HLA-G与肿瘤免疫逃逸

一、HLA-G与肿瘤免疫逃逸（论文文献综述）

陈佩瑶,贾军梅^[1]（2021）在《缺氧影响免疫治疗耐药的机制与应用》文中提出免疫治疗是一种新型抗肿瘤方法,免疫检查点抑制剂的应用大大提高了患者的生存获益,但是免疫治疗耐药问题影响治疗疗效。因此,探索肿瘤免疫治疗耐药机制及解决耐药问题至关重要。肿瘤微环境缺氧状态是免疫耐药的关键因素,缺氧通过多种作用机制抑制免疫细胞杀伤功能,促肿瘤细胞免疫逃逸;阻断缺氧相关通路可能成为克服免疫治疗耐药的突破点。通过总结缺氧状态诱导免疫治疗耐药的机制,有助于探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）相关蛋白靶向药在免疫治疗临床应用中的发展前景。

宫文静^[2]（2021）在《ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景在所有恶性肿瘤中,肺癌的发病率和死亡率均位居首位。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌最主要的类型,占全部肺癌的80-85%。NSCLC起病隐匿,多数患者就诊时已处于疾病中晚期。近年来随着手术、化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗等多种治疗手段的发展,NSCLC的预后有了很大改善,但其整体5年生存率仍仅有20%,而复发和转移是NSCLC治疗失败的最主要因素。众所周知,肿瘤的生长和转移依赖新生血管的形成来提供能量及转移路径,因此抗血管生成治疗成为NSCLC整体治疗重要组成部分。目前临床中抗肿瘤血管生成的治疗策略主要包括:针对VEGF/VEGFR通路的大分子单克隆抗体、多靶点小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）类药物和血管内皮抑制素等。但由于肿瘤微环境中促血管生成旁路信号的激活、抗体结合力降低等原因,导致现有的抗血管生成药物的临床获益普遍较为短暂;此外,多靶点抗血管生成药物因其作用机制复杂,毒性反应较重,也在某种程度上限制了其临床应用。因此,探索NSCLC血管生成的分子机制,寻找新的有效治疗靶点,开发更具特异性的高效低毒的抗血管生成药物,是克服肿瘤血行转移、提高临床获益的重要研究方向,对提高NSCLC的治疗水平、改善患者预后具有重要意义。免疫球蛋白样转录子（immunoglobulin-like transcripts,ILTs）,也被称为白细胞免疫球蛋白样受体（leukocyte immunoglobulin-like receptors,LIR or LILR）,或单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体（monocyte/macrophage immunoglobulin-like receptors,MIR）。根据胞内基序的作用不同分别将ILTs（LILRs）分为激活性受体LILRA（白细胞免疫球蛋白样受体亚型A,leucocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A）和抑制性受体 LILRB（白细胞免疫球蛋白样受体亚型 B,leucocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B）。激活性受体LILRA包括LILRA1-LILRA6这6种受体;而抑制性受体LILRB包括LILRB1-5这5种受体。ILT4又被称为LILRB2、LIR2,单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体10（monocyte/macrophage immunoglobulin-like 10,MIR-10）或 CD85d,是经典的免疫抑制性受体。作为I型跨膜蛋白,ILT4与不同的配体结合,通过胞内3个酪氨酸激酶抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs,ITIMs）传递抑制信号至胞内。ILT4起初发现主要表达于髓系细胞包括树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和血小板。最近研究显示它也表达于活化的CD4+T细胞中。ILT4通过抑制树突状细胞的成熟和抗原提呈、诱导巨噬细胞和髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）M2 样极化、抑制中性粒细胞的吞噬功能、促进CD4+Th2分化等方式,诱导免疫抑制的微环境。除免疫细胞外,近年来研究发现ILT4在乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、原发性肝癌和非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤细胞也高表达,通过多种机制促进肿瘤细胞的增殖和侵袭,诱导M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）募集及T细胞老化和免疫浸润。课题组前期通过基因芯片发现ILT4可以上调血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGF-A）和基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9,MMP9）这两种促血管生成因子的表达。VEGF-A是血管内皮细胞强有力的促细胞分裂剂,是调控血管生成的经典因子;MMP9也被证实能够促进血管基底膜的分解,诱导内皮细胞迁移,促进新生血管形成。因此我们推测ILT4可能与调控肿瘤新生血管密切相关。由于目前国内外针对ILT4在肿瘤新生血管形成方面的研究尚属空白,考虑到目前NSCLC抗血管生成治疗的局限性,以及我们课题组前期基因芯片的发现,本研究拟从组织水平、细胞水平以及大数据分析进行一系列研究检测ILT4对NSCLC血管生成的作用,并通过体外和体内干预性研究对可能的分子机制进行进一步的探索。该研究结果可能会为ILT4在NSCLC抗血管生成方面的研究带来新的突破。研究目的1.通过免疫组化、qPCR和Western blot检测NSCLC组织和细胞株中ILT4的表达,结合生存随访和GEO（Gene Expression Omnibus）数据库的生存信息,明确ILT4在NSCLC中的表达及预后意义;2.通过检测NSCLC组织中微血管密度（microvascular density,MVD）以及体外研究通过上调和沉默ILT4表达检测ILT4对血管内皮细胞迁移和小管生成的影响,结合数据库分析,明确ILT4对血管生成的作用;3.通过转染过表达、敲低ILT4,检测ILT4调控的促血管生成因子的变化、信号通路蛋白的变化及应用相应的促血管生成因子中和抗体、信号通路抑制剂进行干预,探究ILT4调控血管生成的分子机制;4.利用ILT4过表达/敲除肺癌细胞系建立裸鼠体内移植瘤模型,进一步体内验证ILT4对血管生成的影响及可能的分子机制。研究方法1.通过qPCR和Western blot方法检测NSCLC细胞和正常支气管上皮细胞中ILT4表达,明确ILT4在NSCLC细胞和正常支气管上皮细胞表达的差异,并筛选出内源性低表达ILT4的细胞系H1650、A549和内源性高表达ILT4的细胞系H1299、H1975。2.通过免疫组织化学方法检测ILT4在NSCLC组织和癌旁组织表达的差异,分析ILT4的表达与NSCLC临床病理指标的相关性;随访病人的生存状况,应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,分析ILT4对NSCLC患者总生存的影响;同时结合Kaplan-Meier Plotter在线生存分析系统,分析ILT4表达对肺癌患者预后的影响。3.应用免疫组化的方法检测NSCLC组织中ILT4表达与肿瘤微血管密度相关蛋白的表达情况,同时结合 GEPIA（gene expression profiling interactive analysis）数据库,统计分析ILT4与微血管密度的相关性,ILT4/CD34共表达与临床病理参数的相关性。4.采用转染技术,将携带ILT4过表达载体的慢病毒转染内源性ILT4低表达的H1650、A549细胞株,上调H1650、A549细胞中的ILT4的表达,空载体作为对照;将携带ILT4短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）慢病毒转染内源性ILT4过表达的H1975、H1299细胞株,以下调ILT4的表达,空载体作为对照。收集该细胞培养基作为条件培养基,用于培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelia cells,HUVECs）。应用 qPCR 和 Western blot实验方法验证转染效果。采用Transwell细胞迁移实验和HUVECs小管形成实验检测ILT4过表达及敲除对血管内皮细胞迁移能力和小管形成能力的影响。5.通过基因芯片技术发现ILT4上调后可引起促血管生成因子VEGF-A和MMP9表达的上调。细胞水平上,通过转染技术上调和下调NSCLC细胞ILT4的表达,利用qPCR和Western blot技术验证ILT4对VEGF-A和MMP9表达的调节作用;组织水平上,通过将NSCLC组织连续切片应用免疫组化验证ILT4与VEGF-A、MMP9在组织中表达的相关性。6.采用转染技术,将内源性低表达ILT4的细胞系H1650和A549过表达ILT4,采用VEGF-A中和抗体或MMP9中和抗体进行干预,收集条件培养基,应用Transwell细胞迁移实验和HUVECs小管形成实验观察条件培养基对血管内皮细胞迁移能力和成管能力的影响。7.结合基因微阵列筛选出ILT4调控的信号通路,采用转染技术过表达和沉默NSCLC细胞ILT4的表达,利用Western blot技术检测ILT4对促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路中关键蛋白及其磷酸化水平的影响,包括pERK、ERK、pp38、p38、pJNK和JNK。8.将内源性低表达ILT4的细胞系H1650和A549过表达ILT4后,加入ERK抑制剂、p38抑制剂进行干预,分别阻断ERK信号通路,p38信号通路,应用Western blot方法检测通路抑制后VEGF-A和MMP9的表达情况,采用Transwell细胞迁移实验和小管形成实验观察ERK信号通路在ILT4调控血管生成方面的作用。9.通过慢病毒感染建立稳定ILT4过表达的NSCLC细胞株A549 LV-ILT4和对照组细胞株A549 LV-NC;建立稳定干扰ILT4的NSCLC细胞株H1299 LV-shILT4和对照组细胞株H1299 LV-shNC,选择BALB/c Nude裸鼠皮下注射上述细胞,体内实验观察ILT4对NSCLC细胞体内成瘤能力的影响;利用免疫组化的方法检测移植瘤组织中微血管密度,同时检测促血管生成因子VEGF-A、MMP9和信号通路ERK和pERK蛋白表达,进一步验证ILT4对血管生成能力的影响。研究结果1.ILT4在NSCLC细胞系和NSCLC肿瘤组织中高表达qPCR和Western blot检测显示ILT4在NSCLC细胞中的表达高于正常支气管上皮细胞。内源性低表达ILT4的细胞系为H1650和A549,内源性高表达ILT4的细胞系为H1299和H1975。免疫组化显示ILT4在NSCLC肿瘤组织中的表达高于肿瘤周围正常组织,ILT4在肿瘤组织的阳性表达率为:57.7%（52/90）,在周围正常组织中的阳性率为4.4%（4/90）。2.ILT4表达与NSCLC患者临床病理指标及患者预后的相关性ILT4在NSCLC肿瘤组织中的表达与较晚的TNM分期（III期-IV期,p=0.0104）,淋巴结转移（p=0.001）成正相关。随访90例NSCLC患者生存,Kaplan-Meier生存分析显示ILT4高表达患者的OS低于ILT4低表达患者OS（p=0.0419）。利用Kaplan-Meier Plotter在线生存分析系统分析ILT4对肺癌患者预后的影响,采用包含ILT4基因特定序列的探针进行测探,探针207697xat信息显示ILT4高表达组患者总生存OS（p=0.056）及中位至疾病进展时间FP均低于ILT4低表达组（p=0.022）。3.ILT4表达水平与NSCLC瘤内微血管密度的相关性,ILT4/CD34共表达与临床病理指标的相关性目前尚没有ILT4在NSCLC血管生成方面的研究,我们探索性的分析了ILT4表达水平与NSCLC肿瘤组织中的微血管密度的相关性。采用临床常用的CD34阳性的细胞表达情况代表微血管密度。GEPIA数据库分析提示,ILT4与CD34表达呈正相关;组织标本免疫组化结果提示ILT4高表达组的微血管密度显着高于ILT4低表达组的微血管密度（p=0.0058）。同时ILT4+/CD34+共表达患者,较ILT4-/CD34-组患者,有更高的淋巴结转移率（p=0.0466）,共表达组腺癌的患者比例明显增高（p=0.0 12）。4.ILT4促进HUVECs细胞迁移能力和HUVECs小管形成能力Transwell细胞迁移实验证实过表达ILT4的H1650和A549的条件培养基促进HUVECs细胞迁移,并提高其成管能力;ILT4下调的H1975和H1299的条件培养基抑制HUVECs的细胞迁移,减弱其成管能力。5.ILT4可以上调NSCLC中促血管生成因子VEGF-A和MMP9的表达基因芯片检测提示肿瘤细胞ILT4过表达可引起VEGF-A和MMP9基因表达上调。在细胞水平上,通过qPCR和Western blot结果提示过表达ILT4后的NSCLC细胞系VEGF-A和MMP9的RNA水平和蛋白水平均明显升高;下调ILT4表达后的NSCLC细胞系VEGF-A和MMP9的RNA水平和蛋白水平均显着下降;组织水平上,在病理连续切片中通过免疫组化提示ILT4高表达组织中VEGF-A、MMP9的蛋白表达水平偏高。6.ILT4通过调控NSCLC细胞的VEGF-A、MMP9表达参与血管内皮细胞迁移和HUVECs小管形成内源性低表达ILT4的H1650和A549细胞系过表达ILT4后,加入VEGF-A中和抗体或MMP9中和抗体进行干预,收集条件培养基,培养HUVECs,结果示阻断VEGF-A、MMP9表达后,HUVECs细胞迁移能力明显降低;HUVECs的小管形成能力明显下降。7.ILT4可以激活NSCLC细胞ERK、p38信号通路基因微阵列分析提示上调ILT4后可引起MAPK信号通路中多种基因的表达。MAPK信号通路主要包括ERK通路,JNK通路和p38信号通路。Western blot实验提示H1650和A549细胞过表达ILT4后,肿瘤细胞的pERK、pp38水平升高,H1975和H1299细胞下调ILT4表达后,pERK,pp38蛋白表达水平均明显降低。8.ILT4通过激活ERK信号通路促进VEGF-A、MMP9表达将内源性低表达ILT4的H1650、A549细胞过表达ILT4后,加入ERK抑制剂U0126和p38通路抑制剂SB 203580（20μM）进行干预,培养48小时,收集条件培养基,Western blot提示加入ERK抑制剂U0126后ILT4过表达上调的VEGF-A、MMP9表达被显着逆转,加入p38通路抑制剂对VEGF-A、MMP9表达无影响。9.ILT4通过ERK信号通路调控血管内皮迁移和HUVECs的小管形成Transwell迁移实验和HUVECs小管形成实验证实抑制ERK信号通路后,ILT4上调的血管内皮细胞迁移能力和成管能力均显着逆转。结果提示:ILT4通过ERK信号通路诱导VEGF-A、MMP9表达并调控血管内皮细胞迁移和HUVECs的小管形成。10.ILT4促进NSCLC细胞体内成瘤及血管生成通过裸鼠皮下注射稳定过表达ILT4的NSCLC细胞株A549 LV-ILT4,和注射稳定干扰ILT4表达的细胞株H1299 LV-shILT4,建立裸鼠移植瘤模型,结果提示ILT4过表达组,NSCLC肿瘤生长速度显着快于对照组,ILT4过表达组的肿瘤体积和重量明显大于对照组;干扰ILT4表达组,肿瘤生长速度显着慢于对照组,ILT4干扰组的肿瘤体积和重量明显小于对照组。通过建立裸鼠移植瘤模型,造模4周后,分离肿瘤组织行免疫组化,结果提示ILT4过表达组,肿瘤微血管密度显着高于对照组,VEGF-A和MMP9表达高于对照组,pERK明显高于对照组,ERK表达无明显改变;干扰ILT4表达后,肿瘤微血管密度显着低于对照组,VEGF-A和MMP9表达低于对照组,pERK明显低于对照组,ERK表达无明显改变。体内实验进一步支持ILT4具有促进NSCLC血管生成的潜力。结论1.ILT4在NSCLC组织中及多个NSCLC细胞株中高表达,与更晚的病理分期、淋巴结转移及临床不良预后明显相关,可作为预后预测因子。体内体外实验证实ILT4可促进NSCLC血管生成。2.体外实验证实了 ILT4通过激活ERK信号通路上调VEGF-A、MMP9的表达并促进NSCLC血管内皮细胞迁移和小管形成,体内实验进一步验证了 ILT4对NSCLC血管生成的作用及潜在机制。

李青^[3]（2021）在《ILT4通过调控肿瘤浸润T淋巴细胞亚群诱导肺腺癌的免疫逃逸》文中研究说明肺癌是全球发病率、死亡率最高的恶性肿瘤。据文献报道,过去的40年里,肺癌的5年生存率小于21%。肺腺癌（Lungadenocarcinoma,LUAD）作为非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）最重要的亚型,发病率逐渐增多,成为备受关注的NSCLC亚型。伴随着靶向治疗的出现,晚期LUAD患者的5年总生存有所改善,但仍面临靶向药物耐药、获益人群受限、缓解率不高等问题。以PD-1/PD-L1、CTLA-4等免疫检查点阻断（Immunecheckpointblockade,ICB）及以抗原嵌合受体T细胞（CAR-T）治疗为代表的过继性T细胞转移（ACT）治疗的出现为晚期肺癌患者带来了新的希望。而目前PD-I/PD-L1抑制剂在实体瘤的临床有效率及瘤种反应率不尽相同。单纯抗PD-1/PD-L1免疫治疗在晚期NSCLC的客观有效率仅为20%,除了患者选择不足和肿瘤自身免疫原性低外,复杂的免疫抑制微环境,包括抑制性免疫细胞、细胞因子和代谢物,以及肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs）数量和功能下降,是T细胞免疫和有效ICB治疗的主要障碍。因此,寻找新的免疫检查点分子作为替代或补充,以突破肿瘤免疫抑制性屏障,逆转肿瘤免疫抑制微环境是目前肿瘤免疫治疗亟需解决的问题。肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）是肿瘤免疫微环境的重要组成部分,而肿瘤浸润T淋巴细胞是肿瘤免疫微环境中参与抗肿瘤免疫应答的最重要的免疫细胞,如何提高肿瘤浸润T淋巴细胞亚群的浸润水平及功能是当下免疫治疗的研究热点。成熟T淋巴细胞膜表面可表达CD3分子,根据T细胞表面分化抗原的不同,T细胞可分为CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞二个亚群。CD4+T淋巴细胞,通过与外源性抗原肽-MHCII分子结合发挥辅助作用;CD8+T淋巴细胞,主要与内源性抗原肽-MHC-I分子结合、活化,借助于颗粒酶、穿孔素等发挥特异性杀伤功能,是机体免疫系统中最重要的效应细胞。目前研究表明肿瘤浸润淋巴细胞,特别是CD4+Th1和CD8+细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic lymphocyte,CTL）的存在与肿瘤患者较好的预后及肿瘤免疫治疗的疗效相关。FOXP3是Tregs的特异性转录因子。它不仅控制其表型,而且维持其免疫抑制功能,是应用最广泛的Treg标记。Treg通常通过接触依赖方式抑制Teffertor、NK或APC的激活,或通过分泌IL-10、TGF-β等抑制因子介导免疫抑制功能。目前大部分研究表明,在绝大多数肿瘤类型中,细胞毒性抗肿瘤免疫应答的主要细胞(如细胞毒CD8+T细胞、Th1导向的CD4+T细胞、三级淋巴结构（TLSs,tertiary lymphoid structures）的存在与良好的临床结果相关。相反,Tregs表达者预后较差。肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）中Tregs和抑制性检查点分子等复杂的免疫抑制因子可以限制T细胞的浸润和杀伤能力,而这对于肿瘤的根除至关重要。因此,开展肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群的研究对肿瘤的免疫治疗尤为重要。ILT4作为免疫球蛋白样转录子抑制性受体的一种,主要在髓系固有细胞（DC细胞、单核巨噬细胞及中性粒细胞）中表达,通过与经典或非经典组织相容复合体I类分子（MHC-I）结合,在维持母婴免疫耐受、器官移植耐受及炎症反应中发挥重大作用。研究表明,免疫细胞中ILT4的表达可有效抑制CD4+T细胞、CD8+细胞毒T细胞、NK细胞及树突状细胞的免疫活性,同时亦能诱导不同类型Treg细胞发挥免疫抑制作用。其虽在免疫学研究中取得十足的进展,但在肿瘤领域的研究相对较少。近年来,研究发现ILT4在NSCLC、白血病、乳腺癌、食管癌、胰腺癌等多种肿瘤细胞中存在表达,且与恶性肿瘤的增殖、侵袭、转移等多种恶性生物学行为息息相关。此外,ILT4在髓系抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cell,MDSC）中高表达,可促进肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associatedmacrophages,TAM）的M2极化,在创造肿瘤免疫抑制微环境中发挥重要作用。但肿瘤源性ILT4对实体肿瘤免疫抑制性微环境中T淋巴细胞亚群的调控作用及相关机制尚无报道。研究目的1.通过免疫组化染色方法和大数据统计分析ILT4在肺腺癌中的表达及其与T细胞浸润与亚群分布的相关性,以及二者与患者预后的相关性,明确ILT4对免疫抑制微环境的调控作用。以此为基础构建肺腺癌患者预后Nomogram列线图模型,为患者预后的预测提供量化工具。2.体外利用CD3+、CD4+和CD8+T细胞及敲低/过表达ILT4的肺腺癌细胞株构建T细胞-肿瘤细胞共培养体系,应用CCK-8和流式细胞术检测T细胞的增殖和凋亡情况。旨在探讨肿瘤源性ILT4抑制T细胞浸润的可能机制。方法1.收集216例经烟台市烟台山医院病理科诊断明确的原发性肺腺癌患者的病理组织标本及临床病理资料,并通过电话随访的方式获得入组患者的生存资料。应用免疫组织化学染色法检测其ILT4及CD3、CD4、CD8、FOXP3在肿瘤癌巢及间质的表达情况;结合免疫组化结果和GEO公共数据库统计分析ILT4与肺腺癌预后的关系。其次,分别统计ILT4的表达与上述T淋巴细胞亚群在癌巢及间质的分布密度关系,探讨ILT4与T淋巴细胞两者共表达对肺腺癌患者生存预后的影响。2.利用KM-plotter在线工具（http://kmplot.com/）数据库分析肺腺癌患者ILT4的生存情况。对基因表达综合数据库（GEO）中的720例和461例LUAD患者分别进行无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）分析。自动选择每个队列的最佳截止值,其他所有参数均为默认设置。从GEO数据库下载LUAD患者的基因表达谱（GSE50081;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE50081）,GSE50081的基因注释基于微阵列平台GPL570,对127个L UAD样本进行了进一步的研究。对于癌症基因组图谱（TCGA）队列,泛癌的RNASeq数据从UCSC xena下载（https://xenabrowser.net/datapages/）,共纳入515个样本。用ssGSEA函数对R package GSVA中的Treg浸润评分进行量化。采用Spearman相关系数评价ILT4表达与Treg浸润的相关性。3.利用患者临床病理资料、ILT4的表达状况、CD3、CD4、CD8及FoxP3在癌巢及间质的表达数据创建可评估患者预后生存的诺谟图。其中,利用Lasso回归,基于Lambda.1se筛选有意义的指标,将能够反应免疫微环境状态（即ILT4的表达状况、CD3、CD4、CD8及FoxP3在癌巢及间质的表达数据）的这些自变量与其回归系数组成一个计算评分,即为lasso系数。将lasso回归筛选得到的指标联合临床病理参数制作诺谟图,以估算NSCLC患者2年和3年的生存率。其中模型的构建采用R语言3.0.1（R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria）和glmnet package进行LASSO Cox回归模型分析,并运用图形校准法检验模型的一致性/标定度（Calibration）及C-Index值评价模型的区分度。4.利用基因转染技术,分别敲低/过表达LUAD细胞系-H1975中ILT4的表达,应用Western blot、RT-PCR方法分别检测ILT4的转染效率。然后,运用Ficoll-Paque分离液分离健康志愿者全血中的单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,采用相应T细胞亚群磁珠分选试剂盒分选并利用CD3单抗活化人CD3+、CD4+及CD8+T淋巴细胞亚群。将敲低/过表达ILT4的LUAD H1975细胞系（H1975-shILT4与H1975-ILT4）分别与活化的CD3+、CD4+及CD8+T细胞按2:1比例共培养48h。然后,分离共培养之后的T细胞。分别利用CCK-8法和流式细胞术检测共培养体系中T淋巴细胞亚群增殖和凋亡情况。结果1.ILT4在LUAD高表达,正常邻近组织低表达,其表达与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移及较差的PFS、OS相关。此外,ILT4的表达与肿瘤浸润T淋巴细胞的减少有关。进一步行T细胞亚群分析显示,ILT4高表达肿瘤中癌巢和间质中浸润的CD8+T淋巴细胞的减少,Treg浸润增加,而与CD4+T淋巴细胞亚群的浸润密度无关。同时ILT4highCD8low/ILT4highTreghigh肺腺癌患者的OS更差。因此,ILT4与CD8/Treg联合相比任何单一标记具有更好的生存预测价值。2.根据Lasso回归筛选所得免疫指标联合临床参数构建的诺谟图模型可以有效的预测患者2年及3年的生存率,为临床医生提供一种可定量的方法来预测肺腺癌患者的2年、3年生存概率。3.应用RT-PCR及Western blot方法分别检测敲低/过表达肺腺癌细胞H1975中ILT4的转染效率满意。敲低H1975细胞中ILT4表达后,CD3+、CD8+T细胞增殖活性增加,而凋亡比例明显减少。而过表达H1975细胞中ILT4后,CD3+、CD8+T细胞增殖活性受到抑制,凋亡比例明显增加。但两组中均未观察到CD4+T淋巴细胞亚群的浸润变化。结论1.肿瘤源性ILT4的表达与肺腺癌免疫抑制T淋巴细胞亚群的浸润和不良的临床预后相关。提示ILT4可能成为LUAD患者潜在的免疫治疗靶点和预后生物标记物。同时,ILT4与CD8/Treg联合可作为评估LUAD患者预后的更佳指标。2.根据Lasso回归筛选所得免疫指标联合临床参数构建的诺谟图模型可为临床医生提供一种可定量的方法来预测肺腺癌患者生存概率。3.肿瘤源性ILT4通过调控T细胞亚群增殖、凋亡诱导肺腺癌的免疫逃逸。

陈小徵^[4]（2021）在《ILT4诱导EGFR活化非小细胞肺癌免疫抑制微环境的机制及参与免疫治疗的研究》文中研究表明研究背景针对PD-1/PD-L1轴的免疫检查点抑制剂（ICIS）是近年来抗肿瘤治疗的里程碑。这些药物已经在多发性实体瘤中取得了有希望的结果,并被确立为晚期非小细胞肺癌（NSCLC）一线治疗的标准治疗方案。然而,ICIS的疗效仍然有限,在表皮生长因子受体（EGFR）野生型NSCLC患者中小于20%。更糟糕的是,到目前为止,在EGFR驱动的非小细胞肺癌中ICIS的临床试验基本上是无效。据报道,除了固有的低肿瘤突变负荷（TMB）和主要组织相容性复合体（MHC）的表达外,激活的EGFR信号可以利用多种策略来诱导免疫抑制性肿瘤微环境（TME）,包括抑制T细胞浸润和细胞杀伤功能,募集免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和调节性T细胞（Tregs）,以及分泌抑制性细胞因子和代谢物,这是有效的抗肿瘤免疫和免疫治疗的主要障碍。因此,探索EGFR促进肿瘤免疫逃逸和发生发展新机制、逆转抑制性TME是提高EGFR激活的NSCLC患者ICIS疗效的潜在策略。免疫球蛋白样转录子（ILT）4是免疫球蛋白超家族的一种抑制性受体,主要表达于髓系细胞,包括树突状细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和血小板。这些细胞中的ILT4代表其免疫抑制表型,负性调节DC的抗原呈递、中性粒细胞的吞噬、巨噬细胞的成熟和血小板聚集。近年来,我们和其他人发现ILT4还富集于多种实体肿瘤细胞中,并直接诱导其增殖、侵袭和迁移。此外,ILT4与肺腺癌患者的免疫抑制T细胞亚群浸润有关,并预测患者不良预后。这些证据表明ILT4是一个潜在的肿瘤治疗靶点。然而,ILT4在NSCLC细胞中表达的调控机制,以及在免疫微环境和免疫治疗中的作用尚不清楚。TME是癌症不可分割的一部分,它从根本上协调了肿瘤的发生、疾病的进展和治疗的耐药性。在TME的复杂细胞成分中,包括TAMs和失能T细胞在内的免疫细胞在ICI抵抗中起着核心作用。TAMs是TME中最丰富的免疫细胞。大量证据表明,TAMs在肿瘤发生时具有促肿瘤表型,其功能是通过诱导T细胞功能障碍、血管生成以及肿瘤细胞的侵袭和迁移来促进肿瘤的进展。在免疫学角度讲,这些促肿瘤的TAMs既可以直接抑制细胞杀伤功能T淋巴细胞（CTL）反应,也可以通过重塑免疫微环境来间接调节免疫抑制,最终削弱了 ICIS的有效性。除TAMs外,包括CD4+T辅助细胞和CD8+CTL在内的T细胞在抗肿瘤反应中占据最关键和最直接的位置。当CD4+T细胞通过产生干扰素-γ和白细胞介素-2杀死肿瘤细胞并招募肿瘤特异性CTL时,CTL直接通过释放细胞毒颗粒（穿孔素和颗粒酶）或间接通过分泌细胞因子（IFN-γ和肿瘤坏死因子）介导抗肿瘤活性。然而,TME中的T细胞通常由于耗竭或衰老而对肿瘤反应低下,这阻碍了有效的抗肿瘤免疫治疗。虽然针对PD-1/PD-L1信号的ICIS部分逆转了 T细胞的耗竭,但T细胞功能障碍的机制比我们预期的要复杂得多。进一步探索肿瘤介导的免疫抑制机制,通过联合免疫治疗逆转抑制性TME,将为提高ICI疗效提供有效途径。然而,ILT4对TAMs和T细胞介导的EGFR活化NSCLC免疫微环境的作用尚不清楚。因此,全面了解阻断ILT4治疗EGFR活化NSCLC的机制将有利于探索更有效的免疫治疗策略。研究目的本研究将首先明确ILT4在EGFR活化NSCLC中的表达机制和功能作用,发现ILT4可被EGFR-AKT/-ERK1/2信号通路上调表达。其次构建体外肿瘤-TAM/T细胞共培养体系,证实肿瘤细胞中ILT4 一方面可诱导TAMs的募集和M2样极化,应一方面抑制了 T细胞的浸润和细胞杀伤功能。运用全基因的在C57BL/6J小鼠和免疫缺陷的NSG小鼠,证实ILT4不仅可直接促进肿瘤细胞增殖,还可以通过调控M2-TAM和失能T细胞浸润重塑肿瘤微环境,促进小鼠肿瘤生长;ILT4阻断联合PD-L1抑制剂在治疗肿瘤方面显示出协同作用。此外,为明确ILT4阻断是否可增强EGFR突变TKIs耐药和EGFR野生型NSCLC免疫治疗疗效,我们构建EGFR这两类亚型的人源化小鼠肿瘤免疫治疗模型。明确了ILT4阻断与PD-L1抑制剂在EGFR野生型中表现出协同抗肿瘤治疗作用,而在EGFR突变TKIs耐药NSCLC中ILT4阻断单独而非与PD-L1阻断联合显示出了肿瘤治疗疗效。我们的研究确定了在ILT4介导的肿瘤免疫逃逸的新机制,并为EGFR活化NSCLC患者提供了有前途的免疫治疗和联合治疗策略。研究方法1.采用免疫组化检测NSCLC患者组织标本中ILT4的表达和EGFR磷酸化表达水平,并统计分析二者表达的相关性及与患者临床病理参数的关系;2.用EGFR-TKIs/EGF分别刺激EGFR突变/野生型NSCLC细胞,来抑制/激活EGFR活化;或分别敲除/过表达EGFR突变/野生型NSCLC中EGFR,real-time PCR、western blot、免疫荧光和流式细胞术分析人NSCLC细胞系中EGFR活化对ILT4表达的调控作用;3.采用mRNA基因芯片和TCGA数据库分析筛选EGFR调控的信号通路,并通过相应信号通路抑制剂利用western blot确定EGFR诱导肿瘤细胞ILT4表达的特异性分子信号通路;4.敲除EGFR活化NSCLC细胞中ILT4,构建肿瘤细胞与TAM或T细胞的共培养体系,采用Transwell迁移实验、流式细胞术和real-time PCR检测肿瘤细胞ILT4对TAMs募集和极化的影响;通过CFSE增殖实验、凋亡实验、流式细胞术、ELISA和细胞杀伤实验分析肿瘤细胞ILT4对T细胞存活和细胞杀伤功能的影响。5.分别用单抗阻断EGFR活化NSCLC细胞中ILT4和PD-L1,构建肿瘤细胞与TAM或T细胞的共培养体系,如上所述检测TAMs募集和M2样极化及T细胞存活和杀伤水平,验证ILT4联合PD-L1阻断协同逆转了 TAMs/T细胞介导的免疫抑制;6.C57BL/6小鼠皮下注射敲除PIR-B（小鼠ILT4的同源物）的肺癌细胞株LLC,定期给与PD-L1抑制剂治疗,建立肿瘤免疫治疗模型。研究阻断PIR-B及PD-L1单抗治疗对肿瘤生长的影响,用流式细胞术检测小鼠脾脏和外周血中TAMs和T细胞的数量和表型,用免疫组化和免疫荧光检测肿瘤组织中肿瘤TAMs和T细胞的数量和表型。明确PIR-B对肿瘤生长及免疫逃逸的双重影响;7.在NSG小鼠中皮下注射PIR-B敲除的肺癌细胞株LLC构建肿瘤生长模型,观察免疫缺陷小鼠中PIR-B对肿瘤生长的影响;8.将人PBMC尾静脉注射至NSG小鼠,构建人源化免疫系统;分别接种敲除ILT4的吉非替尼耐药PC9（PC9-GR）和EGFR野生型H1299细胞,定期给与PD-L1抗体或对照抗体治疗,建立肿瘤免疫治疗模型。用流式细胞仪检测小鼠脾脏和外周血中TAMs和T细胞的数量和表型,用免疫组化法检测肿瘤组织中TAMs和T细胞的数量和表型。研究结果1.EGFR活化诱导NSCLC细胞ILT4表达在患者NSCLC组织中,我们发现肿瘤细胞ILT4的表达与EGFR磷酸化水平呈明显正相关。在NSCLC细胞系中,证明了 EGFR活化的两种方式,即酪氨酸激酶突变诱导的EGFR激活和配体（EGF）结合依赖的EGFR激活,均上调了 ILT4的表达。2.EGFR通过激活ERK和AKT信号通路介导ILT4表达通过mRNA基因芯片和TCGA大数据分析筛选出EGFR与MAPK,NF-κB,和AKT信号通路密切相关;运用相关通路的特异性抑制剂并WB验证,证实EGFR激活通过ERK和AKT信号通路诱导NSCLC细胞ILT4的表达。3.EGFR活化的NSCLC中ILT4促进TAM募集和M2样极化,抑制T细胞的增殖和细胞杀伤功能利用临床患者肿瘤组织标本及TCGA大数据初步发现肺癌组织ILT4表达与TME中TAMs募集极化及T细胞数量功能有相关性。体外机制研究证实,EGFR活化NSCLC中ILT4通过上调趋化因子CCL2和CCL5表达分泌促进的TAM募集。敲除EGFR活化NSCLC细胞株中ILT4表达,显着降低了其诱导的TAMs的迁移能力;并抑制TAMs中CD206、CD209、IL-10和Arg1等M2样标记物表达,增加了 IL-12、TNFα和IL-6等M1样标记物表达,且削弱了 TAMs诱导的肿瘤免疫抑制作用。敲除EGFR活化NSCLC细胞株中ILT4表达,显着增强了共培养T细胞的增殖、IFN-y的表达分泌水平及杀伤能力。4.ILT4阻断剂在EGFR活化的NSCLC细胞中可与PD-L1抑制剂发挥协同作用,逆转TAM和失能T细胞介导的肿瘤免疫抑制分别用ILT单抗或/和PD-L1单抗预处理EGFR突变、EGFR突变TKIs耐药和EGFR野生型NSCLC肿瘤细胞,然后与TAMs或T细胞共培养。结果发现,阻断上述三种EGFR活化状态的NSCLC细胞中ILT4或PD-L1均抑制了诱导的TAM的迁移能力,而两种抗体的联合应用对TAM的迁移表现出最显着的抑制作用;同时,阻断ILT4或PD-L1可降低TAMs中CD163和CD206的水平,联合抗体组CD163和CD206表达最低。与抗ILT4-或抗PD-L1-预处理肿瘤细胞共培养可提高T细胞的IFN-γ水平、肿瘤杀伤能力和增殖水平,而联合阻断这两种分子则表现出最显着的增加。5.PIR-B和PD-L1阻断剂联合治疗可协同抑制肿瘤生长和免疫逃逸将PIR-B敲除/对照的LLC皮下注射至全基因C57BL/6J小鼠后,腹腔注射PD-L1单抗/对照抗体治疗。结果显示显示PIR-B敲除或PD-L1阻断均可抑制小鼠体内肿瘤的生长,改善T细胞和TAMs介导的免疫抑制TME;二者显示协同治疗作用。NSG小鼠肿瘤生长模型中PIR-B的敲除同样抑制了小鼠体内肿瘤的生长,但变化趋势明显小于全基因的C57BL/6J小鼠,提示免疫系统参与了 PIR-B诱导的肿瘤发生发展。6.ILT4单独阻断而非与PD-L1抑制剂联合可抑制TKI耐药EGFR突变NSCLC的肿瘤进展和免疫逃逸运用TKI耐药EGFR突变型NSCLC细胞系PC9-GR建立了免疫重建NSG小鼠的免疫治疗模型。证实ILT4基因敲除显着抑制了肿瘤生长,增强了脾脏、外周血和肿瘤组织中的T细胞浸润和功能;然而,PD-L1单抗竟然是促进而非抑制了 PC9-GR的肿瘤生长,PD-L1单独阻断或联合ILT4抑制都不会未能改善T细胞上述器官中的浸润。提示单独阻断ILT4而非与ICIs联合,可能是EGFR-TKI耐药的EGFR突变患者一种有效的治疗策略。7.ILT4阻断增强PD-L1抑制剂对EGFR野生型NSCLC的体内治疗疗效敲除EGFR-H1299细胞中ILT4,建立人源化NSG小鼠肿瘤免疫治疗模型。证实ILT4或PD-L1阻断剂均可抑制体内肿瘤的生长,联合治疗对肿瘤生长的抑制作用最为显着;二者协同增强了脾脏、外周血和肿瘤组织中的T细胞的浸润及IFN-γ表达水平。结论1.NSCLC细胞中的ILT4是由EGFR-AKT/-ERK1/2信号通路激活诱导表达的;2.EGFR活化NSCLC中ILT4 一方面可诱导TAM募集和M2样极化,增强TAMs的肿瘤免疫抑制作用;另一方面还可直接抑制T细胞增殖、细胞杀伤作用以及干扰素-γ的表达和分泌。ILT4阻断和PD-L1阻断在体外协同逆转了肿瘤免疫抑制。3.体内研究证实PIR-B不仅促进肿瘤恶性生物学行为,而且诱导了 TAM/T细胞介导的免疫抑制微环境,进而促进肿瘤进展。PIR-B和PD-L1阻断在EGFR活化NSCLC治疗中显示出协同功效。4.人源化小鼠治疗模型中ILT4阻断可增强PD-L1抑制剂对EGFR野生型NSCLC的疗效,但对EGFR突变型NSCLC无影响。

孙永正^[5]（2020）在《利用CRISPR/Cas9文库筛选黑色素瘤细胞抵抗T细胞杀伤的相关microRNA》文中研究说明黑色素瘤是一种侵袭性很强的肿瘤,其5年生存率小于5%。随着BRAF和MEK抑制剂、免疫靶向疗法和免疫检查点抑制剂等治疗方法的快速发展,黑色素瘤患者的生存率得到了显着提高。虽然免疫疗法在黑素瘤患者的治疗过程中发挥重要作用,但肿瘤引起的免疫逃逸限制了免疫治疗的效果。人们尚未对肿瘤免疫逃逸有太深入的了解,许多人类癌症对免疫疗法都有抵抗力。micro RNA是真核细胞中一种长度为21～23 nt的内源性非编码RNA。人类肿瘤中有多种micro RNA表达失调,它们在免疫治疗的过程中发挥至关重要的作用。micro RNA在肿瘤的诊断和预后过程中作为重要的生物标志物,可通过靶向多个关键基因参与肿瘤免疫调控。micro RNA可以通过影响肿瘤细胞的免疫原性导致肿瘤的免疫逃逸,还可以通过平衡肿瘤微环境或者调控免疫细胞的生长和发育调节机体的免疫应答。通过对micro RNA调节肿瘤免疫原性和抵抗细胞毒性T细胞介导的杀伤机制的研究,将对免疫治疗的进一步的研究有着重要作用。目的CRISPR/Cas9作为基因编辑领域中一种十分重要的工具,为我们发现更多潜在的肿瘤免疫治疗靶点发挥了重要的作用。利用CRISPR/Cas9全基因组的筛选已经用来寻找肿瘤细胞耐药、肿瘤细胞增殖和迁移的相关基因。由于micro RNA在肿瘤免疫调控中的重要作用,通过设计CRISPR/Cas9 micro RNA文库无偏的寻找抵抗细胞毒性T细胞杀伤相关的micro RNA,将为黑色素瘤的免疫治疗提供潜在的靶点。方法1.设计了全基因组micro RNA相关的sg RNA文库,得到质控合格的CRISPR/Cas9文库。2.首先使用低病毒感染复数感染表达Cas9的A375细胞系,采用嘌呤霉素来筛选,得到micro RNA敲除细胞系。利用梯度离心法和免疫磁珠筛选,获得细胞毒性T细胞。通过细胞毒性T细胞对感染文库病毒的A375 Cas9细胞系进行筛选。筛选完成后,提取基因组保证文库的丰度,对sg RNA靶向的区域进行PCR扩增。二代测序完成后,使用MAGe CK VISPR来评价样本的测序质量。质控合格后,使用MAGe CK工具对样本的sg RNA进行计数和标准化处理,并使用MAGe CK RRA计算实验组与对照组间sg RNA的富集差异,得到最终的筛选结果。3.通过有限稀释法,经过扩大培养得到稳定敲除micro RNA18a的单克隆株,并对敲除的细胞系进行RNA-SEQ分析。在RNA-SEQ的分析过程中,首先确定基因的表达量,利用Bioconductor DESeq2工具计算实验组与对照组之间的差异表达基因。最终将得到的实验组与对照组之间重叠的差异基因进行比较,在重叠的差异基因中寻找micro RNA18a抵抗细胞毒性T细胞杀伤的相关基因。采用GO富集分析和KEGG信号通路分析来预测micro RNA106b作用的靶基因。结果1.根据文库设计的相关策略,合成了CRISPR/Cas9 micro RNA文库。一共设计了2196个micro RNA相关的sg RNA的文库,该文库涵盖了最新最全的micro RNA。根据二代测序结果,设计的CRISPR/Cas9 micro RNA文库完全匹配率为83.8%,覆盖率为100%,均一性为4,覆盖倍数为162。2.筛选完成之后,对筛选结果进行质控分析。MAGe CK VISPR和Fast QC结果显示,sg RNA提取结果准确,质量与均一性良好。通过MAGe CK RRA分析,我们选择了正向筛选结果中sg RNA富集差异最明显的micro RNA18a和micro RNA106b作为后续研究对象。3.成功构建了micro RNA18a的单克隆细胞系,并对敲除的细胞系进行了RNA-SEQ分析。在micro RNA18a敲除的两个单克隆细胞系的RNA-SEQ分析结果进行重叠。经过RNA-SEQ分析和靶基因预测,micro RNA18a可能通过靶向THBS1,影响细胞毒性T细胞对黑色素瘤细胞的杀伤。最后,通过GO富集分析和KEGG信号通路分析,讨论了micro RNA106b可能发挥的作用。结论1.成功构建了2196个micro RNA相关的sg RNA的文库,该文库几乎涵盖了最新最全的micro RNA,并为以后进行相关micro RNA的筛选打下了坚实的基础。2.micro RNA18a敲低之后,可能通过上调THBS1的表达,影响黑色素瘤的EMT过程,进而影响细胞毒性T细胞对黑色素瘤细胞的杀伤。

赵桂增^[6]（2020）在《HLA-G在HTLV-1病毒感染免疫中的作用研究》文中研究表明背景成人T淋巴细胞白血病病毒I型（Human T-cell leukemia virus type 1,HTLV-1）属于一种δ逆转录病毒,可以通过临床输血、毒品注射或性接触等途径传播。病毒感染后,HTLV-1可以感染多种固有免疫细胞并造成其功能损害,致使其成功逃脱免疫监视可长达二十余年。HTLV-1作为内源性抗原,主要由组织相容性复合体Ⅰ类分子（MHCⅠ）递呈给T淋巴细胞识别并诱导免疫反应,因此,MHCⅠ类分子在HTLV-1感染过程中发挥重要作用。人类白细胞抗原G（Human leukocyte antigen-G,HLA-G）是一种功能性非经典MHCⅠ类分子,主要通过与免疫细胞表达的特异性受体结合发挥免疫抑制作用,包括抑制CD4+T细胞的增殖和树突状细胞的抗原提呈作用,抑制NK细胞和CD8+T细胞的杀伤功能,促进抑制性受体的表达。HLA-G具有免疫耐受功能,在诱导HIV免疫逃逸中发挥作用,那么HIV样的逆转录病毒HTLV-1感染细胞后,是否也会诱导HLA-G的高表达?高表达的HLA-G是否会影响HTLV-1的复制或免疫逃逸?有待我们进一步研究。目的研究人类白细胞抗原G（HLA-G）在成人T淋巴细胞白血病病毒I型（HTLV-1）感染中的表达情况,探讨HLA-G在HTLV-1病毒感染免疫中的作用。方法1.MT2细胞（HTLV-1+T细胞）分别与HeLa和THP1细胞共培养24小时,以MT2-HeLa、MT2-THP1细胞共培养体系建立HTLV-1病毒感染模型,qRT-PCR检测病毒感染后宿主细胞HLA-G异构体mRNA的表达情况。2.利用Jurkat细胞（HTLV-1-T细胞）分别与HeLa和THP1细胞共培养24小时作为阴性对照组;以MT2细胞分别与HeLa和THP1细胞共培养24小时作为实验组,Western blot检测病毒感染后宿主细胞HLA-G蛋白的表达情况。3.利用能识别HLA-G1的特异性抗体对HeLa和THP1细胞进行荧光染色,流式细胞术检测病毒感染后宿主细胞HLA-G1的表达情况。4.我们在HeLa细胞中通过基因转染上调HLA-G的表达,再利用HTLV-1病毒感染细胞,从蛋白水平上验证HTLV-1病毒Tax蛋白的表达情况。5.我们利用siRNA技术,将HeLa细胞中HLA-G基因沉默以后,再利用HTLV-1病毒感染细胞,从蛋白水平上验证HTLV-1病毒Tax蛋白的表达情况。结果1.HTLV-1病毒感染宿主细胞均能诱导HLA-G异构体mRNA的差异性表达,以HLA-G1和G5为主,其余异构体无明显改变。2.Western blot结果显示HTLV-1病毒感染HeLa细胞后明显上调HLA-G蛋白的表达;感染THP1细胞诱导了HLA-G蛋白的表达。3.流式细胞术结果显示HTLV-1病毒感染HeLa细胞后明显上调HLA-G1的表达;感染THP1细胞后HLA-G1的表达显着增加,与对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.05）。4.过表达HLA-G的HeLa细胞被HTLV-1病毒感染后Tax蛋白明显升高。证明随着HLA-G的高表达,HTLV-1病毒Tax蛋白也显着增加。5.HLA-G基因沉默的HeLa细胞被HTLV-1病毒感染后Tax蛋白明显降低。证明随着HLA-G的低表达,HTLV-1病毒Tax蛋白也显着降低。结论免疫耐受分子HLA-G在HTLV-1病毒感染细胞后表达量明显上升,高表达的HLA-G有助于HTLV-1病毒的传播和复制,这或许是导致HTLV-1病毒持续感染的原因之一。

高爱琴^[7]（2019）在《肿瘤源性ILT4调控肿瘤细胞脂肪酸合成诱导T细胞老化及肿瘤免疫逃逸》文中提出研究背景免疫系统是恶性肿瘤发生发展的天然屏障,其中适应性T细胞免疫发挥最主要的抗肿瘤效应。然而,肿瘤微环境中浸润T细胞的丰度极低,同时肿瘤细胞能利用多种机制诱导浸润性T细胞的无功能,是肿瘤免疫逃逸的主要因素之一。因此,提高肿瘤特异性T细胞的浸润数量及免疫杀伤功能是抗肿瘤免疫治疗最重要的策略。目前的肿瘤免疫治疗主要包括免疫检查点阻滞（ICB）治疗及过继性T细胞转移（ACT）两类。ICB治疗采用特异性中和抗体阻断T细胞表而的负调控信号及通路,可以增强肿瘤微环境中已浸润T细胞的活性;而ACT通过外源性输注肿瘤特异性的杀伤性T细胞,增强患者的抗肿瘤免疫应答。虽然上述治疗策略在临床实践中取得了一定的成功,但仍面临较大的挑战:1.大部分实体肿瘤患者对ICB治疗存在原发性或获得性耐药,提示单独ICB治疗不足以逆转肿瘤中复杂的免疫抑制性微环境。2.以抗原嵌合受体T细胞（CAR-T）治疗为代表的ACT在实体肿瘤中的临床获益并不显着。究其原因,除了肿瘤细胞自身的异质性外,复杂的免疫抑制性微环境如免疫检查点分子、炎性细胞因了及抑制性代谢产物等抑制了过继性T细胞的移行浸润及免疫应答。因此,开发新的免疫治疗靶点及不同作用机制的免疫治疗策略的联合应用是目前临床及临床前研究的热点问题。免疫球蛋白样转录子4（ILT4）是免疫球蛋白超家族的膜型抑制性受体,主要表达于髓系抗原提呈细胞如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DCs）及粒细胞表面。ILT4胞内段具有免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIMs）,可以抑制免疫细胞的激活、抗原提呈及免疫应答。在小鼠中ILT4的同源分子为配对的免疫球蛋白样受体B（PIR-B）。近年研究表明,ILT4与PIR-B也表达于肿瘤微环境中,包括肿瘤细胞及肿瘤间质细胞如造血干细胞（HSCs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）及肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）等,调控肿瘤细胞的恶性生物学行为、HSC再生及巨噬细胞M2样极化,进而诱导效应T细胞的失功能及抑制性T细胞分化,扩大了免疫抑制性微环境。基于此本人首次提出“ILT4可作为新型免疫检查点分子参与恶性肿瘤免疫治疗”的新概念。但是肿瘤源性ILT4对肿瘤浸润性T细胞命运及功能的调控尚不清楚。T细胞老化是肿瘤微环境中T细胞失功能的新机制,其核心特征为T细胞的周期阻滞,表型特征为共刺激分子CD27/CD28表达下调、抗增殖分子p16/p53/p21等表达上调、促炎/抑制性细胞因子如IL-6、IL-8、IFN-y、TNF-α分泌增加,且具有直接的免疫抑制效应。研究表明,肿瘤细胞及间质细胞组分如调节性T细胞（Tregs）及骨髓间充质干细胞（BMSCs）可以诱导肿瘤特异性T细胞的老化,促进肿瘤免疫逃逸。机制研究显示,乏氧诱导的肿瘤源性代谢产物cAMP可通过通道连接直接传递到T细胞中,活化T细胞LCK/cAMP/PKA/CREB信号通路,进而介导其免疫老化。但是肿瘤源性ILT4在肿瘤细胞诱导的T细胞老化中的地位及作用不详。研究目的本研究将首先明确ILT4在非小细胞肺癌（NSCLC）、乳腺癌、恶性黑色素瘤及前列腺癌等多种肿瘤中的高表达及其临床意义,扩展ILT4作为肿瘤治疗靶点的普适性;其次构建体外肿瘤-T细胞共培养体系及小鼠移植瘤模型,研究ILT4对T细胞的老化诱导及功能调控,明确肿瘤源性ILT4在恶性肿瘤发生发展及免疫逃逸中的地位;再次通过检测ILT4调控的肿瘤细胞脂代谢酶及代谢产物变化、信号通路蛋白的变化及相应脂代谢/信号通路抑制剂明确ILT4调控T细胞老化的代谢机制及分子信号通路;最后,利用小鼠恶性黑色素瘤的过继性T细胞治疗模型,探讨肿瘤细胞ILT4阻滞对过继转移的肿瘤特异性CD8+T细胞免疫老化及杀伤能力的逆转效应,提出ILT4阻滞联合ACT作为抗肿瘤免疫治疗策略的可行性。研究方法1.第一部分:肿瘤源性ILT4通过诱导T细胞老化介导肿瘤免疫逃逸。1)采用real-time PCR及流式细胞术检测人肿瘤细胞株及上皮细胞株中ILT4的表达,采用免疫组化检测NSCLC及乳腺癌患者组织中ILT4的表达,并统计分析其与患者临床病理特征和总生存（OS）的相关性;通过GEO数据库分析人NSCLC、乳腺癌、前列腺癌和恶性黑色素瘤肿瘤组织中ILT4的表达与患者预后的相关性;综合论证ILT4高表达是恶性肿瘤的普遍特征,预示患者的不良预后。2)real-time PCR及流式细胞术检测小鼠肿瘤细胞株及上皮细胞株中PIR-B（小鼠中1LT4同源分子）的表达;并采用细胞生长、粘附及划痕实验研究小鼠肿瘤细胞中PIR-B过表达/敲除对肿瘤增殖、粘附及侵袭转移能力等恶性生物学行为的影响;3)利用基因转染及敲除技术,分别上/下调ILT4低/高表达肿瘤细胞中的ILT4,通过肿瘤细胞与T细胞的共培养体系明确ILT4对T细胞老化的诱导作用;4)在C57BL/6J小鼠中皮下注射PIR-B过表达/敲除的乳腺癌细胞株E0771构建肿瘤生长模型,研究PIR-B表达状态对肿瘤的成瘤率及生长进展的影响;取上述模型中肿瘤组织、脾脏、淋巴结及外周血,利用SA-β-Gal染色及流式细胞术检测不同组织中T细胞亚群分化及老化T细胞的数量、功能;明确PIR-B对肿瘤生长及T细胞老化的双重影响;5)在NSG小鼠中皮下注射PIR-B过表达/敲除的乳腺癌细胞株E0771构建肿瘤生长模型,观察免疫缺陷小鼠中PIR-B对肿瘤生长的影响;2.第二部分:肿瘤源性ILT4诱导T细胞老化的机制研究。1)通过real-time PCR及油红染色检测ILT4过表达/敲除的肿瘤细胞中脂代谢相关酶的基因表达水平及脂滴生成变化,明确ILT4是否调控肿瘤细胞脂代谢;2)利用相应脂代谢酶抑制剂预处理ILT4过表达的肿瘤细胞后再与T细胞共培养,从功能水平验证脂代谢参与ILT4诱导的T细胞老化;3)筛选过表达/敲除ILT4的肿瘤细胞中信弓·通路蛋白的变化,并通过相应信号通路抑制剂探讨ILT4诱导肿瘤细胞脂代谢及T细胞老化的特异性分子信号通路;3.第三部分:阻断肿瘤细胞ILT4增强了过继性T细胞治疗疗效。利用Pmel TCR转基因小鼠获得gp100抗原特异性CD8+T（gp100-CD8+T）细胞,建立小鼠恶性黑色素瘤过继性T细胞治疗模型,并利用基因敲除技术阻断肿瘤细胞PIR-B表达,采用SA-β-Gal染色及流式细胞术检测肿瘤特异性T细胞的老化状态及杀伤能力,研究PIR-B阻滞对过继性T细胞治疗疗效与肿瘤特异性CD8+T细胞老化和功能的影响。研究结果1.第一部分:肿瘤源性ILT4通过诱导T细胞老化介导肿瘤免疫逃逸。1)ILT4在多种肿瘤细胞中高表达,且与患者不良预后相关。人NSCLC、乳腺癌、恶性黑色素瘤及前列腺癌细胞株中ILT4在基因及蛋白水平的表达均显着高于正常上皮细胞株;NSCLC及乳腺癌患者肿瘤组织中肿瘤细胞ILT4的表达较周围正常上皮细胞显着升高,且与患者淋巴结转移、TNM分期及较差的OS正相关。GEO数据库分析显示NSCLC、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤组织中ILT4的高表达预示患者较短的无进展生存（PFS）及OS。2)PIR-B（小鼠中ILT4同源分子）在小鼠肿瘤细胞中高表达,调控其增殖、粘附、侵袭迁移等生物学行为。小鼠肺癌、乳腺癌及恶性黑色素瘤细胞中PIR-B在基因及蛋白水平的表达均显着高于正常上皮细胞;肿瘤生长、粘附及划痕实验证实PIR-B过表达/敲除分别促进/抑制了肿瘤细胞的增殖、粘附及迁移能力。3)肿瘤源性ILT4体外诱导了 T细胞的老化。与正常上皮细胞相比,NSCLC、乳腺癌、恶性黑色素瘤及前列腺癌细胞显着诱导了共培养的CD4+及CD8+T细胞的老化,降低了 T细胞表面共刺激分子CD27、CD28的表达,同时上调了 T细胞中细胞周期阻滞蛋白p53与p21的表达。共培养体系中加入ILT4中和抗体（anti-ILT4）显着逆转了肿瘤细胞诱导的CD4+及CD8+T细胞的老化;分别用anti-ILT4预处理肿瘤细胞或T细胞后再进行肿瘤-T细胞共培养实验,证实肿瘤来源而非T细胞来源ILT4诱导了T细胞的老化;分别在ILT4高/低表达的肿瘤细胞中敲除/过表达ILT4后再进行肿瘤-T细胞共培养实验,验证了肿瘤源性ILT4诱导了 T细胞的老化。4)PIR-B体内诱导效应T细胞的老化及免疫抑制,促进肿瘤发生发展。全基因C57BL/6J小鼠乳腺癌移植瘤模型中肿瘤细胞E0771过表达/敲除PIR-B后分别促进/抑制了小鼠体内肿瘤的生长及外周血与肿瘤组织中浸润性T细胞的老化,同时分别抑制/促进了外周血及肿瘤组织中浸润性CD4+/CD8+T细胞的免疫功能（表现为CD4+T细胞中IFN-y减少/增加,CD8+T细胞中IFN-y、GranzymeB与Perforin的减少/增加）。NSG小鼠肿瘤生长模型中PIR-B的过表达/敲除同样促进/抑制了小鼠体内乳腺癌的生长,但变化趋势明显小于全基因的C57BL/6J小鼠,提示免疫系统参与了 PIR-B诱导的肿瘤发生发展。2.第二部分:肿瘤源性ILT4诱导T细胞老化的机制研究。1)ILT4通过调控肿瘤细胞脂肪酸合成诱导了 T细胞的老化。Anti-ILT4抑制了肿瘤细胞中脂肪酸合成关键酶ACCl及FASN的基因表达,且显着降低了肿瘤细胞中脂滴形成;分别在ILT4高/低表达的肿瘤细胞中敲除/过表达ILT4后显着下/上调了脂代谢基因ACCl、FASN的表达与脂滴形成。用脂肪酸合成酶抑制剂C75预处理ILT4过表达的肿瘤细胞,然后进行肿瘤-T细胞共培养,结果显示C75预处理逆转了 ILT4诱导的CD4+及CD8+T细胞的老化。2)ILT4通过激活MAPK ERK1/2信号通路介导了肿瘤细胞脂肪酸合成及T细胞老化。分别在ILT4高/低表达的肿瘤细胞中敲除/过表达ILT4后显着下/上调了ERK1/2的磷酸化水平:MEK抑制剂U0126预处理ILT4过表达的肿瘤细胞逆转了 ILT4上调的ACCl与FASN表达及细胞内脂滴形成;U0126预处理ILT4过表达的肿瘤细胞后再进行肿瘤细胞-T细胞共培养实验,证实ERK1/2阻滞逆转了 ILT4诱导的CD4+/CD8+T细胞的老化。3.第三部分:阻断肿瘤细胞ILT4增强了过继性T细胞治疗疗效。小鼠恶性黑色素瘤过继性T细胞治疗模型中,gp100-CD8+T细胞显着抑制了恶性黑色素瘤细胞B16F0的体内生长,而B16F0中PIR-B基因敲除进一步抑制了肿瘤的生长。B16F0中PIR-B基因敲除逆转了外周血及肿瘤组织中浸润的gp-100-CD8+T细胞的老化,增强了其IFN-γ的释放与免疫杀伤效应。结论1.ILT4/PIR-B在多种肿瘤细胞中高表达,与患者不良预后相关;体内外研究证实肿瘤源性ILT4/PIR-B不仅促进肿瘤恶性生物学行为,而且诱导了 CD4+及CD8+T细胞的老化,抑制了其杀伤活性,进而促进肿瘤进展。2.肿瘤源性ILT4通过活化MAPK ERK1/2信号通路调控了肿瘤细胞脂肪酸的合成及脂质堆积,进而诱导T细胞的老化。3.小鼠恶性黑色素瘤过继性T细胞治疗模型中PIR-B阻滞逆转了过继转移的肿瘤特异性CD8+T细胞的免疫老化,增强了其杀伤活性及抗肿瘤疗效;提示ILT4阻滞可以逆转实体肿瘤中ACT耐药,二者联合是有效的抗肿瘤免疫治疗策略。

马惠,王佳琳,徐耀,杨雪,王飞,李长忠^[8]（2018）在《人类白细胞抗原G参与肿瘤免疫逃逸的机制研究进展》文中认为人类白细胞抗原G（HLA-G）属于非经典的HLAⅠ类分子,是机体内重要的免疫耐受分子。免疫逃逸在肿瘤的发生、发展中起关键作用,HLA-G在多种恶性肿瘤中均存在异常表达并抑制宿主的抗肿瘤免疫反应。HLAG可以通过与NK细胞表面受体结合、下调NK细胞趋化因子受体表达,以及其他途径直接或间接抑制NK细胞功能;还可参与调节性T细胞、调节免疫突触功能,使肿瘤细胞发生免疫逃逸。干扰HLA-G以阻断肿瘤的免疫逃逸途径,可为肿瘤的治疗提供新方向。

王峰冰,米建强^[9]（2018）在《HLA-G、HLA-E水平对卵巢恶性肿瘤免疫逃逸药物干预研究的影响》文中研究表明目的探讨卵巢恶性肿瘤免疫逃逸药物干预研究中人类非经典白细胞Ⅰ类抗原-G（HLA-G）、人类非经典白细胞Ⅰ类抗原-E（HLA-E）水平的影响情况,为临床用药提供参考。方法通过移植卵巢恶性肿瘤的方式进行研究,培养卵巢恶性肿瘤细胞株,从而获取移植人卵巢癌裸鼠移植瘤模型,共有50个模型,随机数表法分为5个小组,每个小组有10个人卵巢癌裸鼠移植瘤模型,分别定为对照组、顺铂组、天花粉蛋白组、米非司酮组、顺铂联合米非司酮组,处理方式则依次为未给予特殊处理、顺铂腹腔注射、天花粉蛋白腹腔注射、米非司酮灌胃、米非司酮灌胃联合顺铂腹腔注射,对各组移植瘤体积进行测定,并检测HLA-G与HLA-E的mRNA与蛋白表达水平,实施组间统计学分析。结果顺铂组、天花粉蛋白组、米非司酮组、顺铂联合米非司酮组移植瘤体积明显低于对照组（P<0.05）,同时顺铂联合米非司酮组明显低于顺铂组、天花粉蛋白组、米非司酮组（P<0.05）,而顺铂组、天花粉蛋白组、米非司酮组比较无明显差异（P>0.05）;在HLA-G与HLA-E的mRNA与蛋白表达水平上顺铂组与对照组无差异（P>0.05）,天花粉蛋白组与顺铂组无明显差异（P>0.05）,但和对照组比较差异显着（P<0.05）,米非司酮组、顺铂联合米非司酮组与对照组、顺铂组比较均有明显差异（P<0.05）。结论卵巢恶性肿瘤免疫逃逸药物干预用药中,天花粉蛋白、米非司酮相比顺铂能更好地促进HLA-G与HLA-E的mRNA与蛋白表达水平降低,若能联合顺铂治疗可更好地提高效果,值得借鉴。

陈泉^[10]（2018）在《miR-148a在食管鳞状细胞癌中的功能和调控机制研究》文中进行了进一步梳理在我国,食管癌（Esophageal Cancer,EC）是消化系统中常见的恶性肿瘤之一,多数为食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC）,在食管癌中的比例大于90%。大多数患者出现明显症状后通过内镜活检确诊,很大比例为中晚期,预后较差。早期检测是减轻疾病负担的有效策略。近年来,微小RNA（miRNAs）已被用作血清肿瘤生物标记物。早先研究报道,miR-148a在患有复发性EC的患者中表达不足,是复发性食管癌的肿瘤抑制因子（Tumor Suppressor）。然而,miR-148a在原发性食管鳞癌中是否表达下调及其调控作用仍不清楚。人类白细胞抗原-G（human leukocyte antigen G,HLA-G）是具有免疫调节性质的重要分子,在生理情况下主要分布于胎盘,以往对HLA-G的研究多集中于妊娠合并症、自身免疫性疾病、感染、移植领域。近十余年来,肿瘤领域对HLA-G研究较多,既往研究表明,HLA-G可异位表达于患者的外周血和组织中,HLA-G的异常表达可以使得肿瘤细胞发生免疫耐受、逃逸,并且与不同肿瘤的恶性程度、转移、预后存在密切关系。早先不同的研究分别显示:HLA-G在原发性ESCC组织中具有高表达且与预后相关,HLA-G可由miR-148a调控。本研究的目的在于研究miR-148a、HLA-G在原发性食管鳞癌组织中的表达水平,通过双荧光素酶报告基因实验证实HLA-G是miR-148a调控的一个靶点,免疫荧光（IF）+荧光原位杂交（FISH）检测实验证明miR-148a、HLA-G在食管鳞癌组织中共同表达。同时研究miR-148a在ESCC细胞中对于HLA-G表达及ESCC细胞增殖、侵袭、凋亡的影响。第一部分miR-148a、HLA-G在食管鳞癌中的表达及意义目的:研究原发食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织中miR-148a、HLA-G的表达,探讨Mi R-148、HLA-G在ESCC中的可能作用,对不良预后的可能相关性。方法:对20组不同TNM分期食管鳞癌组织及癌旁组织进行定量实时PCR（Quantitative Real-time PCR）来检测miR-148a、HLA-G的表达水平,miR-148a、HLA-G表达水平的检测以GAPDH为内参照。检验分析miR-148a、HLA-G表达与患者病理TNM分期、预后之间的相关性。结果:q PCR结果显示:食管鳞癌组织与相应癌旁组织中的miR-148a和HLA-G表达有明显差异。食管鳞癌组织中miR-148a的表达明显低于癌旁组织,HLA-G的表达明显高于癌旁组织,差异均具有统计学意义;分析了miR-148a表达水平与病理分期的关系:发现miR-148a低表达的比例在TNM低分期组（Ⅰ期+Ⅱ期）中较低,TNM高分期组（Ⅲ期）中较高,分别是38.5%（5/13）和85.7%（6/7）;Kaplan-Meier生存曲线分析同样提示miR-148a显着低表达组的预后明显差于相对高表达组,具有统计学意义。相比较于癌旁组织,HLA-G在食管鳞癌组织样本中显着表达,上调到约4倍（P<0.01）,具有统计学意义。HLA-G高表达在TNM低分期组（Ⅰ期+Ⅱ期）中较低,TNM高分期组（Ⅲ期）中较高,分别是15.4%（2/13）和71.4%（5/7）。Kaplan-Meier生存曲线分析提示HLA-G相对高表达组的预后明显差于相对低表达组。差异具有统计学意义。结论:miR-148a、HLA-G可能是食管鳞癌的潜在生物标记物（Biomarker）,食管鳞癌组织中miR-148a、HLA-G的表达水平与食管鳞癌的发生、发展相关。第二部分食管鳞癌中miR-148a和HLA-G的调控关系目的:本研究通过生物信息学分析进一步证实miR-148a和HLA-G直接关联,双荧光素酶报告基因分析确认在原发性食管鳞状细胞癌中,HLA-G是miR-148a调控的一个靶点。免疫荧光（IF）+荧光原位杂交（FISH）检测观察食管鳞癌组织中Mi R148a和HLA-G的表达。方法:根据Targetscan1数据库,通过计算机辅助得出Mi R148-a具有潜在的HLA-G结合位点。用miR-148a mimics模拟miR-148a表达,将含有HLA-G 3-UTR的双荧光酶报告载体（psi CHECK2）与miR-148a mimic通过lipofectamine 2000共转染于293T细胞。所有瞬时转染和荧光素酶检测样本每个重复3次。免疫荧光（IF）+荧光原位杂交（FISH）检测证实食管鳞癌组织中Mi R148a和HLA-G的特异性共表达。结果:通过生物信息学分析miR-148a具有HLA-G的结合位点。双荧光素酶报告基因分析确认在HLA-G 3-UTR野生型转染组,miR-148a高表达可明显抑制相应的荧光活性,而在突变组miR-148a未有这种抑制作用。因此miR-148a与HLA-G的结合是特异性的。miR-148a及HLA-G免疫荧光（IF）+荧光原位杂交（FISH）检测实验可明确观察到Mi R148a、HLA-G在食管鳞癌组织中表达。结论:miR-148a具有HLA-G的结合位点,HLA-G是miR-148a调控的一个靶点。食管鳞状细胞癌中,miR-148a和HLA-G共同表达。第三部分Mi R148a调节HLA-G表达,影响食管鳞癌细胞行为目的:提供上调miR-148a在ESCC细胞中的表达,观察对HLA-G表达及ESCC细胞增殖、侵袭、凋亡的影响,探讨miR-148a在ESCC的作用及可能机制。方法:以miR-148a模拟物（Mimic）转染人类ESCC细胞系EC9706,非同源RNA双链体（Non-homologous RNA Duplex）作阴性对照,空载体作空白对照。CCK-8实验检测各组ESCC细胞的活性,侵袭小室实验检测透过侵袭小室的单位面积的ESCC细胞数,分析各组细胞的侵袭能力。用定量实时PCR及免疫印迹试验（Western Blot）来检测HLA-G的表达水平。以膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭（Annexin V-fluorescein Isothiocyanate/Propidium Iodium,Annexin V-FITC/PI）将细胞染色,且通过流式细胞术（Flow Cytometry）来检测细胞凋亡。结果:EC9706细胞中,miR-148a模拟物转染可抑制ESCC细胞活性,降低ESCC细胞侵袭能力,并可诱导细胞凋亡。miR-148a模拟物转染的细胞的凋亡率比空载体转染的细胞或阴性对照的提高了10倍（P<0.01）。同时HLA-G的信使RNA（m RNA）水平及蛋白水平也显着降低（均为P<0.01）。与空白对照组相比,非同源RNA双链体的转染不影响细胞凋亡率或HLA-G的表达。结论:上调miR-148a表达水平可能通过直接调控HLA-G表达,诱导食管鳞癌细胞凋亡,抑制食管鳞癌细胞增殖、侵袭。食管鳞状细胞癌中,miR-148a低表达导致HLA-G异常高表达,从而影响食管鳞癌细胞行为。

二、HLA-G与肿瘤免疫逃逸（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、HLA-G与肿瘤免疫逃逸（论文提纲范文）

（2）ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究（论文提纲范文）

（3）ILT4通过调控肿瘤浸润T淋巴细胞亚群诱导肺腺癌的免疫逃逸（论文提纲范文）

（4）ILT4诱导EGFR活化非小细胞肺癌免疫抑制微环境的机制及参与免疫治疗的研究（论文提纲范文）

（5）利用CRISPR/Cas9文库筛选黑色素瘤细胞抵抗T细胞杀伤的相关microRNA（论文提纲范文）

（6）HLA-G在HTLV-1病毒感染免疫中的作用研究（论文提纲范文）

（7）肿瘤源性ILT4调控肿瘤细胞脂肪酸合成诱导T细胞老化及肿瘤免疫逃逸（论文提纲范文）

（8）人类白细胞抗原G参与肿瘤免疫逃逸的机制研究进展（论文提纲范文）

（9）HLA-G、HLA-E水平对卵巢恶性肿瘤免疫逃逸药物干预研究的影响（论文提纲范文）

（10）miR-148a在食管鳞状细胞癌中的功能和调控机制研究（论文提纲范文）

四、HLA-G与肿瘤免疫逃逸（论文参考文献）

• [1]缺氧影响免疫治疗耐药的机制与应用[J]. 陈佩瑶,贾军梅. 国际肿瘤学杂志, 2021(08)
• [2]ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究[D]. 宫文静. 山东大学, 2021(11)
• [3]ILT4通过调控肿瘤浸润T淋巴细胞亚群诱导肺腺癌的免疫逃逸[D]. 李青. 山东大学, 2021(10)
• [4]ILT4诱导EGFR活化非小细胞肺癌免疫抑制微环境的机制及参与免疫治疗的研究[D]. 陈小徵. 山东大学, 2021(10)
• [5]利用CRISPR/Cas9文库筛选黑色素瘤细胞抵抗T细胞杀伤的相关microRNA[D]. 孙永正. 天津医科大学, 2020(06)
• [6]HLA-G在HTLV-1病毒感染免疫中的作用研究[D]. 赵桂增. 新乡医学院, 2020(12)
• [7]肿瘤源性ILT4调控肿瘤细胞脂肪酸合成诱导T细胞老化及肿瘤免疫逃逸[D]. 高爱琴. 山东大学, 2019(02)
• [8]人类白细胞抗原G参与肿瘤免疫逃逸的机制研究进展[J]. 马惠,王佳琳,徐耀,杨雪,王飞,李长忠. 山东医药, 2018(42)
• [9]HLA-G、HLA-E水平对卵巢恶性肿瘤免疫逃逸药物干预研究的影响[J]. 王峰冰,米建强. 首都食品与医药, 2018(12)
• [10]miR-148a在食管鳞状细胞癌中的功能和调控机制研究[D]. 陈泉. 苏州大学, 2018(06)

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