC）、低表达稳定转染细胞株（Si-PAQR3）、低表达对照组（Si-PAQR3）。与A549/DDP细胞对比,MTT实验检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,克隆形成实验检测单个细胞的增殖能力,MTT实验检测细胞的顺铂耐药,流式细胞检测术检测细胞的周期及凋亡情况。4.WB实验检测Ras/Raf/MEK/ERK信号级联中相关信号蛋白改变情况,探索该信号通路在PAQR3逆转顺铂耐药所发挥的作用,检测细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3。同时,检测MDR1、MRP1、γ-H2A.X及LRP1等DNA损伤修复相关蛋白的表达水平。结果:1.在GEO数据库中筛选得到A549及A549/DDP差异表达的芯片数据集（GSE108214）,通过GEO2R在线分析软件,与A549细胞对比,PAQR3基因在A549/DDP中呈低表达（Log FC=-0.955）,差异有统计学意义（P<0.001）。2.在Kaplan-Meier Plotter数据库中,检测到965例患者为PAQR3低表达患者,960例患者为PAQR3高表达患者,生存预后的值分别为:总生存期（Overall Survival,OS）的危险比（Hazard Ratio,HR）为0.87,95%置信区间（Confidence Interval,CI）为0.76-0.98,P<0.05;首次疾病进展期（First Progression,FP）的HR为0.81,95%CI:0.67-0.98,P<0.05,后进展生存期（Post Progression Survival,PPS）的HR为0.85,95%CI:0.66-1.1,P=0.22。提示低表达PAQR3与不良的癌症预后显着相关。3.WB及RT-qPCR结果显示,与A549细胞相比,PAQR3在A549/DDP细胞的表达量显着下调（P<0.05）。4.细胞功能实验结果显示,高表达PAQR3可抑制A549/DDP细胞的增殖、迁移和克隆形成,促进A549/DDP细胞凋亡,阻滞细胞从G1期向S期转变。相反,低表达PAQR3可促进A549/DDP细胞增殖、迁移和克隆形成,阻止细胞凋亡,促进细胞由G1向S期转变。5.MTT实验结果显示,A549细胞顺铂药物半数抑制浓度（50%of Inhibiting Concentration,IC50）为6.314μg/m L,A549/DDP细胞的IC50为21.49μg/m L,耐药指数为3.403。与A549/DDP细胞相比,构建了过表达的A549/DDP细胞对顺铂的敏感性显着增加,oe-NC的IC50为21.84μg/m L,oe-PAQR3组的IC50为5.257μg/m L,耐药指数为4.1544,差距有统计学意义。与Si-NC组相比,Si-PAQR3组的A549/DDP细胞对顺铂的敏感性下降,Si-NC的IC50为23.5μg/m L,Si-PAQR3组的IC50为47.56μg/m L,耐药指数为0.4941,差异有统计学意义（P<0.01）。6.WB实验结果显示,高表达PAQR3可下调b-Raf、P-b-Raf、P-MEK1/2、P-ERK1/2的表达,抑制Ras/Raf/MEK/ERK信号通路而提高A549/DDP细胞对顺铂敏感性,低表达的PAQR3可上调b-Raf、P-b-Raf、P-MEK1/2、P-ERK1/2的表达,激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路,降低A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。同时,高表达PAQR3可上调Bax、Caspase-9、Caspase-3的表达,下调Bcl-2的表达,促进细胞凋亡达到逆转顺铂耐药的效果。低表达PAQR3可下调Bax、Caspase-9、Caspase-3的表达,上调Bcl-2的表达,使细胞凋亡受阻,增强细胞对顺铂的耐药性。高表达PAQR3可上调MDR1、MRP1、γ-H2A.X,提高A549/DDP细胞对顺铂的敏感性,低表达PAQR3可下调MDR1、MRP1,降低A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。结论:1.与A549细胞相比,PAQR3在A549/DDP细胞显着低表达,PAQR3高表达可增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性,低表达的PAQR3可增加A549/DDP细胞对顺铂的耐药性。2.PAQR3可能通过阻滞Ras/Raf/MEK/ERK通路及下调MDR1,MRP1,γ-H2A.X蛋白等逆转A549/DDP对顺铂的耐药。可能通过激活Bax/Bcl-2/Caspase-9/Caspase-3信号通路阻止A549/DDP细胞的增殖,迁移及克隆形成,阻滞细胞周期,促进细胞凋亡。
王知广[2]（2021）在《miRNA 182-5p靶向NOX4/DRP1/NLRP3信号轴缓解哮喘气道炎症的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理背景:支气管哮喘是由多种细胞（嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、支气管上皮细胞、支气管平滑肌细胞）及细胞因子参与的气道慢性炎症性疾病,其特征为气道慢性炎症、气道高反应性以及气道重塑。气道上皮细胞是气道屏障结构中重要的组成部分,当气道上皮细胞出现损伤、凋亡时,会导致气道完整性遭到破坏,气管通透性增加,分泌趋化因子诱导炎症细胞聚集,加重胶原沉积等,深入研究上皮细胞损伤过程,找到关键靶点成为治疗关键。在上皮细胞受损过程中,过度的氧化应激促进线粒体损伤、激活线粒体凋亡过程可能是上皮细胞出现凋亡的主要途径。NOX4是内源性活性氧（ROS）生成的关键蛋白,在外源性刺激过程中NOX4诱导内源性ROS产生增加,产生氧化应激,同时损伤线粒体,受损的线粒体引起膜电位降低,释放细胞色素C（Cytochrome C）,激活线粒体凋亡途径,同时受损的线粒体可以激活NLRP3/IL-1β加重炎症反应。线粒体功能同时也受线粒体形态学改变,其中线粒体过度裂变是促进线粒体功能受损的重要因素,线粒体裂变受线粒体裂变蛋白Drp1调控。鉴于此,上皮损伤中,NOX4可能通过调控Drp1促进线粒体损伤,激活线粒体凋亡途径和NLRP3炎症小体,加重气道炎症。miRNA是长约18-23个核苷酸大小的非编码RNA,目前miRNA在支气管哮喘中对于诊断、治疗靶点、疗效判断等方面均具有巨大的研究潜力。筛选出差异表达的miRNA,靶向调控促进哮喘疾病进展的关键蛋白,可能是改善哮喘气道炎症的新的治疗方法。目的:阐明IL-13通过NOX4/Drp1/NLRP3促进上皮细胞炎症反应,并激活线粒体凋亡途径诱导上皮细胞凋亡。明确mi R-182-5P通过靶向Nox4表达改善上皮细胞损伤过程并延缓哮喘气道炎症。方法:第一部分:体内实验:构建OVA诱导的慢性哮喘模型,分别为正常组（Con）、哮喘组（OVA）。观察指标:（1）利用不同浓度Ach吸入激发测定气道高反应性;（2）流式细胞仪测定BALF中嗜酸性粒细胞百分比;（3）ELISA法检测BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平;（4）肺组织石蜡进行HE、PAS、Masson染色法观察肺组织的病理学改变;（7）组织免疫化学染色观察NOX4在肺组织表达情况。体外实验:IL-13刺激BEAS-2B构建上皮细胞损伤模型,分别使用siNOX4,Drp1抑制剂Mdivi-1预处理上皮细胞。观察指标:（1）流式细胞仪测定细胞内ROS、MMP、mt ROS、凋亡水平;（2）ATP检测试剂测定细胞内ATP表达含量;（3）细胞荧光观察细胞内ROS、MMP、mt ROS、IL-1β、线粒体形态学变化;（4）Western Blot检测NOX4、Drp1、p-Drp1（Ser616）、NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、IL-1β、Bcl-2、BAX、Cytochrome C、Cleaved-Caspase-9、CleavedCaspase-3蛋白表达水平。第二部分:体内实验:构建OVA诱导的慢性哮喘模型,分别为正常组（Con）、哮喘组（OVA）。观察指标:（1）基因芯片分析Con组和OVA组中miRNA表达差异,绘制聚类图并进行靶基因预测;（2）RT-q PCR验证组织中mi R-182-5P、NOX4 mRNA表达变化。体外实验:IL-13刺激BEAS-2B构建上皮细胞损伤模型,mi R-182-5P mimic/NC预处理上皮细胞。观察指标:（1）RT-q PCR验证细胞中mi R-182-5P、NOX4 mRNA表达变化;（2）双荧光素酶报告基因明确mi R-182-5P与NOX4 mRNA的靶向关系;（3）流式细胞仪测定细胞内ROS、MMP、mt ROS、凋亡水平;（4）ATP检测试剂测定细胞内ATP表达含量;（5）细胞荧光观察细胞内ROS、MMP、mt ROS、IL-1β、线粒体形态学变化;（6）Western Blot检测NOX4、Drp1、p-Drp1（Ser616）、NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、IL-1β、Bcl-2、BAX、Cytochrome C、Cleaved-Caspase-9、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平。第三部分:构建OVA诱导的慢性哮喘模型,分成4组,分别为正常组（Con）、哮喘组（OVA）、哮喘+mi R-182-5P NC组（OVA+mi R-182-5P NC）、哮喘+mi R-182-5P agomir组（OVA+mi R-182-5P agomir）。观察指标:（1）利用不同浓度Ach吸入激发测定气道高反应性;（2）流式细胞仪测定BALF中嗜酸性粒细胞所占百分比;（3）ELISA法检测小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平;（4）组织荧光观察NOX4在肺组织表达情况;（5）RT-q PCR验证组织中NOX4 mRNA表达变化;（6）肺组织石蜡行HE、PAS、Masson染色、冰冻组织切片行DHE染色观察肺组织样品中病理改变;（7）Western Blot检测NOX4、NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1、IL-1β、Bcl-2、BAX、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3的蛋白表达。结果第一部分:（1）OVA组表现出明显的气道高反应性,BALF中嗜酸性粒细胞比例升高,Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-13表达上升;组织病理染色中OVA组中气道周围可见明显炎症细胞聚集、浸润,气道结构破坏,杯状细胞明显增生,胶原沉积明显伴有气道壁的增厚。（2）IL-13刺激BEAS-2B后NOX4蛋白表达升高,细胞内ROS水平明显增加。（3）IL-13诱导线粒体裂变蛋白Drp1、p-Drp1（Ser616）水平明显升高,Drp1蛋白由细胞质转至线粒体内,线粒体形态呈碎裂样改变,线粒体功能受损,MMP水平降低,ATP合成减少,mt ROS表达增加。（4）IL-13诱导BEAS-2B上皮细胞NLRP3炎症小体激活,NLRP3、ASC、CleavedCaspase-1和IL-1β表达增加,同时伴随着凋亡水平明显增加,凋亡相关蛋白存在变化,包括Bcl-2的下降,BAX、Cytochrome C、Cleaved-Caspase-9、CleavedCaspase-3表达增加。（5）经si-NOX4预处理后细胞内ROS水平降低,同时抑制Drp1、p-Drp1（Ser616）水平,抑制Drp1由细胞质转至线粒体内,恢复了部分线粒体网格样改变。（6）给予Drp1抑制剂Mdivi-1后,抑制Drp1、p-Drp1（Ser616）水平,部分逆转线粒体碎裂表现,同时恢复线粒体功能,改善了MMP的降低及ATP的合成,降低mt ROS表达。（7）Mdivi-1抑制NLRP3炎症小体激活,NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1和IL-1β表达减少;Mdivi-1抑制上皮细胞凋亡,Bcl-2水平上升,BAX、Cytochrome C、Cleaved-Caspase-9、Cleaved-Caspase-3蛋白水平减少。第二部分:（1）OVA模型中芯片分析结果显示有63个miRNA在组间表达变化,50个miRNA在OVA组中升高,13个miRNA降低,miRNA 182-5p在OVA组中降低。靶基因预测结果显示miRNA-182-5p靶向NOX4 mRNA序列,RT-q PCR结果显示miRNA-182-5p表达出现降低,NOX4 mRNA表达增加,两者在表达水平上呈负相关。（2）双荧光素酶报告基因结果提示miRNA-182-5p直接靶向NOX4 mRNA3’UTR区,抑制NOX4的转录。（3）转染miRNA-182-5p mimic后NOX4 mRNA及蛋白水平均出现降低,降低细胞内ROS水平,抑制Drp1表达,抑制线粒体过度裂变并恢复线粒体功能,改善MMP降低及ATP合成,抑制mt ROS表达。（4）转染miRNA-182-5p mimic后抑制NLRP3炎症小体激活,NLRP3、ASC、Cleaved-Caspase-1和IL-1β表达减少,抑制上皮细胞凋亡,Bcl-2水平上升,BAX、Cytochrome C、Cleaved-Caspase-9、Cleaved-Caspase-3蛋白水平减少。第三部分:（1）建立OVA哮喘模型,miRNA-182-5p agomir干预后,肺组织NOX4 mRNA及蛋白水平均出现降低。（2）miRNA-182-5p agomir降低OVA模型中NLRP3/IL-1β蛋白表达。（3）miRNA-182-5p agomir降低OVA模型中凋亡相关蛋白BAX、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3的表达。（4）miRNA-182-5p agomir抑制哮喘气道阻力,改善哮喘小鼠的气道高反应性。（5）miRNA-182-5p agomir降低哮喘模型BALF中嗜酸性粒细胞的百分比,同时减少BALF中Th2型炎症因子IL-4、IL-5、IL-13的表达。（6）miRNA-182-5p agomir抑制哮喘模型中ROS的升高,明显改善了炎症细胞聚集及浸润,减轻了气道壁的增厚,延缓杯状细胞增生及胶原沉积。结论:1.IL-13刺激BEAS-2B细胞过程中NOX4表达增高,促进ROS生成介导线粒体裂变,诱导线粒体功能受损。2.IL-13通过NOX4/DRP1/NLRP3信号轴促进IL-1β的释放加重炎症反应,同时诱导上皮细胞凋亡,其凋亡途径是线粒体凋亡途径。3.OVA哮喘模型中存在差异miRNA,其中miRNA-182-5p靶向NOX4 mRNA,miRNA-182-5p mimic在体外模型中抑制NOX4/DRP1/NLRP3信号轴减轻IL-1β的释放并抑制细胞凋亡。4.在体内模型中,miRNA-182-5p agomir可以抑制由OVA诱导的气道慢性炎症,减少炎症细胞浸润,杯状细胞增生及胶原沉积,miRNA-182-5p可能是哮喘治疗的新靶点。
扶剑,潘征夏,吴春,林芳[3]（2021）在《天麻素通过调控miR-150-5p/NDRG2通路对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞损伤的保护作用研究》文中提出目的研究天麻素（Gas）是否通过调控miR-150-5p/N-myc下游调节基因2（NDRG2）通路进而对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞损伤发挥保护作用。方法将肺泡上皮细胞（A549）分为对照组、感染组、感染+Gas-低组、感染+Gas-中组、感染+Gas-高组、感染+anti-miR-NC组、感染+anti-miR-150-5p组、感染+Gas+miR-NC组和感染+Gas+miR-150-5p组。酶联免疫吸附试验试（ELISA）检测细胞培养液中白细胞介素10（IL-10）和IL-6的表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miR-150-5p和NDRG2 mRNA的表达水平;蛋白质印记（Western blot）检测NDRG2蛋白、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）和活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cleaved-Caspase-3）的表达水平。双荧光素酶报告基因实验和Western blot验证miR-150-5p和NDRG2的靶向调控关系。结果与对照组比较,感染组A549细胞培养液中IL-6含量明显升高,IL-10含量明显降低,细胞凋亡率明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;与感染组比较,感染+Gas组A549细胞IL-6含量、Bax、cleaved-Caspase-3和miR-150-5p的表达降低,IL-10含量、Bcl-2和NDRG2的表达升高,细胞凋亡率降低,并呈剂量反应关系,有统计学意义（P<0.05）。NDRG2与感染+anti-miR-NC组比较,感染组+anti-miR-150-5p组A549细胞IL-6含量、Bax和miR-150-5p的表达降低,IL-10含量、Bcl-2和NDRG2的表达升高,细胞凋亡率降低（P<0.05）;与感染+Gas+miR-NC组比较,感染+Gas+miR-150-5p组A549细胞IL-6含量、Bax和miR-150-5p的表达升高,IL-10含量、Bcl-2和NDRG2的表达降低,细胞凋亡率升高,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 Gas可能通过下调miR-150-5p/NDRG2通路表达对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞损伤具有一定的保护作用。
胡博[4]（2021）在《长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究》文中研究说明背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种原发性肝脏恶性肿瘤,在世界范围内发病率高、治疗效果欠佳。随着靶向治疗药物如索拉非尼、伦伐替尼,以及免疫治疗药物如免疫检查点抑制剂的出现,其预后得到一定的改善,但5年生存率仍旧不高。竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）揭示了RNA间相互作用的新机制,即以长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）为主的非编码RNA通过竞争性共享微小RNA（microRNA,miRNA）来调节mRNA（messenger RNA,信使RNA）的表达,这种调节机制在癌症的发病机理中扮演了重要的角色。但是,ceRNA在HCC中的功能作用及调节机制仍未被完全解释,新的ceRNA调控轴亟待探究。lncRNA CYTOR是一种已被证实在多种肿瘤中发挥促进细胞增殖、迁移等作用的非编码基因,并可作为多种miRNA的内源性海绵。然而,lncRNACYTOR作为ceRNA在HCC发生、发展中的作用及调控网络目前仍不十分清楚。因此,本研究以lncRNACYTOR为起点,探索ceRNA调节机制在HCC中的应用。材料与方法:通过检索癌症基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）,获得人类HCC的lncRNA、mRNA和miRNA数据集表达数据和相应临床信息。下载基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database,GEO）数据库中GSE62232和GSE84402的HCC相关RNA数据用于后续验证。借助在线数据分析工具,分析lncRNA CYTOR在多种肿瘤类型及HCC相关数据集中的表达情况。借助R语言分析lncRNA CYTOR在TCGA数据库中HCC肿瘤组织及癌旁正常肝组织中的差异表达情况,以及其表达水平与TCGA数据库HCC患者总生存期（overall survival,OS）之间的关系。分析lncRNA CYTOR与常用临床病理参数,如性别、年龄、肿瘤分级、临床分期和T、N、M分期之间的关联性,并进一步整合这些参数,通过单因素及多因素Cox回归分析探究lncRNA CYTOR独立预测患者预后的能力。之后,识别TCGA数据库HCC样品中差异表达的miRNA,同时使用ENCORI软件（starbase3.0）预测目标lncRNA的靶向的miRNA,选择差异分析中表达下调的miRNA与预测的miRNA做交集后得出候选miRNA。同理,基于TCGA数据库分析HCC样品中差异表达的mRNA,并基于ENCORI软件使用6个数据库（PITA、miRNAmap、DIANA-microT、miRanda、PicTar 和 TargetScan）预测候选 miRNA 靶向的mRNA,选择差异分析中表达上调的mRNA与预测的mRNA做交集后得出候选的mRNA。使用基因集富分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）来识别与所筛选出的mRNA高表达相关的基因集和通路途径,探索其潜在的功能。结果:lncRNACYTOR在多种癌症的肿瘤组织（如结肠癌、肾透明细胞癌、膀胱尿路上皮癌等）及多个HCC相关数据集中（如GSE54236、GSE64041、GSE36376等）相较于癌旁组织表达上调。在TCGA数据库中,与癌旁正常组织相比,HCC组织中的lncRNACYTOR表达水平显着增高（P<0.001）;且高表达患者组的OS较低表达患者组显着缩短（P<0.001）。临床病理参数关联性分析显示,lncRNACYTOR的表达水平与病理分级（Grade）显着相关,且G2与G1（P<0.01）、G3与G2（P<0.05）、G3与G1（P<0.001）和G4与G1（P<0.05）之间存在显着性差异;该基因在临床Ⅱ期（StageⅡ）的表达水平较临床Ⅰ期（StageⅠ）显着上调（P<0.001）,在T2期及T4期的表达水平较T1期显着上调（P<0.001;P<0.05）。独立预后分析表明lncRNA可独立于上述临床参数来预测HCC患者的预后（P<0.05）。ENCORI软件分析得出miR-125b-5p可作为lncRNA CYTOR的靶向miRNA,后续6个数据库综合分析得出KIAA1522及PODXL可作为miR-125b-5p的候选靶向mRNA。对二者进行差异分析、生存分析及与miR-125b-5p的相关分析后,选择KIAA1522作为目标靶向mRNA。相较于癌旁组织,KIAA1522在GSE62232和GSE84402的HCC组织中表达显着上调（P<0.001）。GSEA富集分析结果表明,cell cycle信号通路、adherens junction信号通路、Notch信号通路、mTOR信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路、apoptosis信号通路和tight junction信号通路相关的基因集在高KIAA1522表达的表型中显着富集。结论:探究lncRNA的表达情况、生物学功能,构建新的lncRNA/miRNA/mRNA调控轴是研究HCC发病机制的有效手段。lncRNA在HCC组织中表达水平显着上调,与多种临床病理参数相关,且可作为HCC患者潜在的预后生物标志物。此外,lncRNA CYTOR可通过靶向miR-125b-5p进而调节KIAA1522的表达参与HCC的发生发展。背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种由多种病因引起肿瘤,目前仍是人类最常见、最致命的恶性肿瘤之一。因此,寻找新的、临床上有效的HCC诊断及预后生物标志物至关重要。本实验的主要目的是基于第一部分生物信息学分析的结果,探索长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）CYTOR、微小RNA（microRNA,miRNA）miR-125b-5p 以及蛋白编码信使 RNA（messenger RNA,mRNA）KIAA1522的靶向调控作用及该调控轴在HCC发生、发展中的作用。材料与方法:通过脂质体将目的基因相关载体转染至正常肝细胞（HHL-5）及几种HCC细胞（SK-Hep-1、Hep3b和Huh-7）后,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测 HCC 细胞中 lncRNA CYTOR、miR-125b-5p和KIAA1522的表达,并筛选实验细胞。免疫组化检测KIAA1522在HCC组织及癌旁正常组织中的表达情况。采用双荧光素酶报告基因检测试验证实lncRNA CYTOR、miR-125b-5p和KIAA1522间的调控关系。之后,利用CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测不同转染条件下HCC细胞的增殖情况,采用流式细胞仪分析转染后HCC细胞周期的变化,使用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidy l transferase mediated nick end labeling,TUNEL）观察转染后 HCC 细胞的凋亡情况;并通过蛋白免疫印迹实验（western blot,WB）分析检测细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等相关蛋白的表达。结果:转染后,相较于HHL-5细胞,Hep3b细胞中上述基因的表达均是最为显着的,故选择Hep3b细胞进行下一步实验。双荧光素酶报告基因检测实验的结果显示miR-125b-5p mimic+CYTOR-wt 共转染组和miR-125b-5p mimic+KIAA1522-wt 共转染组Hep3b细胞的荧光素酶活性显着降低;lncRNA CYTOR可直接作用于miR-125b-5p,而miR-125b-5p可直接靶向KIAA1522。CCK-8实验结合WB检测结果显示敲低lncRNACYTOR抑制了 HCC细胞的增殖,并下调了 Ki-67和PCNA的蛋白表达;抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过度表达则促进了细胞的增殖并上调了 Ki-67和PCNA的蛋白表达。流式细胞仪分析结合WB检测结果显示敲低lncRNA CYTOR 降低了 S期及G2/M期比值,下调了 cyclin D1及cyclin E等蛋白的表达而上调了 p21表达;抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过度表达则升高了 S期及G2/M期比值,并上调了 cyclin D1等蛋白的表达并下调了 p21表达。TUNEL细胞凋亡检测结合WB检测提示敲低lncRNA CYTOR可促进Hep3b细胞凋亡,下调Bcl-2的表达同时上调 Bax 的表达及 cleaved caspase3/caspase 3、cleaved caspase9/caspase 9;而抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过表达则抑制Hep3b细胞凋亡,上调Bcl-2的表达并下调 Bax 的表达及 cleaved caspase 3/caspase 3、cleaved caspase 9/caspase 9。结论:综上所述,HCC中过表达的lncRNA CYTOR可通过靶向抑制miR-125b-5p进而上调KIAA1522的表达水平,促进HCC细胞增殖、影响细胞周期并抑制细胞凋亡。本研究为肝细胞癌的发生机制注入了新的见解。
张难[5]（2021）在《MiR-301a-3p在食管鳞癌组织和细胞中的表达及调节细胞增殖的功能和作用机制》文中认为恶性肿瘤是威胁人类健康的三大疾病之一,食管癌（Esophageal Cancer）在世界范围内的发病率位于所有恶性肿瘤的第8位,死亡率位于第6位。我国食管癌的发病人数占世界范围的50%以上,据统计,2015年我国食管癌发病24.6万,发病率为17.87/10万;死亡18.8万例,死亡率为13.68/10万。从病理类型上看,食管癌的主要分为鳞癌和腺癌,欧美主要以腺癌为主,在我国90%以上均为鳞癌,其发病具有明显的家族聚集性和地域性。食管鳞癌的发生主要由环境、饮食习惯、地域等多种因素综合作用所致。食管鳞癌同其他恶性肿瘤一样,由促癌基因和抑癌基因表达失调共同所致。但是,由于目前对于此类食道癌发病相关分子表达变化及其分子机制仍不明确,研究食管癌的发病机制具有极其重要的意义,能够为食管癌的治疗提供新的靶点,对于提高食管癌患者的治疗效果及改善预后具有重要的意义。MicroRNA（MiRNA）是一类内源性非编码的小RNA,通常由2l-25个核苷酸组成的,在人体内起着调节细胞基本生理功能的作用。研究显示miRNA可通过调节下游靶基因影响肿瘤的发生和发展,有望成为肿瘤治疗的潜在靶点。这些miRNA既有抑癌作用、也发挥促癌效应。既往研究证实多种miRNA在食管鳞癌组织及细胞中表达失调,其表达变化与食管鳞癌的恶性度及预后相关。MiR-301a-3p是miR-301家族的一员,广泛表达于人体各个器官,具有重要的生物学功能,同多种肿瘤发生相关。但是,miR-301a-3p在食管鳞癌发生中的作用尚不明了。为了研究其在食管鳞癌中的作用,本文首先比较了食管癌组织与癌旁组织、食管鳞癌细胞与正常粘膜细胞中miR-301a-3p表达水平,并分析其表达水平与患者临床特征、术后病理分期之间的相关性;接着验证了miR-301a-3p对食管癌细胞增殖活性的影响;然后分析寻找并验证miR-301a-3p的下游靶基因,最后探讨miR-301a-3p调节食管癌细胞增殖活性的分子机制。第一部分miR-301a-3p在食管鳞癌组织和细胞中的表达及临床意义目的:明确miR-301a-3p在食管鳞癌组织、细胞中及正常食管粘膜组织、细胞中分别表达情况,及其表达水平与食管鳞癌患者临床病理特征之间的关系。方法:收集行手术切除的食管鳞癌患者的肿瘤及配对正常组织标本,并培养食管鳞癌细胞系及正常食管粘膜上皮细胞系,用Real-time PCR方法检测miR-301a-3p在食管鳞癌组织、正常组织及不同细胞系中的表达差异。收集患者临床资料,分析miR-301a-3p表达水平与患者临床特征及病理学之间的关系。结果:miR-301a-3p在食管鳞癌组织中的表达水平显着高于正常组织（P<0.01）;与正常食管粘膜细胞HET-1A相比,miR-301a-3p在食管鳞癌细胞系Eca109、TE-1中的表达均显着升高（P<0.001）。MiR-301a-3p高表达与术后病理中的淋巴结转移（P=0.017）、肿瘤长度超过4cm（P=0.03）以及TNM分期（P=0.009）呈显着相关。小结:miR-301a-3p在食管鳞癌组织及细胞系中的表达水平比正常食管粘膜组织和正常食管细胞系中升高,miR-301a-3p的相对表达量高低与食管鳞癌的肿瘤长度、淋巴结转移情况以及TNM分期相关。第二部分miR-301a-3p通过调控PI3K/AKT通路影响食管鳞癌细胞增殖目的:miR-301a-3p在多数肿瘤中发挥促癌基因的效果,在不同的肿瘤中发挥作用的机制不同。本部分研究miR-301a-3p通过调控PI3K/AKT通路对食管鳞癌细胞增殖及克隆的影响。方法:通过在食管鳞癌细胞系中转染miR-301a-3p mimics/inhibitor使其过表达或抑制其表达,用Real time PCR法验证过表达及抑制效果。通过MTT实验和克隆平板实验检测miR-301a-3p对食管鳞癌细胞增殖及克隆形成能力的影响。使用免疫印迹试验检测转染后PI3K/AKT通路中p-AKT/AKT比值,以及下游蛋白BCL-2,BAX的表达变化。在回复实验中使用PI3K特异性抑制剂LY294002处理被miR-301a-3p转染的Eca109细胞系后,再检测p-AKT/AKT比值,以及BCL-2,BAX的表达变化。通过以上实验明确miR-301a-3p对食管鳞癌细胞系Eca109的作用,并验证其调控PI3K/AKT信号通路。结果:1.转染miR-301a-3p mimics/inhibitor后miR-301a-3p的表达变化。在实验中使用Eca109细胞建立体外细胞模型,使用Real-time PCR检测不同分组中miR-301a-3p的表达情况,结果显示:在实验组中转染miR-301a-3p mimics后,miR-301a-3p表达量显着增高,与阴性对照组的相对表达量分别为:3.96±0.39,1±0.08,具有统计学差异（P<0.01）。转染miR-301a-3p inhibitor的实验组与阴性对照组的相对表达量分别为:0.34±0.08,1±0.13,具有统计学差异（P<0.01）。证实转染成功,可以进行后续的实验。2.miR-301a-3p表达对食管鳞癌细胞Eca109增殖能力和克隆形成能力的影响。MTT实验显示,细胞转染48小时后,转染miR-301a-3p mimics的实验组Eca109细胞系和转染Negative Control（NC）mimics的对照组的OD值分别为0.765±0.050vs0.560±0.049（P<0.05）;在转染miR-301a-3p inhibitor后的48小时,实验组和对照组的OD值分别为0.483±0.054 vs0.616±0.040（P<0.05）,证实与对照组相比,Eca109细胞转染miR-301a-3p mimics后增殖能力显着增强,转染miR-301a-3p inhibitor后增殖能力显着下降,证明miR-301a-3p具有促进细胞增殖的作用。在细胞克隆实验中,转染miR-301a-3p mimics的实验组和转染NC mimics的阴性对照组的克隆形成数分别为:201±15 vs 138±12（P<0.05）;在转染miR-301a-3p inhibitor的实验组和对NC inhibitor的对照组中分别为:58±6vs116±12（P<0.05）。证明转染miR-301a-3p mimics后Eca109细胞克隆形成能力显着增强,转染miR-301a-3p inhibitor后Eca109细胞克隆形成能力显着下降。3.miR-301a-3p对p-AKT/AKT比值、BAX和BCL-2表达的影响。转染miR-301a-3p mimic实验组Eca109细胞系的实验组中p-AKT/AKT和BCL-2表达高于对照组,BAX表达低于对照组（P<0.05）。转染miR-301a-3p inhibitor的实验组中p-AKT/AKT和BCL-2表达低于对照组,BAX表达高于对照组（P<0.05）。4.回复实验:使用LY294002处理miR-301a-3p mimics转染的Eca109细胞后,BCL-2蛋白表达升高,BAX蛋白表达降低,与对照组的Eca109细胞系中BCL-2蛋白,BAX蛋白表达差异具有统计学意义。证明miR-301a-3p通过PI3K/AKT通路调节BCL-2、BAX表达。小结:miR-301a-3p可增强食管鳞癌细胞增殖和克隆形成的能力,通过激活PI3K/AKT通路及下游BCL-2、BAX蛋白在食管鳞癌细胞中促进肿瘤增殖和克隆形成。第三部分miR-301a-3p在食管鳞癌细胞中的作用靶基因的筛选及验证目的:通过第二部分的实验观察到,miR-301a-3p可通过激活PI3K/AKT通路提高食管鳞癌细胞的增殖和克隆能力,但其具体作用的靶基因尚不明确。本部分研究筛选miR-301a-3p靶基因并进行验证,阐明其作用机制。方法:用miRBase软件（http://www.mirbase.org）预测miR-301a-3p靶基因,找到表达受到miR-301a-3p负性调控且在PI3K/AKT通路发挥作用的蛋白PTEN。在17对食管鳞癌患者的肿瘤组织及正常组织中,用Western Blot方法检测PTEN的表达情况,用RT-PCR的方法检测miR-301a-3p的表达,并检测二者之间的相关性。在Eca109细胞中转染miR-301a-3p mimics/inhibitor后,检测靶基因PTEN在细胞中的表达水平。构建含有靶基因PTEN m RNA的3’UTR区的荧光酶报告质粒,通过双荧光素酶报告基因实验,验证miR-301a-3p与PTEN的m RNA的3’UTR区是否直接结合来调控其表达。接下来在Eca109细胞系中进行回复实验,分为四组,并在各组内共同进行MTT实验及克隆形成试验,检测细胞的增殖能力;进一步应用Western Blot方法检测各组细胞中p-AKT/AKT比值,BCL-2和BAX的表达情况。通过以上回复试验,验证PTEN是否能逆转miR-301a-3p在Eca109细胞系的调控作用。结果:1.通过预测发现,miR-301a-3p和PTEN 3’UTR的398-418 nt存在互补结合位点。荧光素酶活性分析结果显示,Eca109细胞中野生型PTEN的荧光活性被miR-301a-3p显着抑制,但miR-301a-3p并不影响Eca109细胞中突变型PTEN的荧光素酶活性,表明miR-301a-3p可以和PTEN进行特异性结合。2.在组织及细胞中miR-301a-3p与PTEN表达呈负相关。收集了17对ESCC组织和正常组织。Western Blot及Real time-PCR结果显示,与正常组织相比,ESCC组织中PTEN蛋白水平降低（P<0.01）,PTEN在食管鳞癌组织中的表达水平与miR-301a-3p的表达呈负相关（R2=0.5945,P<0.01）。在Eca109细胞系中转染miR-301a-3p mimics后,PTEN的表达显着降低（P<0.05）;反之,转染miR-301a-3p inhibitor后,PTEN的表达升高（P<0.01）。3.PTEN可逆转miR-301a-3p对食管鳞癌细胞Eca109增殖能力和克隆形成能力影响。首先应用miR-301a-3p mimics+PTEN组及其相关对照组进行实验,转染一定时间后,进行MTT细胞增殖实验和克隆形成实验。结果显示:MiR-301a-3p mimics+PTEN组的细胞的增殖和克隆形成能力较miR-301a-3p mimics+NC PTEN组明显降低（P<0.05）。证明PTEN能逆转miR-301a-3p对细胞增殖和克隆形成能力的促进作用。再应用miR-301a-3p inhibitor+si-PTEN组及相关的对照组进行实验,在转染一定时间后,进行MTT细胞增殖实验和克隆形成实验。结果显示:miR-301a-3p inhibitor+si-PTEN组的细胞增殖和克隆能力较miR-301a-3p inhibitor+NC si-PTEN组明显增强（P<0.05）。证明si-PTEN与miR-301a-3p inhibitor转染后,能回复miR-301a-3p inhibitor对细胞增殖能力的抑制作用。4.PTEN可回复miR-301a-3p对p-AKT/AKT比值,BAX和BCL-2表达的影响。分组情况与上一步相同,首先应用miR-301a-3p mimics+PTEN组及其相关的对照组进行实验,在转染48小时后,应用Western Blot方法,检测Eca109细胞中p-AKT/AKT比值,BAX和BCL-2的相对表达情况。miR-301a-3p mimics+PTEN组较miR-301a-3p mimics+NC PTEN组p-AKT/AKT比值及BCL-2的相对表达量均降低,BAX相对表达量升高（P<0.05）。结果证明miR-301a-3p能使得p-AKT/AKT比值和BCL-2的表达量升高,BAX的表达量降低,而共转染PTEN后能逆转miR-301a-3p对p-AKT/AKT比值、BCL-2和BAX蛋白表达的作用。同样,在转染48小时后,应用Western Blot方法检测miR-301a-3p inhibitor+si-PTEN组及其相关的对照组中Eca109细胞中p-AKT/AKT比值,BAX和BCL-2的表达。MiR-301a-3p inhibitor+si-PTEN组较miR-301a-3p inhibitor+NC si-PTEN组p-AKT/AKT比值,BCL-2的相对表达均升高,BAX相对表达降低（P<0.05）。结果证实miR-301a-3p inhibitor能使得p-AKT/AKT比值和BCL-2的相对表达降低,BAX相对表达升高,而共转染si-PTEN后能回复miR-301a-3p inhibitor对信号通路及蛋白的作用。小结:miR-301a-3p可通过特异性靶向结合PTEN调节PI3K/AKT通路促进Eca109细胞增殖。结论:miR-301a-3p在食管鳞癌组织及细胞中表达上调,miR-301a-3p的高表达与食管鳞癌的淋巴结转移、肿瘤长度以及TNM分期相关;miR-301a-3p可促进食管鳞癌细胞增殖和克隆形成;通过激活PI3K/AKT通路,调节下游BCL-2、BAX蛋白表达变化,miR-301a-3p可起到增强食管鳞癌细胞增殖和克隆形成,促进肿瘤生长的作用;miR-301a-3p通过与PTEN的m RNA 3’UTR区靶向结合,抑制其表达,从而促进食管鳞癌细胞增殖。
陈晶晶[6]（2021）在《参七化痰方治疗AECOPD临床疗效观察及其含药血清对气道平滑肌细胞RhoA/ROCK信号通路的影响研究》文中研究表明1背景COPD是全球引起慢性疾病和死亡主要原因之一,近年来对COPD的研究一直是呼吸界的研究热点。据2021年《慢性阻塞性肺疾病全球倡议》,COPD乃世界第3位死亡原因,可预测发病率和死亡率将在未来几十年上升。目前,COPD发病机制尚不完全清楚,其病因是由于环境因素和遗传因素之间复杂交互作用。其中暴露于吸入污染物或香烟烟雾激活肺泡上皮和炎症细胞引起气道炎症是COPD发病主要机制。本研究分为理论研究、临床研究及体外研究三部分。运用传统医学理论与现代分子医学技术,针对慢阻肺这一重大疾病开展相关性研究。从理论研究出发,通过分类提炼关于慢阻肺的中医病因病机相关文献,梳理出慢阻肺中医学发生发展病机及治则治法,通过临床观察及体外研究,阐明益气活血化痰法治疗COPD的内在机制,为益气活血化痰法进一步运用于COPD的治疗提供客观依据。2目的在传统医学“整体观念辨证统一”思想指导下,探讨慢阻肺的中医学发生发展内在病机,通过理论研究,揭示慢阻肺“本虚标实”的病理本质及益气活血化痰法的治疗意义。临床研究观察益气活血化痰法治疗慢阻肺急性加重期气虚血瘀痰阻证的疗效评价及安全性,并分析TGF-β1与ROCK1等其他指标的相关性。体外研究以Rho A/ROCK与MAPK/ERK信号通路为切入点,观察在TGF-β1刺激下参七化痰方含药血清对气道平滑肌细胞的增殖、迁移、凋亡及F-肌动蛋白的形成和细胞骨架重组的影响,检测药物干预后上述通路相关分子水平的表达变化,观察益气活血化痰法中药参七化痰方对气道平滑肌细胞的作用,探讨其治疗慢阻肺气道重塑的分子机制,为中医药辅助治疗慢阻肺提供科学依据。3方法理论研究部分:通过搜集筛选关于慢阻肺的中医病因病机相关文献,提炼出慢阻肺中医学发生发展病机,揭示慢阻肺发病的本质及治法,并通过文献研究阐述Rho A/ROCK等信号通路与TGF-β1的结构功能及其与慢阻肺的相关性,为进一步参七化痰方治疗慢阻肺临床研究及体外实验提供理论基础。临床研究部分:按照随机对照设计原则,将符合纳入标准的60例AECOPD患者分为对照组和治疗组各30例,对照组予以控制性氧疗、抗生素、解痉平喘药及祛痰等基础治疗,治疗组加用参七化痰方治疗,两组均治疗14天。治疗前后对两组症状与体征评分进行记录来评估中医证候疗效;治疗前后监测患者呼吸困难指数（m MRC）、肺功能（FEV1%pred、FEV1/FVC）、血气分析（Pa CO2、Pa O2）、感染指标（WBC、NEUT%、hs-CRP）、凝血指标（FBG、DD水平）;此外,还对治疗前后患者的TGF-β1与ROCK1进行了检测,并且对治疗组患者治疗前的TGF-β1指标与其他相关指标进行相关性分析,为后续细胞实验的机制研究奠定基础。体外研究部分:本课题来源系由国家自然科学基金项目（编号:81473675）支持。采用参七化痰方的大鼠含药血清,进行气道平滑肌细胞体外实验。实验研究一从新生SD大鼠的肺中成功分离大鼠气道平滑肌细胞,从不同层面来筛选TG F-β1刺激下参七化痰方（SQHT）对气道平滑肌细胞最适作用浓度,为后续信号通路机制研究提供基础。实验研究二根据实验一筛选出的SQHT最适含药血清浓度进行接下来的实验,利用CCK8方法检测细胞的增殖能力;采用Transwell检测迁移能力;采用流式方法检测凋亡能力,并利用Western blot与RT-q PCR方法对Bax、Bcl-2水平进行验证;通过免疫荧光的方法追踪细胞F-肌动蛋白的变化。实验研究三采用Western blot与RT-q PCR方法对Rho A/ROCK与MAPK/ERK信号通路上的关键蛋白进行了检测,包括Rho A、ROCK1、ROCK2、p-ERK、ERK等指标的变化;实验研究四为了进一步证明SQHT在气道平滑肌细胞重塑及炎症中发挥重要作用,采用Western blot与RT-q PCR方法检测细胞因子Snail、Slug的变化,同时采用ELISA方法验证细胞上清中MMP9、TIMP-1蛋白的变化,为临床运用益气活血化痰法治疗慢阻肺提供科学依据。4结果4.1理论研究慢阻肺乃本虚标实之证,本虚乃正虚,肺脾肾气亏虚为主。标实乃痰瘀,以痰瘀互结为特点。总属正虚夹杂痰瘀而成,气虚血瘀痰阻乃肺胀病机之关键,益气活血化痰法是肺胀的根本治法。Rho A/ROCK为慢阻肺中最常见失调信号通路之一,MAPK/ERK信号通路位于其下游发挥作用,TGF-β1刺激与慢阻肺气道重塑及气道平滑肌密切相关。参七化痰方具有益气活血化痰功效,故可能介导上述两条信号通路干预TGF-β1的刺激来治疗慢阻肺。4.2临床研究4.2.1治疗前组间比较治疗前两组基线资料（性别、年龄、病程及病情严重程度）、症状体征评分、m MRC、FEV1%pred、FEV1/FVC、Pa CO2、Pa O2、WBC、NEUT%、hs-CRP、FBG、DD、TGF-β1以及ROCK1水平组间比较均无统计学意义（P>0.05）,证明临床资料具有可比性。4.2.2治疗后疗效比较4.2.2.1益气活血化痰法对中医证候疗效的影响治疗后组内比较:两组咳嗽、喘息、咯痰量、痰液状态、饮食情况、口唇紫绀、胸闷、乏力、肺部啰音等单项积分均具有显着统计学意义（P<0.01）。治疗后组间比较:与对照组相比,治疗组咳嗽、咯痰量、痰液状态、饮食情况、口唇紫绀、乏力、肺部啰音单项积分具有统计学意义（P<0.05）,而胸闷及喘息单项积分疗效无统计学意义（P>0.05）。在有效率方面,治疗组30例中显效16例,有效12例,无效2例,总有效率为93.33%;对照组30例中显效9例,有效17例,无效4例,总有效率为86.67%。经过治疗后,2组总有效率相近（P>0.05）,但2组显效率相比,组间差异具有统计意义（P<0.01）。4.2.2.2益气活血化痰法对呼吸困难指数的影响治疗后组内比较:两组m MRC评分有显着统计学意义（P<0.01）。治疗后组间比较:两组m MRC评分有统计学意义（P<0.05）。4.2.2.3益气活血化痰法对患者肺功能的影响治疗后组内比较:两组患者FEV1%pred,FEV1/FVC指标具有显着统计学意义（P<0.01）。治疗后组间比较:治疗组患者FEV1%pred,FEV1/FVC指标具有显着统计学意义（P<0.01）。4.2.2.4益气活血化痰法对WBC、Neut%、hs-CRP、TGF-β1、ROCK1的影响治疗后组内比较:两组患者WBC、Neut%、hs-CRP、TGF-β1、ROCK1指标有显着统计学意义（P<0.01）。治疗后组间比较:两组患者WBC、Neut%、hs-CRP、TGF-β1、ROCK1指标有显着统计学意义（P<0.01）。4.2.2.5益气活血化痰法对血气分析指标的影响治疗后组内比较:两组患者Pa O2、Pa CO2较治疗前有显着统计学意义（P<0.01）。治疗后组间比较:两组患者Pa O2、Pa CO2指标具有显着统计学意义（P<0.01）。4.2.2.6益气活血化痰法对凝血指标的影响治疗后组内比较:两组患者FBG、DD较治疗前有显着统计学意义（P<0.01）。治疗后组间比较:两组患者FBG、DD指标具有显着统计学意义（P<0.01）。4.2.3益气活血化痰法安全性评价两组患者治疗前后,肝肾功能无明显差异,且治疗组未出现明显不良反应。4.2.4 TGF-β1与各项指标之间的相关性分析治疗组AECOPD患者治疗前血清TGF-β1含量与WBC（r=0.466,P=0.009）、Neut%（r=0.450,P=0.012）、hs-CRP（r=0.388,P=0.034）、Pa CO2（r=0.432,P=0.017）和DD（r=0.394,P=0.031）呈正相关,与Pa O2（r=-0.467,P=0.009）、F EV1%pred（r=-0.379,P=0.039）及FEV1/FVC（r=-0.344,P=0.045）呈负相关,而与FBG无显着相关性（r=0.156,P=0.409）。结合前述结果,提示TGF-β1可能参与AECOPD炎症、凝血及呼吸功改变等过程。进一步研究还显示,AECOPD患者血清TGF-β1含量与COPD发病重要信号通路Rho A/ROCK中ROCK1（r=0.309,P=0.043）也呈正相关。4.3体外研究4.3.1实验研究一实验细胞爬片经DAPI细胞免疫化学染色后,根据荧光二抗的荧光颜色,通过荧光显微镜观察可见细胞核为蓝色,而α-平滑肌肌动蛋白阳性表达位置为绿光,主要表达区域为细胞胞浆,细胞特异性及活性良好,鉴定为ASMCs,可作为后续实验用细胞。通过给予不同浓度的SQHT含药血清进行干预TGF-β1刺激的ASMCs,结果显示在细胞增殖、迁移、细胞骨架重组等方面,与空白组相比,TGF-β1模型组具有统计学意义（P<0.01）;与模型组相比,除5%SQHT增殖能力无明显差异外（P>0.05）,5%、10%和20%SQHT各治疗组均具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,量效关系在所设浓度梯度范围内呈现一定的剂量依赖关系;其中5%和10%SQHT治疗差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）;10%和20%SQHT含药血清治疗差异无统计学意义（P>0.05）。与空白组相比,模型组Rho A、ROCK1、ROCK2、Bax、Bcl-2均有显着差异（P<0.01）。与模型组相比,各治疗组Rho A、ROCK1、ROCK2、Bax、Bcl-2均有显着差异（P<0.01）。不同浓度治疗组组间比较,10%与20%治疗组对Rho A、ROCK1、ROCK2、Bax、Bcl-2等指标的影响均较5%治疗组显着（P<0.01）,且10%与20%治疗组对Rho A、ROCK1、ROCK2、Bax、Bcl-2等指标的影响无显着差异（P>0.05）。综上所述,鉴于考虑到细胞毒性的作用,因此我们选择10%SQHT含药血清作为后续实验的最适浓度。4.3.2实验研究二药物在抑制气道平滑细胞增殖、迁移、细胞骨架重组方面均具有调控作用。与空白组相比,模型组在增殖、迁移及骨架重组方面具有统计学意义（P<0.01）;与模型组相比,各治疗组在增殖、迁移及骨架重组方面具有统计学意义（P<0.01）;治疗组组间比较,在抑制增殖、迁移和抗凋亡方面,10%SQHT组与Fasudil组差异无统计学意义（P>0.05）;在骨架重组方面10%SQHT组优于Fasudil组（P<0.01）,且二者在抑制细胞增殖、迁移、细胞骨架重组及抗凋亡表达方面具有协同作用,且10%SQHT+Fasudil组最佳（P<0.05,P<0.01）。与空白组相比,模型组Bax、Bcl-2、Bax m RNA、Bcl-2 m RNA均有显着差异（P<0.01）;与模型组相比,除Fasudil组对Bax m RNA无显着影响外,三个治疗组Bax、Bcl-2、Bax m RNA、Bcl-2 m RNA均有显着差异（P<0.01）;治疗组组间比较,10%SQHT组Bax、Bcl-2、Bax m RNA、Bcl-2 m RNA均优于Fasudil组（P<0.01）;联合治疗组Bax、Bcl-2、Bax m RNA、Bcl-2 m RNA均优于10%SQHT与Fasudil组。4.3.3实验研究三药物对Rho A/ROCK与MAPK/ERK信号通路上的关键蛋白异常表达具有调控作用。与空白组相比,模型组Rho A、ROCK1、ROCK2、Rho A m RNA、ROCK1 m RNA、ROCK2m RNA、p-ERK、ERK、p-ERK/ERK均显着升高（P<0.01）。与模型组相比,各治疗组Rho A、ROCK1、ROCK2、Rho A m RNA、ROCK1 m RNA、ROCK2 m RNA、p-ERK、ERK、p-ERK/ERK均显着降低（P<0.01）。治疗组组间比较,10%SQHT治疗组在抑制Rho A、ROCK1、ROCK2、Rho A m RNA、ROCK1 m RNA、ROCK2 m RNA、p-ERK、ERK、p-ERK/ERK方面均优于Fasudil（P<0.05,P<0.01）;联合治疗组在抑制Rho A、ROCK2、Rho A m RNA、ROCK1 m RNA、p-ERK、ERK方面均优于另外2个治疗组（P<0.01）。联合治疗组在抑制ROCK1、ROCK2 m RNA、p-ERK/ERK方面与SQHT组无差异（P>0.05）,且优于Fasudil组（P<0.01）。4.3.4实验研究四药物对Snail?Slug?MMP-9?TIMP-1的关键因子异常表达具有调控作用。与空白组相比,模型组Snail、Snail m RNA、Slug、Slug m RNA、MMP-9、TIMP-1均显着升高（P<0.01）。与模型组相比,各治疗组Snail、Snail m RNA、Slug、Slug m RNA、MMP-9、TIMP-1均显着降低（P<0.01）。治疗组组间比较,10%SQHT治疗组在抑制Snail、Slug m RNA、MMP-9、TIMP-1方面均优于Fasudil（P<0.01）,在抑制Slug、Snail m RNA方面与Fasudil无显着差异（P>0.05）;联合治疗组在抑制Slug、Slug m RNA、MMP-9、TIMP-1方面均优于另外2个治疗组（P<0.01）。联合治疗组在抑制Snail、Snail m RNA方面与SQHT组无差异（P>0.05）,且优于Fasudil组（P<0.01）。5结论基于益气活血化痰法创制的参七化痰方可以改善慢阻肺急性加重期的中医证候疗效、呼吸困难指数、肺功能、感染指标、血气分析指标以及凝血指标等,且安全性良好,未见毒副作用。其内在作用机制可能与TGF-β1及Rho A/ROCK等信号通路途径相关,通过下调TGF-β1及Rho A/ROCK相关基因蛋白表达,进而负向调节MAPK/ERK信号通路的发展。
邓慧琳,杨婧,郭俐[7]（2021）在《α-硫辛酸对白细胞介素1β诱导的软骨细胞损伤的保护作用》文中研究说明目的探讨α-硫辛酸（ALA）调控微小RNA-877（miR-877）/N-myc下游调节基因2（NDRG2）分子轴对白细胞介素1β（IL-1β）诱导的软骨细胞损伤的影响及其机制。方法本研究于2019年1月至2019年7月在南充市中心医院风湿免疫科实验室完成。分离培养SD大鼠膝关节软骨细胞,按照随机数字表法分为对照（Con）组、IL-1β组、IL-1β+ALA-低剂量（L）组、IL-1β+ALA-中剂量（M）组、IL-1β+ALA-高剂量（H）组、IL-1β+miRNA抑制物阴性对照（anti-miR-NC）组、IL-1β+miR-877抑制物（antimiR-877）组、IL-1β+空载体质粒（pcDNA）组和IL-1β+NDRG2过表达质粒（pcDNA-NDRG2）组、IL-1β+ALA+miRNA模拟物阴性对照（miR-NC）组和IL-1β+ALA+miR-877组。流式细胞术检测细胞凋亡,酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素γ（IFN-γ）的分泌量,蛋白质印记（western blot）法检测NDRG2蛋白的表达水平,实时定量PCR（qRT-PCR）检测miR-877和NDRG2 mRNA的表达水平。双荧光素酶报告基因实验和western blot检测miR-877和NDRG2的靶向调控关系。结果与Con组比较,IL-1β组软骨细胞IL-6[（3.27±0.31）比（1.06±0.09）ng/L]、TNF-α、IFN-γ的分泌增加,miR-877[（2.65±0.24）比（1.02±0.09）]表达升高,NDRG2[（0.21±0.03）比（0.69±0.06）]表达降低,细胞凋亡率[（0.69±0.06）比（6.24±0.63）%]升高（均P<0.05）;与IL-1β组比较,IL-1β+ALA-L组、IL-1β+ALA-M组、IL-1β+ALA-H组软骨细胞IL-6[（2.91±0.25）,（2.33±0.23）,（1.65±0.16）比（3.27±0.31）ng/L]、TNF-α、IFN-γ的分泌降低,miR-877[（2.21±0.19）,（1.96±0.17）,（1.43±0.14）比（2.65±0.24）]的表达降低,NDRG2[（0.34±0.03）,（0.46±0.04）,（0.58±0.05）比（0.21±0.03）]表达升高,细胞凋亡率[（20.13±2.12）,（16.32±1.63）,（11.04±1.15）比（27.62±2.43）]%降低,差异有统计学意义（P<0.05）;与IL-1β+anti-miR-NC组比较,IL-1β+anti-miR-877组软骨细胞IL-6[（1.38±0.14）比（3.34±0.33）ng/L]、TNF-α、IFN-γ的分泌降低,细胞凋亡率[（12.54±1.25）比（27.14±2.73）]%降低,差异有统计学意义（P<0.05）;与IL-1β+pcDNA组比较,IL-1β+pcDNA-NDRG2组软骨细胞IL-6[（1.43±0.15）比（3.47±0.34）ng/L]、TNF-α、IFN-γ的分泌降低,细胞凋亡率[（13.55±1.35）比（28.14±2.83）]%降低,差异有统计学意义（P<0.05）;与IL-1β+ALA+miR-NC组相比,IL-1β+ALA+miR-877组软骨细胞IL-6[（3.01±0.29）比（1.42±0.13）ng/L]、TNF-α、IFN-γ的分泌升高,细胞凋亡率[（25.47±2.53）比（11.68±1.87）]%增加,差异有统计学意义（P<0.05）。结论α-硫辛酸能够减轻IL-1β诱导的软骨细胞损伤,其机制与调控miR-877/NDRG2通路有关。
罗敏[8]（2020）在《MiR-196b靶向PCDH-17调控人喉鳞状细胞癌进展的机制研究》文中认为第一部分:miR-196b、PCDH-17表达在人喉鳞状细胞癌中的差异性表达及与患者预后关联性分析目的:探究miR-196b、PCDH-17在人喉鳞状细胞癌及癌旁正常组织中的差异性表达,确定其促癌性或抑癌性,分析miR-196b、PCDH-17与患者预后关系。材料与方法:选取2010年6月到2013年6月在我院经病理诊断确诊为人喉鳞癌并且进行手术的79例患者癌组织及癌旁正常组织;患者的肿瘤淋巴结转移（TNM）分期按照国际癌症控制联盟（UICC）和美国癌症联合委员会（AJCC）共同制定的AJCC/UICC第8版头颈部肿瘤分期标准。统计79例患者的一般社会学资料、临床病理资料;免疫组织化学染色分析癌组织及癌旁组织中PCDH-17蛋白阳性表达;RT-PCR检测人喉鳞癌及癌旁组织中miR-196b、PCDH-17 m RNA浓度表达;确定miR-196b、PCDH-17 m RNA表达的相关性;对79例患者随访五年,统计患者生存率,miR-196b、PCDH-17 m RNA表达与患者预后关联性分析。结果:一般临床资料分析:患者的平均年龄为60.58±14.25岁;男性患者占据大多数比例;喉鳞癌患者伴随较高比例的吸烟史及酗酒史,组织学分级I级比例最低,II级和III级比例数据差异性较小;T1分期比较最低,T2T4分期比例差异性较小;N0分期占据绝大多数比例,TNM的分期体现出相同的趋势,其中I期比例最低,IIIV期比例差异性较小;RT-PCR检测喉鳞癌及癌旁组织中miR-196b及PCDH-17的m RNA表达:喉鳞癌组织内miR-196b的表达要明显的高于癌旁正常组织,体现出明显促癌性特点;PCDH-17的表达要明显地低于癌旁正常组织,体现出抑癌性特点;两组数据相比,差异有显着统计学意义（P<0.05）;免疫组织化学染色检测喉鳞癌及癌旁组织中PCDH-17蛋白阳性率表达:癌组织内PCDH-17蛋白的阳性表达率明显地低于癌旁正常组织,数据差异有显着统计学意义（P<0.05）;miR-196b、PCDH-17表达与喉鳞癌患者临床病理特征相关性:不同年龄段、性别比例、吸烟史及酗酒史中miR-196b及PCDH-17的表达差异性较小,P>0.05,差异不具有统计学意义。随着组织学分级的增加、T分期及N分期的增加、TNM分期的增加,miR-196表达体现出增加趋势,PCDH-17表达体现出降低趋势,数据差异有显着统计学意义（P<0.05）;miR-196b、PCDH-17 m RNA表达Pearson分析:随着癌组织内miR-196b表达的增加,PCDH-17的表达呈现出下降趋势,相关性系数r值为0.586,P<0.001,差异具有统计学意义;miR-196b、PCDH-17表达与喉鳞癌患者生存率相关性:在79例患者长达5年的随访过程中,发现最后有42例患者依然处于生存状态,其生存率为53.16%。将miR-196的m RNA表达中位数4.922作为截断值,miR-196高表达组患者在不同时间段内患者生存例数要低于miR-196低表达组患者,统计分析数据差异有统计学意义（P<0.05）;PCDH-17的m RNA表达中位数0.228作为截断值,PCDH-17高表达组患者在不同时间段内患者生存例数要高于PCDH-17低表达组患者,统计分析数据差异有统计学意义（P<0.05）。结论:在喉鳞癌病理发展中,miR-196b体现出促癌性特点,PCDH-17体现出抑癌特点,二者表达呈现负相关性,且与喉鳞癌的临床组织学分级及TNM分期等体现相关性,给予下文研究提供基础。第二部分:miR-196b靶向PCDH-17调控人喉鳞状细胞癌进展机制研究目的:充分探讨喉鳞癌病理过程中miR-196b对PCDH-17的靶向调控性以及二者在喉鳞癌细胞生物活性中的调控作用。材料与方法:选取喉鳞癌Hep-2细胞系作为研究对象,原代培养,选取第三代单层细胞作为研究对象,细胞内转染miR-196b inhibitor、miR-NC、miR-196b mimic以及PCDH-17等,使其在喉鳞癌细胞Hep-2中过表达或者部分沉默,分别设置如下分组:Control组（癌细胞不做任何处理）、miR-196b inhibitors（癌细胞内miR-196b inhibitor部分沉默处理）、miR-NC（癌细胞内转染miR-196b空质粒）、PCDH-17（癌细胞内转染PCDH-17,使其在细胞内过表达）、miR-196b mimics+PCDH-17（癌细胞内转染miR-196b及PCDH-17,使其在细胞内过表达）;细胞继续培养48小时后,进行相关项目验证分析:双荧光素酶基因检测miR-196b对PCDH-17的靶向调控作用;RT-PCR检测各组细胞内PCDH-17的m RNA表达,确定miR-196b对PCDH-17的靶向调控性;CCK-8检测各组细胞的增殖趋势;Annexin V法检测各组细胞凋亡性;划痕实验检测各组细胞迁移性;Transwell法检测各组细胞的侵袭性;Western-blotz检测各组细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭等相关蛋白浓度表达分析。结果:miR-196b靶向PCDH-17分析:我们采用Target Scan软件进行数据分析发现,miR-196b的m RNA 3’非编码区预测到一个PCDH-17结合位点,分别构建了miR-196b的荧光素酶野生型（wt-p GL3-miR-196b-3’UTR）和突变型报告基因载体（mut-p GL3-miR-196b-3’UTR）,并通过共转染实验鉴定miR-196b与PCDH-17的结合能力。应用共转染技术将不同组合的野生型和突变型p GL3-miR-196b-UTR表达载体转染到Hep-2细胞中,结果表明共转染野生型表达载体报告基因活性相对于对照组显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;在miR-196b的数据分析中,对照组、空白质粒组以及PCDH-17过表达组miR-196b表达差异性较小,差异不具有统计学意义;miR-196b部分沉默组数据明显降低,miR-196b过表达组数据明显提升,差异有统计学意义（P<0.05）;在PCDH-17的数据分析中可以看出,对照组、空白质粒组以及二者共同表达组PCDH-17表达差异性小,分别与对照组数据相比,差异不具有统计学意义;而miR-196b受到抑制以及PCDH-17过表达后,PCDH-17的表达浓度均能明显提升,差异有统计学意义（P<0.05）;CCK-8检测各组细胞增殖活性:随着时间的延长,各组细胞的增殖趋势均明显增加,当miR-196b受到抑制以及PCDH-17过表达后,细胞的增殖趋势增加幅度降低,对照组、空白质粒组以及miR-196a及PCDH-17均过表达组细胞的增殖趋势明显提升,数据差异有显着统计学意义（P<0.05）;Annexin V法检测各组细胞凋亡性:当miR-196b受到抑制以及PCDH-17过表达后,细胞的凋亡趋势明显加强,细胞凋亡率分别为（13.20±1.17）%及（13.37±1.51）%,数据差异有统计学意义（P<0.05）;对照组、空白质粒组以及miR-196a及PCDH-17均过表达组细胞的凋亡趋势差异性较小,分别为（5.61±0.75）%、（5.49±1.01）%及（5.37±1.51）%,各组数据同对照组相比,差异不具有统计学意义;划痕实验及Transwell实验:随着时间的延长,各组细胞均体现出一定的迁移、侵袭能力,当miR-196b受到抑制以及PCDH-17过表达后,细胞的迁移、侵袭能力明显降低,P>0.05,差异不具有统计学意义;而对照组、空白质粒组以及miR-196a及PCDH-17均过表达组细胞的迁移侵、袭能力明显提升,数据差异有统计学意义（P<0.05）;Western-blot检测:miR-196b受到抑制以及PCDH-17过表达后,Survivin、Bcl-2、MMP-2及MMP-9蛋白表达浓度降低,Bax蛋白表达浓度提升,细胞的增殖、迁移、侵袭趋势明显降低,凋亡能力明显提升,数据差异有统计学意义（P<0.05）;对照组、空白质粒组以及miR-196a及PCDH-17均过表达组细胞的Survivin、Bcl-2、MMP-2及MMP-9蛋白表达浓度提升,Bax蛋白表达浓度下降,增殖活性、迁移、侵袭能力明显提升,细胞的凋亡性降低,P>0.05,差异不具有统计学意义。结论:在喉鳞癌病理发展中,miR-196b负向靶向PCDH-17进而对喉鳞癌细胞的生理行为进行调控,miR-196b过表达可以明显抑制PCDH-17的表达,促进喉鳞癌细胞的增殖活性、迁移及侵袭能力,细胞凋亡性降低;miR-196b被抑制后后体现出相反的趋势,给予临床一定的启发。
隋静[9]（2020）在《肺癌lncRNA生物标志筛选及功能研究》文中研究指明研究背景与目的世界卫生组织统计显示,肿瘤发病率和死亡率在全球迅速增长,严重威胁人们生命健康。在中国,肺癌发病率和死亡率均位于首位,已成为重大公共卫生问题之一。肿瘤发病是环境和遗传因素共同作用的结果,肺癌的环境病因学已较为明确,但遗传改变是一个多阶段的复杂生物学过程,明确该过程的早期生物效应,是早期发现并且干预肺癌进展的有效分子工具,也是降低死亡率的关键。表观遗传机制研究使得该目标的实现成为可能。表观遗传分子在对外界环境的应答上,比编码蛋白质的mRNA要迅速的多,对其进行干扰调控更及时,更容易逆转下游的生物学效应。因此表观遗传分子改变属于早期分子生物标记,对其研究可为肺癌早期诊断和早期预防带来希望。长链非编码RNA（long non-codingRNA,lncRNA）是目前表观遗传的关键研究领域之一,且lncRNA具有组织特异性和疾病特征性,基于基因组学和生物信息学技术的快速发展,探讨肺癌发生发展过程中lncRNA特异性改变及其调控机制,不仅可深入了解肺癌的发病机理,更重要的是为肺癌早期诊断和早期干预提供可能生物标志。因此,本研究首先选择TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库筛选肺癌相关lncRNA,并结合GEO（Gene Expression Omnibus）数据库对肺癌关键候选lncRNA进行分析。其次通过对中国汉族肺癌人群病例对照研究进一步探讨肺癌相关lncRNA在肺癌人群组织和血清中的表达情况,分析其表达水平与肺癌诊断价值、肺癌发病风险以及与肺癌病人临床特征之间的关系,最终筛选出与肺癌诊断密切相关的lncRNA潜在生物标志物。在此基础上,以筛选出的关键分子LINC00961为研究对象,检测其对肺癌A549细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,并深入研究LINC00961的调控通路。最后,结合最新的m6ARNA甲基化表观遗传调控理论,应用MeRIPseq技术对受m6ARNA甲基化调控的lncRNA进行了进一步探索,并检测了lncRNA在m6ARNA甲基化关键蛋白调控肺癌发生发展过程中的变化趋势,为进一步了解肺癌发生发展机制和肺癌潜在生物标志物筛选提供理论依据。研究方法1.本研究首先将纳入了TCGA数据库中肺腺癌和肺鳞癌人群,按照肺癌分期和淋巴转移进行分组,并对RNA测序数据进行表达差异倍数计算。选取交集差异化表达基因,作为与肺癌分期和淋巴转移相关的关键差异化表达基因,并通过GEO数据库对关键基因进行验证。随后应用Cox比例风险回归模型对肺癌预后相关lncRNA进行筛选,构建肺癌风险评分。综合分析了肺癌中lncRNA的潜在生物标志物作用。2.为研究与肺癌病人分期、转移等临床特征密切相关,并参与肺癌相关通路的关键lncRNA（AFAP1-AS1、CHIAP2、DGCR5、FER1L4、LINC00472、LINC00961和MGC27382）,本研究应用qRT-PCR技术在100对中国汉族人群肺癌组织及癌旁组织和148例中国汉族肺癌病人血清及165例健康对照人群血清中对其表达水平进行研究,运用logistic回归方法分析lncRNA与肺癌发病风险的相关性,应用ROC曲线分析lncRNA表达水平与肺癌诊断价值之间的关系,最后分析lncRNA表达水平与肺癌病人临床特征之间的关系。3.针对筛选出的关键分子LINC00961,构建过表达慢病毒载体,培养LINC00961稳定转染A549细胞株,应用qRT-PCR检测其转染效率,通过CCK-8实验、流式细胞术、划痕实验和Transwell细胞侵袭实验分别检测LINC00961过表达对肺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。在对LINC00961调控机制研究时,首先应用双荧光素酶报告基因和qRT-PCR筛选LINC00961靶向调控的miRNA,应用Western Blot技术检测LINC00961过表达对PI3K-AKT、MAPK和m TOR信号通路关键蛋白的影响,最后在裸鼠荷瘤实验探索LINC00961对肿瘤生长及PI3K-AKT、MAPK和m TOR信号通路的影响,结合体内体外实验来探讨LINC00961对肺癌可能的调控机制。4.为了探讨最新的m6ARNA甲基化及其对lncRNA的表观遗传调控机制在肺癌发生发展过程中的作用,首先检测了肺癌细胞A549和B（a）P 16HBE中的m6ARNA甲基化水平及关键甲基化转移酶METTL3的表达水平。应用MeRIPseq检测技术对sh-METTL3稳定转染A549细胞中的lncRNA和mRNA进行m6ARNA甲基化水平和表达量检测;根据生物信息学分析结果检测METTL3对肺癌细胞生物学功能的影响;最后,结合sh-METTL3稳转A549细胞和B（a）P 16HBE的m6A测序结果,对差异化表达和m6A水平改变的lncRNA进行筛选,应用qRT-PCR技术进一步验证测序结果的准确性。研究结果1.TCGA肺癌相关lncRNA筛选通过对TCGA中肺癌患者的数据分析,分别绘制出肺腺癌和肺鳞癌ceRNA调控网络。其中肺腺癌中共有21种关键lncRNA与临床特征之间存在相关性,肺鳞癌中共有25种关键lncRNA与临床特征之间存在相关性。进一步结合临床特征分析和可能参与的肺癌相关通路对肺腺癌和肺鳞癌中表达趋势一致的17种lncRNA进行分析,结果发现:7种lncRNA（AFAP1-AS1、CHIAP2、DGCR5、FER1L4、LINC00472、LINC00961和MGC27382）与肺癌的分期、转移等重要临床特征相关,并参与肺癌相关的GO功能和KEGG信号通路。GEO数据库的肺癌人群中测序结果分析显示,这7种关键候选lncRNA表达与TCGA数据分析结果相一致。经单变量和多变量Cox比例风险回归分析结果显示:肺腺癌和肺鳞癌中分别有4种和2种lncRNA与总体预后相关。随后通过上述lncRNA分别构建肺腺癌和肺鳞癌的预后风险模型,综合分析提示,风险评分可作为肺腺癌和肺鳞癌的单独预后指标,并具有较高的预后诊断价值。2.中国汉族肺癌人群关键lncRNA生物标志筛选100对肺癌患者组织qRT-PCR结果显示,CHIAP2、LINC00472、LINC00961和MGC27382在肺癌组织中显着下调（P<0.05）,而AFAP1-AS1、DGCR5和FER1L4在肺癌组织中显着上调（P<0.05）。AFAP1-AS1和LINC00472与病理类型显着相关。7种lncRNA均与肺癌发病风险之间存在相关性（P<0.05）,其中AFAP1-AS1、DGCR5和FER1L4表达水平与肺癌发病风险呈正相关关系;CHIAP2、LINC00472、LINC00961和MGC27382表达水平与肺癌发病风险呈负相关。肺癌组织结果提示,7种lncRNA与肺癌的发生发展之间存在密切相关性,具有更高的机制研究价值。148例肺癌病人血清及165例健康对照人群血清qRTPCR结果显示,肺癌人群中的CHIAP2、LINC00961、FER1L4、SFTA1P和LINC00312均显着性下调（P<0.05）,其中CHIAP2、LINC00961、SFTA1P和LINC00312的表达水平与肺癌组织表达水平相符。lncRNA表达水平均与肺癌的发病风险之间存在显着相关性（P<0.05）,且与肺癌发病风险呈负相关。联合ROC曲线分析结果发现,CHIAP2、LINC00961、SFTA1P和LINC00312具有较高的单独诊断价值和联合诊断价值（AUC=0.81）,可能成为肺癌潜在的诊断潜在生物标志物。3.LINC00961对肺癌生物学功能影响及机制研究通过数据库分析和人群病例对照研究发现,LINC00961在肺癌组织和血清中都具有重要的诊断价值。生物信息学分析提示,LINC00961参与了多种肺癌相关调控通路,因此对其进一步开展功能和机制探讨。qRT-PCR结果显示:LINC00961在A549细胞和B（a）P 16HBE细胞中表达水平均下调。CCK-8增殖实验显示,LINC00961可明显抑制A549细胞的增殖作用（P<0.05）。流式细胞术实验结果显示,LINC00961过表达可显着增加凋亡率（P<0.05）。划痕实验和Transwell实验结果显示,LINC00961过表达的A549细胞的迁移和侵袭能力显着降低（P<0.05）。LINC00961双荧光素酶报告基因检测提示,5种miRNA可能与LINC00961直接结合。qRT-PCR和细胞回复实验结果显示:LINC00961可能通过靶向调控miR-19a-3p、miR-19b-3p和miR-125b-5p影响肺癌的发生发展过程。经Western Blot技术检测后,蛋白表达结果显示,LINC00961稳定转染组中PI3KAKT、MAPK和m TOR信号通路中的多种关键蛋白表达量明显降低（P<0.05）。裸鼠荷瘤实验结果显示:LINC00961稳定转染组A549细胞成瘤体积显着减小（P<0.05）。Western Blot结果显示:LINC00961通过调控PI3K-AKT、MAPK和m TOR信号通路影响肿瘤生长。4.m6ARNA甲基化调控lncRNA对肺癌生物学功能影响m6A水平检测结果显示,A549细胞和B（a）P 16HBE细胞的m6A水平均显着升高,说明m6ARNA甲基化参与了肺癌的发生发展并起关键作用。qRT-PCR结果显示:A549细胞中METTL3的表达水平上调3.74倍,B（a）P 16HBE细胞中METTL3的表达水平上调2.81倍。sh-METTL3稳定转染A549细胞的MeRIPseq测序结果显示,共有29,840种基因表达水平发生改变,其中共有5,866种基因的表达水平具有显着性差异（P<0.05）;7,974种基因的m6A水平改变。联合分析结果显示,共有569种lncRNA的表达水平和m6A水平发生改变。细胞功能学实验结果显示:METTL3下调可显着增加细胞凋亡,降低细胞增殖、侵袭和迁移能力。经qRT-PCR检测结果显示,sh-METTL3稳转A549细胞中7种lncRNA（GABPB1-AS1、LINC00662、LINC01184、SNHG15、ZFAS1、MIR4435-2HG和PVT1）表达均下调,与MeRIP-seq测序结果相符。研究结论1.通过对TCGA中肺癌患者的数据分析并构建ceRNA网络发现,共有29种和83种关键lncRNA参与肺腺癌和肺鳞癌ceRNA网络调控。其中共有17种关键lncRNA在肺腺癌和肺鳞癌中表达一致。进一步分析发现,AFAP1-AS1、CHIAP2、DGCR5、FER1L4、LINC00472、LINC00961和MGC27382与肺癌临床特征密切相关,并参与肺癌相关的通路。风险评分可作为肺腺癌和肺鳞癌的单独预后指标,并具有较高的预后诊断价值。2.通过对关键候选lncRNA在肺癌人群中的病例对照研究结合数据库分析结果发现,AFAP1-AS1、CHIAP2、DGCR5、FER1L4、LINC00472、LINC00961和MGC27382与肺癌的发病风险有密切相关性。结合肺癌血清和肺癌组织的表达结果分析发现,CHIAP2、LINC00961、SFTA1P和LINC00312具有较高的单独诊断价值和联合诊断价值,可成为肺癌潜在的诊断生物标志物。3.LINC00961在肺癌A549细胞和B（a）P 16HBE细胞中表达均显着降低。过表达LINC00961可显着抑制A549细胞的增殖、促进凋亡、降低迁移、侵袭和抑制肿瘤形成。双荧光素酶报告基因检测、qRT-PCR、细胞回复实验和Western blot实验结果显示,LINC00961可能通过靶向调控miR-19a-3p、miR-19b-3p和miR-125b-5p调控PI3K-AKT、MAPK和m TOR信号通路进而影响肺癌的发生发展。4.MeRIP-seq测序结果显示,METTL3下调m6A水平改变过程中,共有569种lncRNA表达水平发生改变。结合生物信息分析、生物学功能研究和关键lncRNA表达水平分析结果,提示m6ARNA甲基化可调控lncRNA影响肺癌细胞的生物学功能,在肺癌发生发展过程中起到重要作用。MeRIP-seq测序结果为肺癌发生发展过程中更深入的机制学探讨和生物标志物的发现提供了更有效的线索。综上,本论文研究通过大数据分析筛选从而缩小研究范围,为后续的实验研究提供基础和参考,增加后续研究可靠性、准确性以及更高的针对性。最终为探索肺癌中发挥关键生物学作用的lncRNA分子提供线索,从而为肺癌的三级预防以及环境暴露健康评估提供可靠地理论依据。
梁媛[10]（2020）在《长链非编码RNA LINC00355通过下调miR-195上调CCNE1表达促进肺腺癌细胞的增殖》文中研究指明肺癌的治疗早已进入靶向治疗时代,然而,尽管表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂、间变性淋巴瘤激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂等大批明星靶向药物已成功应用于临床,肺癌五年总体生存率之和仍然低至15.9%。这说明我们对于肺癌的发病机制还缺乏足够的认知,并且缺乏针对早期肺癌的诊断性标志物和治疗靶点。众所周知,基因通常不是单独起作用的,他们的背后往往存在非常复杂的调控网络,近年来越来越多的研究表明非编码RNA在基因表达的启动等过程中发挥重要调控作用。非编码RNA主要分为两个亚型:转录本少于200nt的非编码性小RNA（microRNA）及转录本介于200 nt至100 kb间的长链非编码RNA（1ong non-coding RNA,lncRNA）。既往人们对于非编码RNA的研究主要集中在microRNA,而lncRNA往往被认为是“垃圾RNA”,但近几年来的研究表明它们的异常表达在许多疾病和肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。LncRNA可能通过直接与RNA、DNA或蛋白质结合,在表观遗传、转录及转录后水平通过复杂的调控机制影响细胞增殖、分化、凋亡、迁移及免疫等多种生物学功能,具有较高的组织特异性、敏感性和可靠的稳定性,可作为肿瘤治疗的信息标志物和治疗靶点。这些研究结果使lncRNA成为新的研究热点,并显示出良好的临床应用前景。目的:利用GEO数据库基因芯片及TCGA数据库进行差异性表达靶基因筛选,结果表明CCNE1在肺腺癌中高表达,与不良预后密切相关。进一步预测发现CCNE1可能作为miR-195的靶基因,而长链非编码RNA LINC00355能够与miR-195结合,且与miR-195/CCNE1存在相同的结合位点。同时,利用TCGA数据库分析三者表达水平,结果表明LINC00355及CCNE1在肺腺癌中高表达,miR-195低表达,相关性分析提示miR-195表达水平与LINC00355及CCNE1呈负相关。基于以上数据,我们猜想LINC00355可能通过下调miR-195进而上调CCNE1的表达促进肺腺癌细胞的增殖。目前尚无关于LINC00355具体生物学功能的研究报道,部分关于LINC00355的相关数据库分析提示其在结肠腺癌及膀胱癌中高表达。因此,本研究通过检测LINC00355在肺腺癌组织及细胞中的表达及与临床病理因素、预后之间的关系,并通过体内外实验观察LINC00355的生物学功能。通过分别构建和转染识别miR-195互补序列的突变型/野生型LINC00355及CCNE1质粒,进行靶向关系及调控作用的验证,阐明LINC00355在肺腺癌中发挥作用的可能机制。研究方法:1.通过pubmed GEO数据库下载肺腺癌基因芯片,筛选在肺腺癌及癌旁组织中差异表达比较显着的mRNA-CCNE1,利用TCGA数据库验证CCNE1的表达及与预后的关系。2.生物信息学预测CCNE1可能是miR-195的靶基因,而miR-195可能是长链非编码RNA LINC00355的靶基因。3.利用TCGA数据库分析肺腺癌中LINC00355及miR-195的表达,并进行相关性分析。4.在103例肺腺癌组织和癌旁组织中利用Real-time PCR检测LINC00355的表达,并统计分析患者临床病理学特征与肺癌组织中LINC00355表达水平的关系。5.EDU实验、细胞克隆形成实验、细胞周期实验检测干扰LINC00355前后肺腺癌细胞增殖活性的变化情况。6.流式细胞仪检测干扰LINC00355前后肺腺癌细胞早期凋亡的变化情况。7.Western Blot实验检测干扰LINC00355前后肺腺癌细胞中增殖、周期及凋亡相关蛋白表达的变化情况。8.LncAtlas网站预测并通过FISH实验检测LINC00355在肺腺癌细胞中的亚定位。9.生物信息学预测miR-195与CCNE1和LINC00355的结合位点,分别构建含有miR-195结合位点的突变/野生型LINC00355及CCNE1片段载体。双荧光素酶报告基因实验验证miR-195与CCNE1及LINC00355的靶向关系。10.RNA pull-down及RIP实验进一步验证LINC00355与miR-195的结合以及是否存在于相同的RISC复合体。11.细胞培养并分为Blank组、NC组、sh-LINC00355组、miR-195 mimic、miR-195 inhibitor、miR-195 inhibitor+sh-LINC00355组。RT-PCR检测各组细胞转染后LINC00355、miR-195、CCNE1的表达;Western Blot检测各组增殖、周期及凋亡相关蛋白的表达。12.EDU实验、克隆形成实验、细胞周期及裸鼠成瘤实验检测转染后各组细胞增殖情况,流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。13.采用SPSS22.0统计分析软件对实验数据进行分析,P<0.05说明结果具有统计学意义。结果:1.生物信息学预测LINC00355/miR-195/CCNE1靶向关系并分析三者的表达。从pubmed GEO公共数据库下载肺腺癌全基因组芯片GSE43458数据,CCNE1为差异表达最显着的mRNA,利用TCGA数据库进一步证实CCNE1在肺腺癌中高表达,且与不良预后相关。生物信息学预测得出miR-195可作为与CCNE1相互作用的靶miRNA,进一步预测发现长链非编码RNA LINC00355能够与miR-195靶向结合,并且TCGA数据库分析提示LINC00355在肺腺癌中高表达,miR-195呈低表达,相关性分析显示miR-195表达水平与CCNE1、LINC00355表达均呈负相关。2.分别在肺腺癌组织及细胞系中验证LINC00355的表达。收集辽宁省肿瘤医院103例肺腺癌术后组织学标本,RT-PCR检测LINC00355表达,相比癌旁正常肺组织,LINC00355在肺腺癌组织的表达水平明显升高,这些发现与芯片GSE43458中的结果一致。此外,肺腺癌组织中LINC00355的表达与性别、年龄、有无吸烟史无明显关系,而与肿瘤直径、淋巴结转移及TNM分期相关。RT-PCR检测肺癌细胞株及正常肺上皮细胞HBE中LINC00355、miR-195及CCNE1表达水平,结果显示LINC00355和CCNE1在肺癌细胞株中的表达量高于HBE正常肺上皮细胞,miR-195在肺癌细胞株中的表达量低于HBE正常肺上皮细胞。3.干扰LINC00355可抑制肺腺癌细胞的增殖。EDU法检测结果显示,与NC组比较,sh-LINC00355组细胞增殖较慢。细胞克隆形成实验结果显示与NC组比较,sh-LINC00355组细胞克隆形成能力明显下降。流式细胞术检测细胞周期结果提示干扰LINC00355后细胞出现G1/G0-S期细胞周期阻滞。采用Annexin V FITC/PI双染色方法对干扰LINC00355后进行细胞凋亡分析,结果显示sh-LINC00355组相较于对照组,细胞凋亡比例明显增加。Westernblot检测发现干扰LINC00355后,肺腺癌细胞中CDK6、PCNA、Cyclin-D1和Bcl-2的表达水平均显着下降,而Bax的表达则显着上调。4.LINC00355/miR-195/CCNE1靶向关系的验证。在A549细胞中进行FISH实验证实LINC00355主要存在于细胞浆,通过生物信息学预测miR-195与LINC00355及CCNE1存在共同结合位点。荧光素酶报告基因结果提示,与包含突变型LINC00355及CCNE1片段的荧光素酶报告基因载体相比,过表达miR-195可以使野生型载体组的荧光素酶活性明显下降,提示miR-195与LINC00355及CCNE1存在直接靶向关系。RNA pull-down实验表明,与MUT-miR-195对比,WT-miR-195结合的LINC00355明显增加,再次验证miR-195和LINC00355可以直接结合。RIP实验结果进一步提示Ago2免疫复合物中LINC00355和miR-195的表达水平明显高于Ig G组,提示非小细胞肺癌细胞中LINC00355和miR-195可能存在于相同的RISC复合物中。5.LINC00355负性调控miR-195,正性调控CCNE1,且对CCNE1的调控依赖于miR-195。为进一步验证LINC00355、CCNE1及miR-195三者之间的调控关系,我们首先利用RT-PCR分别检测Blank组、NC组、miR-195 mimic组、miR-195inhibitor组、sh-LINC00355组及miR-195 inhibitor+sh-LINC00355组中LINC00355、CCNE1及miR-195的表达,提示干扰LINC00355可上调miR-195表达,下调CCNE1表达。此外,将6组细胞分别进行EDU实验、细胞克隆形成实验、细胞周期实验、细胞凋亡实验、体内成瘤实验并进一步利用Western Blot检测增殖、周期及凋亡相关蛋白的表达,结果显示,下调LINC00355或过表达miR-195均可抑制A549细胞的增殖,而下调miR-195可逆转敲减LINC00355对A549细胞的增殖抑制作用。结论:1.LINC00355在肺腺癌中高表达并与患者不良预后明显相关;2.体内外实验证明了LINC00355可促进肺腺癌细胞的增殖;3.miR-195与LINC00355及CCNE1存在直接靶向关系;4.LINC00355负性调控miR-195,正性调控CCNE1,且LINC00355对CCNE1的调控依赖于miR-195。因此,综上实验结果证实LINC00355通过下调miR-195上调CCNE1的表达促进肺腺癌细胞的增殖。
二、凋亡调节基因bcl-2和bax在肺鳞癌中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、凋亡调节基因bcl-2和bax在肺鳞癌中的表达（论文提纲范文）
（1）PAQR3逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分:PAQR3在A549细胞中的表达与A549细胞顺铂耐药的相关性 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4.结论 |
| 第二部分 PAQR3逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药机制研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 肺癌多药耐药研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）miRNA 182-5p靶向NOX4/DRP1/NLRP3信号轴缓解哮喘气道炎症的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 慢性哮喘模型的构建及NOX4 在上皮细胞损伤中的作用机制研究 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 小结 |
| 第二部分 OVA模型miRNA芯片分析及miRNA-182-5p靶向NOX4对上皮细胞损伤的调控 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 小结 |
| 第三部分 miRNA-182-5p agomir改善慢性哮喘气道炎症 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间所取得的科研成果 |
| 综述 miRNA在支气管哮喘中的研究进展 |
| 参考文献 |
（3）天麻素通过调控miR-150-5p/NDRG2通路对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞损伤的保护作用研究（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养： |
| 1.2.2 细胞分组和处理： |
| 1.2.3 ELISA试剂盒检测细胞培养液中IL-6和IL-10的含量： |
| 1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡： |
| 1.2.5 qRT-PCR检测细胞内miR-150-5p和NDRG2mRNA的表达 : |
| 1.2.6 Western blot检测细胞内NDRG2、Bcl-2、Bax和cleaved-Caspase-3蛋白的表达 : |
| 1.2.7 双荧光素酶报告基因实验验证miR-150-5p和NDRG2的靶向关系： |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Gas对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞中炎症因子表达的影响 |
| 2.2 Gas对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞凋亡的影响 |
| 2.3 Gas对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞中miR-150-5p和NDRG2表达的影响 |
| 2.4 miR-150-5p靶向调控NDRG2的表达 |
| 2.5 抑制miR-150-5p表达对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞损伤的影响 |
| 2.6 miR-150-5p过表达逆转了Gas(40 μmol/L)对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞损伤的作用 |
| 3 讨论 |
（4）长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 第一部分: 应用生物信息学方法筛选新的肝细胞癌相关的lncRNA/miRNA/mRNA调控轴 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: lncRNA CYTOR/miR-125b-5p/KIAA1522调控轴在肝细胞癌细胞系中的作用 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 非编码RNA在肝细胞癌发生与发展中的调节作用及临床应用(文献综述) |
| 第一章 引言 |
| 第二章 作为ceRNA的ncRNA及其它ncRNA在肝细胞癌发展中的可能作用及机制 |
| 第三章 ncRNA在HCC诊断及预后中的临床应用 |
| 第四章 结论、局限性和展望 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（5）MiR-301a-3p在食管鳞癌组织和细胞中的表达及调节细胞增殖的功能和作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 miR-301a-3p在食管鳞癌组织和细胞中的表达及临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 miR-301a-3p通过调控PI3K/AKT通路影响食管鳞癌细胞增殖 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 miR-301a-3p在食管鳞癌细胞中的作用靶基因的筛选及验证 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 miR-301a在良恶性疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）参七化痰方治疗AECOPD临床疗效观察及其含药血清对气道平滑肌细胞RhoA/ROCK信号通路的影响研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 理论研究 |
| 理论研究一 慢性阻塞性肺疾病“虚、痰、瘀”病机及治则治法研究 |
| 1 正气亏虚为根本 |
| 1.1 病变初期,肺脏气虚 |
| 1.2 肺虚日久,子盗母气 |
| 1.3 肺脾及肾,肾失摄纳 |
| 2 痰瘀互结致标实 |
| 2.1 痰饮内伏为慢阻肺病情缠绵的关键 |
| 2.2 瘀血阻络为慢阻肺久治不愈的核心 |
| 3 外感六淫为诱因 |
| 4 小结 |
| 理论研究二 RhoA/ROCK信号通路及其与慢性阻塞性肺疾病相关性研究 |
| 1 Rho A/ROCK信号通路及其结构功能 |
| 1.1 Rho A/ROCK信号转导通路组成 |
| 1.2 Rho A/ROCK信号通路功能 |
| 2 Rho A/ROCK信号通路与COPD气道重塑 |
| 2.1 Rho A/ROCK信号通路与气道炎症 |
| 2.2 Rho A/ROCK信号通路与气道平滑肌细胞 |
| 3 Rho A/ROCK与 MAPK/ERK信号通路之间的联系 |
| 4 小结 |
| 理论研究三 TGF-β1及其与慢性阻塞性肺疾病相关性研究 |
| 1 TGF-β及其结构功能 |
| 2 TGF-β1 及其与COPD相关性研究 |
| 2.1 TGF-β1 |
| 2.2 TGF-β1与COPD气道炎症 |
| 2.3 TGF-β1 与气道平滑肌细胞 |
| 3 小结 |
| 第二章 临床研究 |
| 1 资料 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳入标准 |
| 1.4 排除标准 |
| 1.5 剔除标准 |
| 2 方法 |
| 2.1 分组方法 |
| 2.2 对照组治疗 |
| 2.3 治疗组治疗 |
| 2.4 观测指标及方法 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 两组基线资料比较 |
| 3.2 两组中医证候疗效比较 |
| 3.3 两组中医主要症状及体征积分比较 |
| 3.4 两组m MRC问卷比较 |
| 3.5 两组肺功能比较 |
| 3.6 两组血清WBC、Neut%、hs-CRP、TGF-β1、ROCK1 比较 |
| 3.7 两组血气分析比较 |
| 3.8 两组凝血指标比较 |
| 3.9 安全性评价 |
| 3.10 TGF-β1 与各指标之间相关性比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 益气活血化痰法的应用及内涵 |
| 4.2 益气活血化痰法治疗慢阻肺急性加重期的依据 |
| 4.3 益气活血化痰法影响相关指标的主要意义 |
| 5 小结 |
| 第三章 实验研究 |
| 实验研究一 参七化痰方含药血清对TGF-β1 刺激的气道平滑肌细胞影响的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 饲养环境 |
| 1.3 实验药品 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 ASMCs的分离、培养及鉴定 |
| 2.2 SQHT配方的制备 |
| 2.3 SQHT含药血清的制备 |
| 2.4 ASMCs的分组及处理 |
| 2.5 CCK-8 检测细胞增殖活力 |
| 2.6 Transwell法检测细胞迁移能力 |
| 2.7 细胞免疫荧光 |
| 2.8 流式细胞术检测细胞凋亡能力 |
| 2.9 Westernblot检测Rho A、ROCK1、ROCK2、Bax、Bcl-2蛋白的变化 |
| 2.10 实时荧光定量PCR |
| 2.11 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 ASMCs细胞的鉴定结果 |
| 3.2 不同浓度SQHT含药血清对TGF-β1 刺激下ASMCs增殖影响 |
| 3.3 不同浓度SQHT对 TGF-β1 刺激下ASMCs迁移的影响 |
| 3.4 不同浓度SQHT对 TGF-β1 刺激下ASMCs细胞骨架重组的影响 |
| 3.5 不同浓度SQHT对 TGF-β1 刺激下ASMCs细胞凋亡的影响 |
| 3.6 不同浓度SQHT对 TGF-β1 刺激下ASMCs细胞Bax、Bcl-2表达水平的影响 |
| 3.7 不同浓度SQHT对 TGF-β1 刺激下ASMCs细胞Rho A、ROCK1、ROCK2 表达水平的影响 |
| 实验研究二 参七化痰方含药血清对TGF-β1 刺激的细胞增殖、迁移、细胞骨架重组及凋亡影响的机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 饲养环境 |
| 1.3 实验药品 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 ASMCs的分离、培养及鉴定 |
| 2.2 SQHT配方的制备 |
| 2.3 SQHT含药血清的制备 |
| 2.4 ASMCs的分组及处理 |
| 2.5 CCK-8 |
| 2.6 Transwell |
| 2.7 细胞免疫荧光 |
| 2.8 流式细胞术 |
| 2.9 Western blot |
| 2.10 实时荧光定量PCR |
| 2.11 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 SQHT对 TGF-β1 刺激下ASMCs细胞增殖的影响 |
| 3.2 SQHT对 TGF-β1 刺激下ASMCs细胞迁移的影响 |
| 3.3 SQHT对 TGF-β1 刺激下ASMCs细胞骨架重组的影响 |
| 3.4 SQHT对 TGF-β1 刺激下ASMCs细胞凋亡率的影响 |
| 3.5 SQHT与抑制剂法舒地尔对TGF-β1 刺激下ASMCs细胞Bax、Bcl-2 表达水平的影响 |
| 3.6 SQHT与抑制剂法舒地尔对TGF-β1 刺激下ASMCs细胞Bax m RNA、Bcl-2 m RNA表达水平的影响 |
| 实验研究三 基于Rho A/ROCK与MAPK/ERK信号通路研究参七化痰方含药血清对TGF-β1 刺激的气道平滑肌细胞影响的分子机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 饲养环境 |
| 1.3 实验药品 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 ASMCs的分离、培养及鉴定 |
| 2.2 SQHT配方的制备 |
| 2.3 SQHT含药血清的制备 |
| 2.4 ASMCs的分组及处理 |
| 2.5 Western blot |
| 2.6 实时荧光定量PCR |
| 2.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 SQHT与抑制剂法舒地尔对TGF-β1 刺激下ASMCs细胞Rho A、ROCK1、ROCK2 表达水平的影响 |
| 3.2 SQHT与抑制剂法舒地尔对TGF-β1 刺激下ASMCs细胞Rho A m RNA, ROCK1 m RNA, ROCK2 m RNA表达水平的影响 |
| 3.3 SQHT与抑制剂法舒地尔对TGF-β1 刺激下ASMCs细胞ERK1/2、p-ERK1/2 表达水平的影响 |
| 实验研究四 参七化痰含药血清对TGF-β1 刺激的气道平滑肌细胞Snail、Slug、MMP-9、TIMP-1 水平的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 饲养环境 |
| 1.3 实验药品 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 ASMCs的分离、培养及鉴定 |
| 2.2 SQHT配方的制备 |
| 2.3 SQHT含药血清的制备 |
| 2.4 ASMCs的分组及处理 |
| 2.5 Western blot检测Snail、Slug水平的变化 |
| 2.6 实时荧光定量PCR检测Snail、Slug水平的变化 |
| 2.7 酶联免疫吸附试验定量测定MMP-9、TIMP-1 水平的变化 |
| 2.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 SQHT与抑制剂法舒地尔对TGF-β1 刺激下ASMCs细胞Snail、Slug蛋白表达水平的影响 |
| 3.2 SQHT与抑制剂法舒地尔对TGF-β1 刺激下ASMCs细胞Snail m RNA、Slug m RNA表达水平的影响 |
| 3.3 SQHT与抑制剂法舒地尔对TGF-β1 刺激下ASMCs细胞培养上清液MMP-9、TIMP-1 水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 参七化痰方的配伍及其内涵 |
| 4.2 参七化痰方的拆方分析及现代药理 |
| 4.3 参七化痰方影响相关指标的主要意义 |
| 第四章 结论 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 益气活血化痰法治疗 AECOPD 的临床疗效观察表 |
| 综述 中西医结合治疗慢性阻塞性肺疾病的切入点述评 |
| 综述参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表专着论文及参与课题情况 |
（7）α-硫辛酸对白细胞介素1β诱导的软骨细胞损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 一般材料 |
| 1.2 大鼠膝关节软骨细胞分离及培养 |
| 1.3 细胞分组和处理 |
| 1.4 q RT-PCR检测 |
| 1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 1.6 试剂盒检测IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量 |
| 1.6.1 蛋白质印迹法检测蛋白表达情况 |
| 1.6.2 双荧光素酶报告基因实验 |
| 1.7 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 α-硫辛酸对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的影响 |
| 2.2 α-硫辛酸对IL-1β诱导的软骨细胞中mi R-877和NDRG2表达的影响 |
| 2.3 mi R-877靶向调控NDRG2的表达 |
| 2.4 抑制mi R-877表达对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的影响 |
| 2.5 NDRG2过表达对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的影响 |
| 2.6 过表达mi R-877逆转了α-硫辛酸对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的作用 |
| 3 讨论 |
（8）MiR-196b靶向PCDH-17调控人喉鳞状细胞癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 喉鳞状细胞癌的发病率及病因 |
| 1.2 miRNAs与喉鳞状细胞癌关联性分析 |
| 1.3 miR-196b介绍 |
| 1.4 PCDH-17介绍 |
| 1.5 课题研究的前景与意义 |
| 第一部分 :miR-196b、PCDH-17 表达在人喉鳞状细胞癌中的差异性表达及与患者预后关联性分析 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 实验试剂及仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 一般临床资料分析 |
| 3.2 RT-PCR检测喉鳞癌及癌旁组织中miR-196b及 PCDH-17的mRNA表达 |
| 3.3 免疫组织化学染色检测喉鳞癌及癌旁组织中PCDH-17蛋白阳性率表达 |
| 3.4 miR-196b、PCDH-17 表达与喉鳞癌患者临床病理特征相关性 |
| 3.5 miR-196b、PCDH-17 mRNA表达Pearson分析 |
| 3.6 miR-196b、PCDH-17 表达与喉鳞癌患者生存率相关性 |
| 4.讨论 |
| 5.研究结论 |
| 第二部分 :miR-196b靶向PCDH-17 调控人喉鳞状细胞癌进展的机制研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 实验试剂及设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 .miR-196b靶向PCDH-17 分析 |
| 3.2 .RT-PCR检测各组细胞内miR-196b及 PCDH-17的mRNA表达 |
| 3.3 .Western-blot检测各组细胞内PCDH-17 的蛋白浓度表达 |
| 3.4 .CCK-8检测各组细胞增殖活性 |
| 3.5 Annexin V法检测各组细胞凋亡性 |
| 3.6 划痕实验 |
| 3.7 Transwell实验 |
| 3.8 Western-blot检测 |
| 4.讨论 |
| 5.研究结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 miRNAs在喉鳞状细胞癌治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
（9）肺癌lncRNA生物标志筛选及功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 肺癌lncRNA筛选和ceRNA网络及预后风险模型构建 |
| 第一节 肺癌lncRNA筛选和ceRNA网络构建 |
| 1 研究对象与研究方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 TCGA肺癌病例基本信息 |
| 2.2 肺癌相关的关键lncRNA分析 |
| 2.3 肺腺癌和肺鳞癌相关的功能分析 |
| 2.4 miRNA靶基因预测和ceRNA调控网络的构建 |
| 2.5 肺癌关键lncRNA与肺癌患者临床特征因素之间的关系 |
| 2.6 肺癌交集关键lncRNA筛选 |
| 2.7 GEO数据库验证 |
| 第二节 肺癌预后相关lncRNA筛选和预后风险评分构建 |
| 1 研究对象与研究方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 肺癌相关差异表达lncRNA分析 |
| 2.2 预后相关lncRNA筛选及预后风险得分构建 |
| 2.3 lncRNA风险得分与临床特征的相关性 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 第二章 肺癌人群候选lncRNA表达水平与肺癌发病风险及临床特征 |
| 第一节 候选lncRNA组织表达水平与肺癌发病风险及临床特征关系的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 肺癌人群基本情况 |
| 2.2 候选lncRNA的 qRT-PCR表达检测 |
| 2.3 候选lncRNA与临床特征相关性的研究 |
| 2.4 候选lncRNA与肺癌发病风险的关系研究 |
| 2.5 候选lncRNA对肺癌诊断价值的研究 |
| 第二节 候选lncRNA血清表达水平与肺癌发病风险及临床特征关系的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 候选lncRNA的 qRT-PCR表达检测 |
| 2.2 候选lncRNA与临床特征之间的关系研究研究 |
| 2.3 候选lncRNA与肺癌发病风险的关系研究 |
| 2.4 候选lncRNA对肺癌的诊断价值 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 LINC00961 对肺癌生物学功能影响及机制研究 |
| 第一节 LINC00961 在肺癌中的生物学功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 LINC00961 细胞中表达水平检测 |
| 2.2 LINC00961 稳定转染A549 细胞株及转染效率检测 |
| 2.3 LINC00961 过表达对A549 细胞增殖的影响 |
| 2.4 LINC00961 过表达对A549 细胞凋亡的影响 |
| 2.5 LINC00961 过表达对A549 细胞迁移的影响 |
| 2.6 LINC00961 过表达对A549 细胞侵袭的影响 |
| 第二节 LINC00961 对肺癌PI3K-AKT、MAPK和 m TOR信号通路调控研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 双荧光素酶报告基因检测LINC00961 靶向调控的miRNA |
| 2.2 qRT-PCR验证miRNA表达 |
| 2.3 肺癌A549 细胞功能回复实验 |
| 2.4 LINC00961对PI3K-AKT、MAPK和 m TOR信号通路的调控作用 |
| 2.5 LINC00961 对肺癌A549 细胞在裸鼠体内的成瘤的影响 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 第四章 m6ARNA甲基化调控lncRNA对肺癌生物学功能影响 |
| 第一节 肺癌组织和细胞中m6A水平及METTL3 表达水平检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞中m6A水平检测结果 |
| 2.2 METTL3 在细胞和TCGA数据库中的表达水平检测 |
| 第二节 METTL3对lncRNA的 m6A水平及表达量的影响研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 METTL3 干扰慢病毒稳定转染A549 细胞株及转染效率检测 |
| 2.2 测序序列统计与质量控制 |
| 2.3 参考基因组比对区域分布 |
| 2.4Reads在基因上分布、差异Peak分析及Motif分析 |
| 2.5 基因差异结果分析 |
| 2.6 差异基因GO富集分析和KEGG富集分析 |
| 2.7 差异基因与差异Peak关联分析结果 |
| 第三节 m6ARNA甲基化调控lncRNA对肺癌细胞生物学功能影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 sh-METTL3对A549 细胞增殖的影响 |
| 2.2 sh-METTL3对A549 细胞凋亡的影响 |
| 2.3 sh-METTL3对A549 细胞迁移的影响 |
| 2.4 sh-METTL3对A549 细胞侵袭的影响 |
| 2.5 lncRNA在 m6A参与肺癌发生过程中的作用 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 Review 癌症中竞争性内源性 RNA 的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）长链非编码RNA LINC00355通过下调miR-195上调CCNE1表达促进肺腺癌细胞的增殖（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :LINC00355在肺腺癌中的表达及对肺腺癌细胞生物学功能的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验对象、材料与试剂 |
| 2.1.1 患者标本 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.1.5 主要RT-PCR引物序列 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 细胞转染 |
| 2.2.4 qRT-PCR |
| 2.2.5 EDU实验 |
| 2.2.6 克隆形成实验 |
| 2.2.7 流式细胞仪检测周期及凋亡 |
| 2.2.8 Westernblot实验 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 生物信息学预测LINC00355/miR-195/CCNE1靶向关系及在肺腺癌中的表达 |
| 3.2 在肺腺癌组织及细胞系中分别验证LINC00355/miR-195/CCNE1 的表达 |
| 3.3 下调LINC00355抑制肺腺癌细胞增殖 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :LINC00355 通过下调miR-195 上调CCNE1 表达促进肺腺癌细胞的增殖 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 qRT-PCR |
| 2.2.2 双荧光素酶报告基因分析 |
| 2.2.3 RNA免疫共沉淀(RIP) |
| 2.2.4 荧光原位杂交 |
| 2.2.5 RNA pull-down |
| 2.2.6 裸鼠成瘤实验 |
| 2.2.7 EDU实验、细胞克隆形成实验、流式细胞实验、Westernblot实验 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 LINC00355在肺腺癌细胞中亚细胞定位的验证 |
| 3.2 miR-195 可与LINC00355及CCNE1 直接结合 |
| 3.3 miR-195以Ago2 依赖的方式与LINC00355 靶向结合 |
| 3.4 下调LINC00355 可提高肺腺癌细胞中miR-195 的表达,降低CCNE1 的表达 |
| 3.5 体外实验验证下调LINC00355 或过表达miR-195 抑制肺腺癌细胞增殖 |
| 3.6 体内裸鼠成瘤实验验证下调LINC00355 或过表达miR-195 抑制肺腺癌细胞增殖 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、凋亡调节基因bcl-2和bax在肺鳞癌中的表达（论文参考文献）
- [1]PAQR3逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药机制研究[D]. 方世旭. 遵义医科大学, 2021(01)
- [2]miRNA 182-5p靶向NOX4/DRP1/NLRP3信号轴缓解哮喘气道炎症的作用及机制研究[D]. 王知广. 延边大学, 2021(02)
- [3]天麻素通过调控miR-150-5p/NDRG2通路对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞损伤的保护作用研究[J]. 扶剑,潘征夏,吴春,林芳. 毒理学杂志, 2021(02)
- [4]长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究[D]. 胡博. 北京协和医学院, 2021(02)
- [5]MiR-301a-3p在食管鳞癌组织和细胞中的表达及调节细胞增殖的功能和作用机制[D]. 张难. 河北医科大学, 2021(02)
- [6]参七化痰方治疗AECOPD临床疗效观察及其含药血清对气道平滑肌细胞RhoA/ROCK信号通路的影响研究[D]. 陈晶晶. 安徽中医药大学, 2021(01)
- [7]α-硫辛酸对白细胞介素1β诱导的软骨细胞损伤的保护作用[J]. 邓慧琳,杨婧,郭俐. 安徽医药, 2021(01)
- [8]MiR-196b靶向PCDH-17调控人喉鳞状细胞癌进展的机制研究[D]. 罗敏. 安徽医科大学, 2020(04)
- [9]肺癌lncRNA生物标志筛选及功能研究[D]. 隋静. 东南大学, 2020
- [10]长链非编码RNA LINC00355通过下调miR-195上调CCNE1表达促进肺腺癌细胞的增殖[D]. 梁媛. 中国医科大学, 2020(01)