一、几种核盘菌菌核重寄生真菌生物防治潜能的研究（论文文献综述）
徐玉平[1]（2020）在《重寄生真菌盾壳霉响应草酸毒素的分子机制研究》文中研究说明核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary]是一种重要的植物病原真菌,可以引起多种经济作物菌核病,造成严重的经济损失。生防菌盾壳霉（Coniothyrium minitans）是核盘菌的一种专性重寄生真菌。草酸是核盘菌分泌的重要致病因子,具有酸性、还原性和螯合钙离子等特性。前期研究发现:在盾壳霉与核盘菌互作过程中,核盘菌分泌的草酸能诱导盾壳霉产生草酸脱羧酶Cm Oxdc1,同时产生抗真菌物质来拮抗核盘菌。当草酸被Cm Oxdc1降解后,环境p H值升高,盾壳霉会通过Cmpac C信号通路来激活重寄生相关酶（如几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶等）基因的表达,从而寄生核盘菌。这说明草酸在盾壳霉与核盘菌互作过程中发挥重要作用。但是,盾壳霉响应草酸的分子机制还知之甚少。因此,本研究对盾壳霉响应草酸进行了转录组分析,筛选到1个新的草酸脱羧酶基因Cm Oxdc3和1个Ca2+信号通路转录因子Cm CRZ,采用基因敲除和回补等技术研究了这两个基因的功能,另外还对调控氧化还原平衡的b ZIP基因家族进行了分析,旨在解析盾壳霉响应草酸的分子机制。研究结果如下:1.盾壳霉接触草酸（24 m M）不同时间点（0 h、20 min、1 h、3 h、6 h、9 h）的转录组分析结果表明:有92个基因在接触草酸后5个时间点内均显着下调表达,有165个基因在接触草酸后5个时间点内均显着上调表达。这些差异表达基因主要富集在氧化还原平衡、Ca2+信号通路、细胞增殖和有机物代谢等通路,它们可能在响应草酸胁迫过程中发挥重要作用。2.从转录组差异表达基因中筛选到一个新的草酸脱羧酶基因Cm Oxdc3,比较分析了Cm Oxdc3与Cm Oxdc1的表达模式和基因功能。RT-q PCR结果显示,Cm Oxdc3仅受草酸、丙二酸、盐酸诱导上调表达,而Cm Oxdc1可以受多种酸诱导上调表达。草酸降解试验结果表明,Cm Oxdc3在降解高浓度（24 m M）草酸时发挥关键作用,而Cm Oxdc1在降解低浓度（12 m M）草酸时起主要作用。Cm Oxdc3的敲除导致盾壳霉对核盘菌菌核的重寄生能力显着下降。亚细胞定位观察发现Cm Oxdc3定位于细胞质,草酸刺激后,Cm Oxdc3定位于液泡。酵母分泌系统试验证实Cm Oxdc1的信号肽具有分泌性。这说明Cm Oxdc3主要在胞内降解草酸,而Cm Oxdc1则是分泌到胞外降解草酸。3.由于草酸能螯合钙离子,核盘菌分泌的草酸可能会影响盾壳霉Ca2+信号通路。因此,我们分析了盾壳霉Ca2+信号通路转录因子Cm CRZ基因在盾壳霉响应草酸过程中的作用。Cm CRZ的敲除导致盾壳霉菌丝生长缓慢、菌落边缘畸形、产孢量显着降低、黑色素形成减少、重寄生能力显着下降。Cm CRZ敲除突变体对草酸胁迫更耐受,且低浓度（8 m M）草酸能恢复其表型。酸碱敏感性测定发现,Cm CRZ敲除突变体对酸性环境更耐受,而对碱性环境更敏感。Cm CRZ的敲除导致盾壳霉活性氧清除相关基因显着下调表达,菌丝胞内H2O2水平显着升高,对氧化剂（H2O2和VK3）耐受性增强,且胞外氧化性物质分泌显着增多。Cm CRZ敲除突变体与核盘菌对峙培养时会形成拮抗带,而添加抗氧化剂Vc可以减小拮抗带宽度,调节至酸性环境（p H4）则拮抗带消失。这说明拮抗带可能是因为Cm CRZ敲除导致盾壳霉生长缺陷,分泌大量氧化物所造成的。金属离子敏感性测定表明,Cm CRZ敲除突变体对Na+、Ca2+和Mn2+更敏感,而Mg2+则可以恢复突变体的生长和产孢。以上结果表明Cm CRZ基因参与调控了盾壳霉的生长、产孢、氧化还原平衡、p H感应、Ca2+信号、以及抗生和重寄生等过程。4.草酸作为一种还原剂,可能会改变盾壳霉的胞内氧化还原平衡。我们对调控氧化还原平衡的b ZIP基因家族进行了分析,发现盾壳霉一共含有34个b ZIP基因,其b ZIP结构域中内含子插入位点具有很高的保守性。Cmb ZIP基因在响应草酸胁迫和其他非生物胁迫,以及产孢过程中均存在显着的差异表达。对4个差异表达的b ZIP基因进行了敲除,其中3个Cmb ZIP基因（Cmb ZIP07、Cmb ZIP09和Cmb ZIP13）的敲除对盾壳霉的生长、产孢和响应草酸胁迫均没有显着影响。而Cmb ZIP16的敲除显着增强了盾壳霉对H2O2的敏感性,说明Cmb ZIP16在响应氧化胁迫时发挥重要作用。综上所述,本研究鉴定了一个新的草酸脱羧酶基因Cm Oxdc3的功能,发现其主要起降解胞内草酸的作用。明确了Ca2+信号通路转录因子Cm CRZ基因的功能,发现Cm CRZ在盾壳霉与核盘菌互作过程中扮演重要角色。对盾壳霉b ZIP基因家族进行了分析,证实Cmb ZIP16能响应氧化胁迫。本研究加深了对盾壳霉响应草酸分子机制的认识,为全面揭示盾壳霉-核盘菌互作分子机制奠定了基础。
梁纳[2]（2020）在《盾壳霉双组份组氨酸激酶基因CmHK03的功能研究》文中研究指明核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary]是一种世界性分布的植物病原真菌,能引起多种作物菌核病,造成严重的经济损失。盾壳霉（Coniothyrium minitans）是核盘菌的一种重寄生真菌,可用于防治作物菌核病。双组份组氨酸激酶（Two-component histidine kinases,HKs）参与调控真菌体内多种生命活动,但双组份组氨酸激酶对盾壳霉的生长发育、重寄生、杀菌剂抗性有何影响,目前尚不清楚。本研究采用PEG介导的原生质体转化技术对盾壳霉双组份组氨酸激酶Cm HK03基因进行了敲除、互补和超表达,对Cm HK03在盾壳霉菌丝生长发育、重寄生、抗药性、响应高渗胁迫中的作用进行了分析,取得的主要研究结果如下:1. 杀菌剂敏感性测定表明:Cm HK03的敲除导致盾壳霉对二甲酰亚胺类和苯吡咯类杀菌剂的抗药性显着增强,而对三唑类、嘧啶类、咪唑类、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的敏感性没有变化。2. 渗透压敏感性测定表明:Cm HK03敲除突变体对高渗胁迫（1 M山梨醇、1 M葡萄糖）和高盐胁迫（0.6 M Na Cl、0.6 M KCl）表现敏感。其他非生物胁迫敏感性测定表明:Cm HK03敲除突变体对Ca Cl2（0.2 M）、H2O2（8 m M）、CFW（150μg/m L）和CR（50μg/m L）的敏感性没有显着变化。菌丝NBT染色结果表明:Cm HK03基因的敲除和超表达对盾壳霉菌丝内ROS含量没有显着影响。3. 菌丝内甘油含量测定表明:用1 M山梨醇处理5 h时,盾壳霉野生型和Cm HK03敲除突变体菌丝甘油含量显着升高,但Cm HK03敲除突变体菌丝中甘油含量显着低于野生型。而用5μg a.i./m L咯菌腈处理5 h时,野生型和Cm HK03敲除突变体菌丝中甘油含量均未发生显着变化。这说明Cm HK03可能参与调控甘油的合成来响应渗透压胁迫。4. RT-q PCR结果显示,咯菌腈（5μg/a.i.m L）处理12 h后,野生型中Cm HK03,Sho1和Hog1分别上调表达6.9倍,1.83倍和2.06倍;而在Cm HK03敲除突变体中,Sho1和Hog1却分别下调表达0.34倍和0.72倍。这说明Cm HK03参与杀菌剂抗性调控可能Hog1信号通路有关。5. 草酸敏感性测定表明:Cm HK03敲除突变体和超表达突变体对草酸（16m M和24 m M）的敏感性没有变化。6. Cm HK03的敲除和超表达对盾壳霉的菌丝生长发育、产孢、以及对核盘菌菌丝和菌核的重寄生能力均没有显着影响。以上研究结果表明,Cm HK03的敲除增强了盾壳霉对二甲酰亚胺类和苯吡咯类杀菌剂的抗药性,Cm HK03可能参与调控甘油的合成来响应高渗胁迫,而且Cm HK03的敲除对盾壳霉的菌丝生长发育、产孢和重寄生均没有显着影响。因此,Cm HK03敲除突变体可以与二甲酰亚胺类和苯吡咯类杀菌剂混用,来控制田间核盘菌抗药性菌株。
赵会长[3]（2020）在《盾壳霉基因组学及其重寄生机制研究》文中提出盾壳霉（Coniothyrium minitans）是植物病原真菌核盘菌属真菌（Scelrotinia spp.）的专一性重寄生真菌,由于其对动植物安全且与核盘菌所需生长环境一致,是防治作物菌核病的重要生防真菌。本文通过二代、三代测序技术,对盾壳霉ZS-1菌株进行了全基因组de novo拼接;并结合盾壳霉与核盘菌接触不同时期RNA＿seq数据,分析了盾壳霉重寄生机制进行。主要结果如下:1.本文获得盾壳霉组装基因组大小为39.77 Mb,预测转录基因11437个,编码蛋白11437个。全基因组进化分析显示,盾壳霉与球孢菌（Paraphaeosphaeria sporulosa）基因组进化亲缘关系最近。ITS多序列比对分析可知,两种真菌的ITS碱基差异主要T、C碱基的不同。基因组组分分析显示,盾壳霉和球孢菌等两种真菌基因组转录的snc RNA和t RNA等非编码RNA的数目和种类分布较为相似;二者编码的sn RNAs数目与3种木霉菌（Trichoderma spp.）的数目接近,少于其它所分析真菌基因组编码的数目;而t RNA数目少于本研究中所分析的木霉菌和大部分病原真菌。2.比较分析了盾壳霉ZS-1与38株其它真菌基因组在碳水化合物酶类（CAZymes）、分泌蛋白、转运子和编码次级代谢产物合成基因簇等方面的异同。盾壳霉编码CAZymes中的细胞壁降解酶在盾壳霉降解核盘菌细胞壁扮演重要的角色。盾壳霉基因组编码细胞壁降解酶类与同目（order）真菌在种类分布上具有显着目属特异性;其中盾壳霉中植物细胞壁降解酶类（PCWDE）均有相同的分布趋势,然而基因组中的真菌细胞壁降解酶类（FCWDE）的种类分布不一致,不具有目属特异性。盾壳霉编码的24个铜依赖的裂解多糖单氧化酶（AA9）,相对于3种木霉菌（Trivi2、Triha1和Triat2各编码3个）、2种核盘菌（Sclsc2和Sclbo1各编码6个）、3种灰葡萄菌（B05.10、Bc DW1和Bc T4各编码10个）编码数目呈现显着的扩张。与木霉菌基因组编码的CAZyme相比,盾壳霉在AA9、AA7、GH5、GH35、GH43、PL1、PL3等偏向于PCWDE的CAZyme家族上的数目增多,而木霉菌则在GH18、GH55、GH64、GH71、GH75、GT69、GT70、PL20等家族的CAZyme数目显着扩张。盾壳霉的生命活动的过程,涉及大量的物质转运,转运子尤其是MFS和ABC家族转运子蛋白在生物体物质转运过程中发挥关键性的作用。研究表明盾壳霉产孢和重寄生过程中,转运子活性（transporter activity,GO:0005215）分子功能和转运（GO:0006810）生物过程相关基因表达显着富集（P≤0.05）。单羧酸转运蛋白（Moncarboxylate Transporter,MCT）数目在盾壳霉（16个）、球孢菌（18个）以及3种木霉菌基因组呈现明显的扩展。ABC转运子家族的重金属转运蛋白数目（7个）与本文中所分析的其它真菌（编码3-4个）相比呈现显着的扩张。分泌蛋白是一类分泌到细胞外参与生命活动重要蛋白质。预测盾壳霉基因组编码胞外分泌蛋白948个,占编码蛋白总数的8.29%,与文中分析的其它真菌相比在蛋白占比上没有显着性差异;进一步研究表明它们都具有胞外分泌特性。盾壳霉胞外分泌蛋白主要集中在催化活性（Catalytic activity）、碳结合（Carbohydarate binding）和抗氧化活性（Antioxidant activity）等分子功能以及碳代谢（Carbohydrate metabolic process）和多糖代谢（Polysaccharide metabolic process）等生物过程。结合基于LCMS/MS的蛋白质鉴定结果,从盾壳霉基因组中克隆了6个编码效应子类似分泌蛋白基因,分别在核盘菌中表达引起核盘菌菌落形态的差异,且菌落形态不稳定;而去除了信号肽序列的CDS在核盘菌中表达转化子间菌落形态差异不明显。盾壳霉编码的效应子类似蛋白基因表达影响寄主的菌落表型,推测盾壳霉分泌蛋白在重寄生作用过程发挥重要的功能。真菌合成的聚铜化合物由在基因组上成簇存在编码的一系列聚酮合酶重复脱羧合成,部分具有显着的抗细菌（ABS）或抗真菌活性（AFS）,是真菌次生代谢产物的重要组成部分。盾壳霉基因组预测编码6个PKS基因簇,其数目显着少于近缘属真菌球孢菌（16个）和所有其它分析的植物病原真菌（12-16个）和生防真菌（12-20个）编码的个数,但是多于灰葡萄菌Bc T4基因组编码的4个PKS基因簇。3.盾壳霉全生长发育可大致分为分生孢子（Cop）、分生孢子萌发期（Spg）、菌丝生长期（Myp）、菌丝生长后期/分生孢子器产生前期（Lmy）和分生孢子产生成熟期（Com）等5个时期,基于RNA-seq分析了盾壳霉分生孢子萌发期、菌丝生长期和产孢期的基因调控机制。在分生孢子萌发期,盾壳霉在蛋白翻译、氧化磷酸化、氨基酸相关酶类、细胞骨架、能量代谢、谷胱甘肽代谢等通路（KEGG pathway）显着富集（P≤0.05）。在菌丝生长阶段,信号和细胞过程、氮代谢、酪氨酸代谢、外泌体、碳水化合物代谢、转运子以及转运等相关通路显着富集（P≤0.05）。而碳水化合物代谢、其它次级代谢产物生物合成、淀粉和糖代谢、转运子、丙酮酸盐、氨基糖和核苷酸糖代谢通路（P≤0.05）则被显着富集参与盾壳霉分生孢子的产生。4.为更好地明确盾壳霉寄生核盘菌的生物学过程,解析了盾壳霉菌丝与核盘菌菌丝接触0 h、4 h和12 h等三个时间点RNA-seq数据。与二者刚接触时期相比,盾壳霉在寄生核盘菌的4 h和12 h,分别有622个和875个基因显着上调表达,共有上调表达443个。盾壳霉在“感知”到核盘菌存在时,上调自身多个相关基因参与重寄生过程。细胞通讯（GO:0007154）、应激生物过程（GO:0065007）、转运子（GO:0006180）、底物定位过程（GO:0051179）、杂环化合物和有机物生物合成过程在盾壳霉与核盘菌接触早期的4 h和12 h分别与0 h比较中显着富集（P≤0.05）。基于以上生物过程与分子功能可以推测,盾壳霉在接触核盘菌后,通过信息的交流（GO:0007154）识别核盘菌,提高与有机环状化合物结合（GO:0097159）、杂环有机化合物结合（GO:1901363）、小分子物质结合（GO:0036094）、药物结合（GO:0008144）、蛋白结合（GO:0005515）和离子结合（GO:0043167）等结合以及转运子活性（GO:0005215）相关基因的表达,并且水解酶活性（GO:0016787）相关基因表达在12 h显着富集（P≤0.05）。盾壳霉基因组编码中大部分涉及到了编码细胞壁降解酶类、转运子、分泌蛋白和次级代谢产物合成基因簇的DEGs,在盾壳霉接触核盘菌早期显着上调表达。在另一方面,在盾壳霉重寄生核盘菌过程中,核盘菌也有相应的应答反应,如核盘菌中有关创伤修复氧化还原过程（GO:0055114）、芳香族氨基酸合成过程（GO:0009073）和分支酸盐生物合成途径（GO:0009423）等生物学过程以及氧化还原活性（GO:0016491）、耐热耐压应激（GO:0006950,GO:0009408）、胆碱脱氢酶活性（GO:0008812）和氧化应激（GO:0016884）等功能相关基因表达被显着抑制。与此同时,核盘菌中苯丙氨酸合成通路以及其涉及到莽草酸产生相关基因表达在盾壳霉早期寄生的核盘菌中被显着抑制。5.核盘菌菌丝接触盾壳霉后,核盘菌诱导坏死蛋白（Ss NEP2）基因Ss NEP2表达显着增强,通过ATMT技术获得了该基因在核盘菌中沉默转化子。研究发现该基因在核盘菌中沉默可以提高其对盾壳霉的抵抗能力,沉默转化子菌核显着诱导盾壳霉分生孢子的萌发;然而因沉默转化子被盾壳霉寄生能力的下降,盾壳霉在核盘菌菌丝上分生孢子的产生数目显着降低。由此可知,盾壳霉抑制核盘菌中莽草酸合成基因表达以及诱导核盘菌Ss NEP2基因表达,可能都是盾壳霉重寄生作用的一个影响因素。推测莽草酸和Ss NEP2影响盾壳霉重寄生核盘菌过程。总之,盾壳霉寄生核盘菌的过程是一个复杂的、涉及到盾壳霉或核盘菌中多个生物学过程以及基因变化的双向调控过程。本研究对盾壳霉全基因组测序及分析,结果为进一步研究盾壳霉生长、发育、寄生等生物学特性等提供了平台,同时为从盾壳霉中挖掘相关的基因资源和次生代谢产物资源奠定了基础。
姜庆雨[4]（2020）在《两株拮抗细菌的鉴定及对油菜菌核病的生防作用研究》文中研究表明油菜是我国主要的油料作物,由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）引起的油菜菌核病是油菜生产上的重要病害。目前,防治菌核病主要采取药剂防治,结合农业防治等措施进行综合治理。但是,由于化学药剂会给环境和生物健康带来不利影响,农业防治措施费时费力,人们逐渐把关注点转向环保且防效持久的防治手段上,利用拮抗微生物进行生物防治成为国内外学者研究的热点领域,其中,利用土壤生防菌和菌核内生菌防治油菜菌核病的研究更为突出。为此,本学位论文就油菜菌核病生防菌的筛选、鉴定及生防作用进行了研究,主要结果如下:1.油菜菌核病生防菌的分离筛选、抑菌活性与菌株鉴定利用土壤稀释涂布法从安徽合肥市和芜湖市土样中分离筛选出5株生防细菌,经平板对峙测定,菌株TR-17抑菌活性最佳;从核盘菌菌核中分离筛选出6株有拮抗作用的内生细菌,其中,菌株NS-19遗传稳定性好抑菌效果强,两株生防菌平板对峙抑制率分别为74.45%和69.09%。根据菌株生长的形态学观察,结合16S r DNA序列分析和生理生化试验结果,初步鉴定菌株TR-17为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,菌株NS-19为解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）。2.拮抗菌对核盘菌菌丝生长的影响及抑菌谱测定光学显微镜下,观察与拮抗菌株对峙培养的核盘菌菌丝生长情况发现,受菌株TR-17影响的核盘菌菌丝变细,有断裂现象,菌丝分支不明显;受菌株NS-19影响的菌丝顶端膨大,菌丝纤细,菌丝形态畸变。通过分析此两株生防菌对14种供试病原菌的抑菌谱,结果发现,菌株TR-17对稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）抑制率分别达72.42%、93.79%和55.78%,NS-19对小麦全蚀病菌、葡萄灰霉病菌抑制率为92.41%和51.47%。可见,上述两株生防菌对于防治小麦全蚀病菌的抑菌率均在92%以上。3.拮抗菌最适生长条件,发酵液抑菌活性测定和耐受性分析菌株TR-17的最适培养条件为:初始p H为6,28℃恒温培养48 h。能够利用多种碳氮源,最适碳源是葡萄糖,最适氮源是硝酸钠。TR-17无菌发酵液的抑菌活性较强,抑菌效果随无菌发酵液含量的增加而增强,但随着培养天数的增加而减弱,TR-17无菌发酵液的EC50为4.634%,抑菌活性易受温度,p H,紫外照射处理的影响;菌株NS-19的最适生长条件为:初始p H 8,28℃恒温培养48h;最适碳氮源分别为木糖和甘氨酸。NS-19无菌发酵液抑菌效果比TR-17无菌发酵液效果好,EC50为1.383%,发酵液耐受性也比TR-17强,同样条件处理,发酵液抑菌活性的降低幅度不及TR-17。4.拮抗菌无菌发酵液抑菌成分初步分析利用不同饱和度硫酸铵沉淀无菌发酵液抗菌粗蛋白,测定对应蛋白粗提物的抑菌活性,试验设计抗菌蛋白粗提物添加量均为10%,当硫酸铵饱和度为90%时,TR-17无菌发酵液提取出的抗菌蛋白抑制活性最高,为70.75%;当硫酸铵饱和度为70%时,NS-19提取的蛋白粗提物抑菌率最高,为44.38%。利用酸沉淀,甲醇抽提无菌发酵液中的脂肽类抑菌物质,经试验验证,两株拮抗菌的脂肽类粗提物抑菌活性均高于其蛋白粗提物,并且随着脂肽类粗提物浓度增加,抑菌活性相应增强,当TR-17脂肽类粗提物含量为2.5%时,抑制率即可达到81.88%。当NS-19脂肽类粗提物含量为4.5%时,抑菌率达到90.42%。所以初步确定,两株拮抗菌无菌发酵液的主要抑菌成分是脂肽类粗提物。设计合成脂肽类粗体物的基因引物,以菌株NS-19全基因组为模板能够扩增出脂肽类抗生素伊枯草菌素（Iturin）、芬芥素（Fengycin）、表面活性素（Surfactin）的基因片段,结合LC-MS测定菌株NS-19脂肽类粗体物的物质成分,二级质谱匹配得出众多氨基酸类和有机酸类物质,这些氨基酸是合成上述脂肽类抗生素的主要成分,初步推断,NS-19提取的脂肽类粗提物单一抑菌物质可能包括伊枯草菌素（Iturin）、芬芥素（Fengycin）、表面活性素（Surfactin）等。对菌株NS-19脂肽类粗提物采用琼脂孔扩散法进行抑菌谱测定,结果显示,在10种供试病原菌中,抑菌条带宽度大于等于0.70 cm的病原菌有6个,分别为小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）,小麦全蚀病菌（G.graminis）,番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum）,番茄早疫病菌（Alternaria alternata）,油菜菌核病菌（S.sclerotiorum）,苹果腐烂病菌（Valsa mali）。5.拮抗菌挥发性物质对核盘菌菌丝生长和菌核萌发的影响两株拮抗菌产生的挥发性物质对核盘菌菌丝生长有一定的影响,根据双皿倒扣对峙培养结果,菌株TR-17种子液稀释100倍涂布,产生的挥发性物质对核盘菌菌丝的抑制率达89.38%,经菌株NS-19同浓度种子液涂布,产挥发性物质对核盘菌菌丝抑制率为64.06%。上述挥发性物质能够延缓核盘菌菌核萌发,但是不能完全抑制菌核萌发。6.离体叶片试验和盆栽防效试验经菌株TR-17和菌株NS-19无菌发酵液喷雾处理后的离体叶片,接种核盘菌第1 d均没有发病,第2 d测得病斑直径平均值分别为1.04 cm,0.78 cm,同时期对照组的病斑直径平均值达到1.69 cm。经NS-19脂肽类粗提物处理的离体叶片前2 d没有出现病斑。利用上述发酵液和脂肽类粗提物分别喷雾处理盆栽油菜叶片与盆栽植株茎基部,防效效果显着,温室（25℃）放置,3组处理组叶片均没有发病,对照组叶片第2 d病斑大小平均值为2.23 cm;经菌株TR-17发酵液处理的植株茎基部有轻微发病,发病油菜茎基部表皮小面积腐烂,其他两组处理组没有出现病症,对照组植株茎基部表皮均大面积溃烂,植株猝倒,叶片枯萎。
吴红渠[5]（2020）在《粉红粘帚菌发酵产物抑菌生化机制、分离鉴定及剂型制备》文中提出化学农药长期、过量使用,不但导致生态环境污染,而且引起病虫害产生严重的抗药性。利用生物农药进行病虫害防治,既可以减少化学农药的使用,又能延缓病虫害的抗药性。但是,目前生物农药品种少、杀菌（虫）谱窄、防效慢、效果差、成本高,这些问题严重制约了生物农药的推广和应用。随着国民对生态环境、生活质量以及人居环境要求的不断提高,在农林病虫害防治中对于生物农药的需求将会逐年增加。粉红粘帚菌（Clonostachys rosea）具有产孢能力强、作用机制多样、寄生普广、环境友好等特性,是一株极具开发价值和应用前景的生防真菌。在国外粉红粘帚菌已应用于多种作物病害的防治,取得较好的防治效果;然而国内主要围绕粘帚菌分类、对植物病原真菌的重寄生和拮抗作用等方面进行研究,有关粉红粘帚菌的代谢产物鉴定、抑菌机制和农药剂型的研究报道很少。本文以粉红粘帚菌为目标菌株,研究其发酵产物的稳定性和对植物病原菌酶及非酶类的影响,同时采用代谢组学方法对粉红粘帚菌发酵产物进行了分析,利用生物和化学相结合的方法探究粉红粘帚菌的生防机制。我们在筛选出适合粉红粘帚菌杀菌剂的助剂基础上,开发了粉红粘帚菌可湿性粉剂和干悬浮剂两种剂型。因此,本研究不仅为粉红粘帚菌的工业化生产和商品化应用奠定了理论基础,同时为植物病害的绿色防控提供了新的生物防治药剂。以培养11d的粉红粘帚菌发酵产物为材料,对苹果轮纹病菌（Physalospora piricola）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的生物活性进行了测定,对3种病原菌的抑菌率分别为50.68%、40.48%和37.74%。粉红粘帚菌发酵产物活性对温度和酸碱度比较敏感。超声波对粉红粘帚菌发酵产物的稳定性影响甚微,紫外线对发酵产物活性有一定影响,而氧化剂双氧水对发酵产物活性影响较大,金属离子Mg2+、Fe3+、K+、Na+对发酵产物生物活性影响不显着。以粉红粘帚菌发酵产物为材料,测定了对苹果轮纹病原菌5种生化酶的活性及脂质过氧化作用的变化规律。在测定时段（6～30 h）内,发酵产物处理组和对照组的苹果轮纹病菌丙二醛（MDA）含量均呈上升趋势,且处理组始终高于对照组。与对照组相比,处理组苹果轮纹病菌过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、酸性磷酸酶（ACP）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活力（或含量）均有不同程度的下降;而过氧化物酶（POD）和碱性磷酸酶（AKP）有一定程度的上升;同时,经发酵产物处理苹果轮纹病菌体电导率随时间延长而升高。总之,粉红粘帚菌发酵产物抑制了苹果轮纹病菌多数酶的活力,加快了脂质过氧化作用,降低了解毒酶活性,从而抑制该菌的生长发育。经粉红粘帚菌发酵产物处理的核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）,其POD及SOD活性均低于对照组,因此粉红粘帚菌发酵产物对以上2种酶的活性总体呈抑制趋势,但抑制程度存在差异;而粉红粘帚菌发酵产物对核盘菌CAT活性具有激活作用。经粉红粘帚菌发酵产物处理核盘菌,菌体的GSH含量随时间延长而逐渐降低,而对照组则随时间的延长而逐渐增加;经发酵产物处理后,核盘菌菌体的MDA的含量随时间的延长而逐渐增加,并且显着高于对照组。粉红粘帚菌发酵产物在各处理时间点均对番茄早疫病菌体内的CAT的活性具有抑制作用,30 h对番茄早疫病菌体内CAT活性抑制最为显着。粉红粘帚菌发酵产物对番茄早疫病菌体内SOD活性的影响表现为初期抑制,后期略有激活作用。除6h外粉红粘帚菌发酵产物处理组番茄早疫病菌菌体POD活性均显着高于对照,且呈逐渐上升趋势,对番茄早疫病菌POD活性具有明显的激活作用。测试时段内粉红粘帚菌发酵产物处理组番茄早疫病菌体内GSH和MDA的含量均高于的对照组。室内生测结果表明,粉红粘帚菌发酵产物对4个靶标植物病原菌均有抑制作用,其中对核盘菌和苹果轮纹病菌具有较高的杀菌活性。非靶标代谢组学数据分析显示,粉红粘帚菌代谢产物在pos模式下共鉴定出粉红粘帚菌代谢产物42128种,在neg模式下共鉴定出粉红粘帚菌代谢产物27917种。通过10L发酵罐对粉红粘帚菌进行放大发酵,并对发酵产物进行提取分离,共得到7个纯度较高的化合物。经波谱学分析鉴定了这7个化合物,其中2个为新结构化合物和另外5个已知化合物;它们分别为对羟基苯甲酸（化合物 1）,咖啡酸（化合物 2）,Bisorbicillinolide（化合物 5）,Bisvertinoquinol（化合物6）和Sorbicillin（化合物7）。通过对助剂的筛选和优化,研制了以粉红粘帚菌分生孢子粉为主要成分的可湿性粉剂和以粉红粘帚菌孢子粉和发酵产物为主要成分的粉红粘帚菌干悬浮剂。其中,本研究采用喷雾干燥加工工艺开发粉红粘帚菌干悬浮剂。通过系列药效实验对研制出的两个粉红粘帚菌制剂进行药效评估,结果表明,两个制剂均对油菜菌核病具有良好的防治效果。其中粉红粘帚菌可湿性粉剂3个不同剂量的平均防效在60.52%～85.74%之间;而粉红粘帚菌干悬浮剂对油菜菌核病的防治率大于80%,粉红粘帚菌分生孢子粉和发酵产物具有明显的协同防治作用。
蔡爽[6]（2019）在《盾壳霉产孢、寄生和维持渗透相关基因CmSMT1的功能研究》文中研究表明盾壳霉（Coniothyrium minitans）是一种寄生核盘菌的重寄生真菌,对作物菌核病具有显着的生物防治效果。目前,市场上已有商品化盾壳霉制剂投入使用。研究盾壳霉生长、产孢和寄生相关机制,可望提高盾壳霉的生物防治效率。实验室在前期研究中分离鉴定出一株生长、产孢及寄生菌核等方面均显着下降的T-DNA插入转化子ZS-1TN11990,发现T-DNA插入可能破坏了盾壳霉中编码甾醇C-24甲基转移酶（sterol C-24 methyltransferase）的基因（CmSMT1）。本研究旨在前期研究的基础上,进一步研究盾壳霉基因CmSMT1的生物学功能,研究结果如下:通过比较盾壳霉的基因组数据库发现CmSMT1的全长为1220 bp,包含2个内含子和3个外显子,推定编码358个氨基酸。通过比对NCBI蛋白数据库,发现该基因编码的蛋白含有1个Methyltransf25保守结构域,在C端含有1个SterolMTC保守结构域。Real-time PCR检测发现,CmSMT1在盾壳霉中于PDA上生长72 h时表达量最高。利用分割标记法敲除了盾壳霉的CmSMT1,获得其敲除转化子。研究发现敲除转化子与野生菌株存在显着的差异。与T-DNA插入转化子的表型类似,敲除转化子在PDA上形成的菌落为白色,不产生分生孢子器和分生孢子,生长速率与生物产量显着降低,活性氧含量升高;CmSMT1敲除转化子对山梨醇、甘油和氯化钠高渗培养基敏感性显着增强,表明该基因与维持细胞渗透的平衡相关;突变体寄生核盘菌菌丝和菌核的能力均显着降低。构建了CmSMT1的互补载体,通过农杆菌介导盾壳霉技术获得互补转化子,互补转化子均能恢复以上表型。表明CmSMT1与转化子的不正常表型相关。对野生菌株ZS-1与敲除转化子的次生代谢产物进行LC-MS分析比较,发现两个敲除转化子的总离子流图趋势一致,敲除转化子KO-CmSMT1-1与KO-CmSMT1-2相对于ZS-1分别存在6550个差异代谢组分和6835个差异代谢组分。在p-value≤0.01,fold change≥2的条件下,敲除转化子KO-CmSMT1-1相对于ZS-1存在534个显着差异代谢组分,显着上调的差异代谢物有361个,显着下调的差异代谢物有173个;KO-CmSMT1-2相对于ZS-1存在1128个显着差异代谢组分,显着上调的差异代谢物有975个,显着下调的差异代谢物有153个。两组数据进行成对差异比较得到379个共有的显着差异代谢组分。进一步利用系统生物学预测分析了KO-CmSMT1-1和KO-CmSMT1-2的代谢数据,发现与麦角甾醇生物合成途径密切相关的代谢物（2E,6E）-法呢基二磷酸酯和二甲基烯丙基二磷酸酯的含量显着下降;另外还发现与生物体活动相关的代谢物吡哆醛5’磷酸和4-氨基-2-甲基-5-二磷酸甲基嘧啶含量显着下降,但核黄素在这两个敲除转化子中的含量则显着提高。以上结果表明CmSMT1对盾壳霉的正常生长、发育和寄生等生命活动至关重要;敲除CmSMT1盾壳霉合成（2E,6E）-法呢基二磷酸酯和二甲基烯丙基二磷酸酯的能力显着下降,从而影响麦角甾醇的合成;而积累了大量的核黄素可能是敲除转化子中活性氧增加的原因。
姜维治[7]（2018）在《粉红螺旋聚孢霉67-1菌寄生相关基因的功能研究》文中研究指明粉红螺旋聚孢霉（Clonostachys rosea）是一类广泛存在于土壤中的菌寄生真菌,可以防治多种植物真菌病害,具有良好的生防潜力。本研究从前期构建的67-1菌株寄生核盘菌的转录组中挑选出6个差异表达基因,钠离子ATP酶基因crena、异核体不亲和蛋白基因crhip、乙醇胺利用蛋白基因creut和creutq、短链脱氢酶基因crsdr以及一个新基因Unigene 494,q RT-PCR验证表明,上述基因在菌核诱导期间均显着上调表达。从67-1全基因组获得基因全长,生物信息学分析表明,crena cDNA长度为3750 bp,开放阅读框（ORF）长1419 bp,编码472个氨基酸,与顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）钠离子ATP酶相似性为73.8%。通过基因敲除与回补的方法获得了该基因的敲除与回补突变株,敲除突变菌株?crena在PDA培养基上生长速率和产孢能力显着低于野生菌株与回补菌株（P<0.05）;?crena对菌核的寄生能力由4级降为2级,对立枯丝核菌与尖孢镰刀菌的寄生能力显着下降,回补菌株与野生菌株没有显着差异;?crena对黄瓜枯萎病的防效下降了48.5%。上述结果表明crena参与了粉红螺旋聚孢霉67-1寄生核盘菌过程。crhip cDNA全长2436 bp,开放阅读框（ORF）长1794 bp,编码597个氨基酸,与环状刺盘孢霉（Colletotrichum orbicular）异核体不亲和性蛋白相似性为43.1%。通过基因敲除与回补的方法获得了该基因的敲除与回补突变株,敲除突变菌株?crhip在PDA培养基上生长速率显着低于野生菌株与回补菌株（P<0.05）;?crhip对菌核的寄生能力由4级降为3级,回补菌株与野生菌株没有显着差异;?crhip对尖孢镰刀菌的寄生能力显着下降,对黄瓜枯萎病的防效下降了24.5%。上述结果表明crhip参与了粉红螺旋聚孢霉的67-1寄生核盘菌的过程。creut cDNA全长373 bp,开放阅读框（ORF）长363 bp,编码120个氨基酸,与炭疽病菌（Colletotrichum incanum）乙醇胺利用蛋白相似性为81%。通过基因敲除的方法获得了该基因的敲除突变株,与野生菌株相比,敲除突变与野生菌株相比,?creut在PDA培养基上生长速率和产孢水平无显着差异;?creut对菌核的的寄生能力由4级降为2-3级;同时对立枯丝核菌菌的寄生能力显着下降。显微观察发现,野生菌株菌丝能够穿透、缠绕、附着立枯丝核菌菌丝,但突变株菌丝没有发现明显的寄生现象;对黄瓜枯萎病的防效降低了41%。上述结果表明creut参与了粉红螺旋聚孢霉67-1寄生核盘菌的过程。crsdr cDNA长度为911bp,开放阅读框（ORF）长495 bp,编码164个氨基酸,与胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeos porioides）短链脱氢酶具有56.1%的相似性。通过基因敲除的方法获得了该基因的敲除突变株,与野生菌株相比,?crsdr在PDA培养基上生长速率与产孢能力显着下降（P<0.05）;?crsdr对菌核的寄生能力由4级降为3级;对尖孢镰刀菌与立枯丝核菌的寄生能力显着下降;对黄瓜枯萎病的防效下降了42.4%。上述结果表明creut参与了粉红螺旋聚孢霉67-1寄生核盘菌的过程。
孙西苹[8]（2017）在《盾壳霉铁载体铁转运类似蛋白CmSIT1功能研究》文中认为盾壳霉（Coniothyrium minitans）能够寄生核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的菌丝和菌核,可以产生少量的抗真菌物质,是菌核病的重要生防真菌。本研究利用农杆菌介导转化盾壳霉分生孢子的方法,得到20多株表型明显有别于野生菌株ZS-1的突变体。其中ZS-1TN1812菌落异常,颜色由黄色向棕色渐变发展,菌落形状不规则呈扇形;在PDA培养基上菌丝生长缓慢,菌丝尖端短分枝明显增多,菌落中央菌丝明显变粗;该突变体菌落能产生分生孢子器,但不产生分生孢子,而ZS-1菌株的典型表型则是菌丝表面逐渐被黑色分生孢子器覆盖;并且ZS-1TN1812在PDA平板上与核盘菌对峙培养时能够产生大量抗真菌物质。通过温度和蛋白酶处理ZS-1TN1812发酵滤液,发现抗真菌物质至少包含耐热型和蛋白酶敏感型两种化合物。耐热型抗真菌物质可以特异性抑制核盘菌的生长,但不能抑制另一种真菌希金斯刺盘孢菌的生长。而与核盘菌相比,希金斯刺盘孢菌则对有蛋白活性的抗菌物质更为敏感。为了探究ZS-1TN1812滤液中抗真菌物质对菌核病的防治效果,喷洒其滤液于油菜叶片上,核盘菌的侵染扩展明显受到抑制,说明该突变体产生的抗真菌物质在油菜叶片上能发挥有效作用,可以达到防治菌核病的目的。突变体ZS-1TN1812中T-DNA的单拷贝插入激活了铁载体铁转运蛋白类似基因CmSIT1的表达,而且CmSIT1在盾壳霉中是单拷贝存在的。CmSIT1基因包含一个大小为2510 bp的开放阅读框,由7个外显子,6个内含子组成,编码区序列长度为2052 bp,编码683个氨基酸（Gen Bank登录号:MF447899）。为了预测此基因的功能,经NCBI网站Blastp搜索CmSIT1含有一个保守结构域（aa124-aa490）,属于主要运输超家族MFS家族,TMHMM Server v.2.0预测CmSIT1具有13个跨膜区域,用软件Phyre 2采用同源建模的方法构建了CmSIT1的三维结构模型,构建进化树分析,结果表明CmSIT1极有可能是用于铁吸收的MFS转运载体,该基因推定可能与铁载体介导的铁转运相关。同时在盾壳霉中超量表达CmSIT1基因,转化子获得与ZS-1TN1812相似的表型,说明ZS-1TN1812的异常表型确实是CmSIT1基因增强表达导致的。为了进一步验证此基因的功能,本研究运用试剂盒定量检测了盾壳霉菌丝中铁离子的总含量,发现ZS-1TN1812菌丝中铁离子总含量显着高于ZS-1,说明ZS-1TN1812吸收铁离子的能力增强。突变体ZS-1TN1812和野生型菌株ZS-1在含2 m M Fe Cl3的PDA平板上培养,两菌株吸收铁的能力都明显增强而且表型基本相同,说明菌丝内铁的高度积累与突变体ZS-1TN1812的异常表型二者是相关的。为了探索ZS-1菌株中CmSIT1基因被诱导表达的条件,将ZS-1菌株与其他真菌共培养,然后q RT-PCR分析CmSIT1基因的动态表达变化,发现ZS-1菌株与核盘菌互作早期（2 d）时,ZS-1中能检测到CmSIT1基因的大量表达,4 d和5 d时,其表达显着下滑,表明CmSIT1可能在与核盘菌互作早期发挥作用,比如与寄主核盘菌竞争铁离子。总之,突变体ZS-1TN1812的异常表型跟菌丝内铁的高度积累是相关的,CmSIT1基因可能与铁载体介导的铁转运相关,其激活表达增强了盾壳霉的抗真菌能力,此基因在盾壳霉与核盘菌互作早期可被强烈诱导表达,是一个潜力很大的可以提高盾壳霉生物防治能力的基因。为了阐明CmSIT1基因调控盾壳霉生长、产孢和抗真菌作用等的分子机制,本研究对ZS-1TN1812和ZS-1的48 h转录组数据进行了分析。GO和Pathway富集的结果发现,差异表达的基因涉及到的都是生物体生命活动中十分重要的过程,如碳水化合物代谢、脂质代谢、转运、免疫系统等。CmSIT1基因的上调表达,影响最大的基因主要是跟代谢进程相关的类别包括碳水化合物和脂类代谢等基础代谢,说明CmSIT1基因是盾壳霉的重要基因,该基因的变化会影响盾壳霉最基础的生命代谢活动,如生长、产孢等。为了进一步研究盾壳霉中发挥抗菌作用的物质种类,本研究运用GC-MS和LC-MS技术对菌丝粗提液的代谢物质进行了测定,检测出ZS-1样品化合物种类主要有酮类、烷烃、烯烃、酯类和脂肪酸类等,ZS-1TN1812样品化合物种类主要有醇类、萜类（倍半萜和单链萜）、烷烃、烯烃、酯类、脂肪酸类和生物碱类等。通过两者鉴定物质种类对比,抗菌物质有可能是萜类化合物、类固醇、生物碱类物质。烷烃、烯烃、醇类参与碳水化合物的代谢,酮类、萜类、酯类和脂肪酸类参与脂质代谢,生物碱类属于次级代谢产物。通过根据差异代谢物质与代谢通路的交叉分析对比,发现二者具有对应关系。代谢组鉴定出的主要化合物可以归入相应的Pathway富集类别:（1）碳水化合物代谢（环十六烷、正十八烷、二十二烷、二十七烷、二缩甘露醇、山梨醇、D-甘露醇等）、（2）脂类代谢[脂肪酸和不饱和脂肪酸的生物合成（亚油酸、油酸、麦角固醇、合金欢醇）、甘油磷脂代谢、醚脂类代谢（丁基-异丁基-邻苯酸二甲酯、邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯、邻苯二甲酸二丁酯）、多酮类化合物（环戊基乙酮）和萜类化合物（古芸烯、角鲨烯）的代谢]、（3）次级代谢产物[包括4-甲基-2,6-二喹啉二醇、2-（2-苯并噻唑基硫代）乙醇等生物碱]。而且通过代谢节点与转录组数据的相互验证（例如糖类和过氧化氢的代谢等）,推测代谢节点相关的基因和酶类的变化可能是导致ZS-1TN1812异常表型的部分原因。综上所述,本研究盾壳霉中CmSIT1基因的激活表达能够影响盾壳霉的生长、产孢和重寄生能力,使其产生大量抗真菌物质。铁载体铁转运蛋白（SIT）是真菌中特有的且具有底物特异性,可以通过基因修饰,制造出抗菌制剂用于生物防治菌核病。同时转录组数据的分析结果说明盾壳霉的基因功能也是相当复杂的,一个基因的变化,可以引发很多基因的变化,这些基因共同调控和维持盾壳霉的生命活动进程。
贺珍[9]（2016）在《基于代谢组分析的盾壳霉寄生植物病原菌核盘菌初步机理探究》文中提出盾壳霉是植物病原菌核盘菌的重寄生真菌,目前作为生物防治剂应用于油菜菌核病的防治中。针对盾壳霉重寄生机理方面的研究主要集中于基因功能水平,如调节产孢和重寄生能力,对盾壳霉代谢物相关研究较少。随着质谱代谢组分析手段的发展,大量研究表明微生物间的相互作用能显着引起菌株代谢物质水平扰动,从而提供以差异代谢物为对象的微生物互作相关机理信息。本研究运用基于质谱的代谢组分析手段,设计重寄生真菌盾壳霉与其宿主核盘菌的接触培养,从代谢物质水平阐述盾壳霉对核盘菌的重寄生机理。研究为挖掘天然活性产物作为新型生物源农药分子,帮助明确重寄生作用靶标,以及优化盾壳霉的生物防治效率来提高油菜菌核病的防治效率等方面有着重要的理论意义和实践价值。主要研究内容和结果如下:1.不同接触时间下,盾壳霉与核盘菌对峙培养过程中的代谢物变化。运用液相质谱联用技术,比较对峙区样品与盾壳霉、核盘菌单独培养样品在不同接触时间点的代谢物水平差异。显微观察显示对峙接触初期接触盾壳霉的核盘菌菌丝出现尖端膨大和破损,盾壳霉菌丝对核盘菌菌丝有明显的趋向性。代谢组主成分分析显示对峙样品处理间有着明显差异,表明盾壳霉与核盘菌对峙培养能显着引起盾壳霉代谢产物的扰动。鉴定出三种差异代谢物涉及到盾壳霉对核盘菌的重寄生过程中,分别为大环内酯类Macrosphelide A,5-氨基戊酸5-Aminopentanoate和苯二酚Benzenediol,且接触时间为2天时监测的代谢物积累水平最高。实验从代谢物水平分析了盾壳霉与其宿主核盘菌的重寄生作用,并构建了盾壳霉特异性次级代谢物数据库来提高代谢物鉴定的准确性和物质鉴定效率。2.不同宿主真菌刺激下,盾壳霉响应专性重寄生宿主的代谢物差异分析。将盾壳霉分别与能寄生的两种核盘菌1980,A367和不能寄生的核盘菌亲缘菌株灰葡萄孢B05.10进行接触培养,分析盾壳霉是否存在宿主特异的代谢水平差异响应。研究表明,外界真菌刺激能引起盾壳霉代谢物水平的显着变化,且盾壳霉响应宿主核盘菌和非宿主灰葡萄孢的变化模式不同。通过对盾壳霉应答宿主核盘菌不应答非宿主灰葡萄孢的差异代谢组分鉴定结果表明,真菌脂类信号分子在盾壳霉的专性宿主响应机制中扮演着重要角色。3.运用酵母代谢组为模型的高通量网络算法,阐述盾壳霉的专性寄生能力在系统代谢物层面的信息,从代谢物途径水平分析盾壳霉应对宿主真菌的响应机理。研究表明甾醇类生物合成途径和氨基酸代谢以及肌醇类信号途径涉及盾壳霉重寄生宿主响应机理。
楼轶[10]（2015）在《重寄生真菌盾壳霉感应环境pH值的分子机制及其对生防效果影响的研究》文中研究表明核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的油菜菌核病是一种世界性分布的重要病害。盾壳霉（Coniothyrium minitans）是核盘菌的一种重寄生真菌,对油菜菌核病生物防治而言具有广阔的应用前景。前人研究已经报道,核盘菌能够分泌草酸酸化环境pH,盾壳霉在酸化pH下能够合成抗真菌物质（AFS）,抑制核盘菌菌丝生长和菌核萌发。另一方面,盾壳霉具有降解草酸的能力,使环境pH值上升,从而提高盾壳霉产生重寄生相关细胞壁降解酶量及活性。这些结果表明环境pH在盾壳霉与核盘菌的互作过程中扮演重要角色。前期研究已经从盾壳霉中获得了pacC/Rim101的同源基因CmpacC,但对于CmpacC基因的功能及pH感应调控系统中的其它基因尚不清楚。针对这些问题,本研究采用原生质PEG介导转化的基因敲除和互补技术分别对CmpacC,以及pH感应信号途径（Pal）中相关基因CmpalA、CmpalB、CmpalC、CmpalF、CmpalH和CmpalI等进行了功能分析,并对这些基因在盾壳霉重寄生、降解草酸和产生抗真菌物质中的作用进行了分析,取得的如下研究结果:第一,明确了核心转录因子Cmpac C对盾壳霉菌丝发育以及感应胞外高盐高渗压力能力的影响。目前通过原生质体PEG介导转化技术已经获得CmpacC基因的敲除转化子（?CmpacC-21、?CmpacC-29、?CmpacC-46）以及互补转化子（?CmpacC-29C）。与野生型菌株Chy-1相比较,?CmpacC-29突变体在弱酸性或者碱性pH下的菌丝生长受到显着抑制,同时?CmpacC-29突变体的产孢量也显着降低。另外,CmpacC的敲除使得盾壳霉对胞外高盐高渗压力也更为敏感,但是对于胞外的重金属离子和过氧压力却没有明显的区别,由此也可以看出CmpacC在盾壳霉对高盐高渗压力的抗性方面起着重要的调控作用。第二,明确核心转录因子CmpacC在pH感应调控系统中对盾壳霉寄生核盘菌、降解草酸的能力以及抗真菌活性的转录调控机制。通过比较?CmpacC-29突变体与野生型菌株Chy-1和互补转化子?CmpacC-29C对核盘菌的重寄生能力、降解草酸盐的能力以及抗真菌活性。结果显示:与野生型菌株Chy-1和?CmpacC-29C相比,?CmpacC-29突变体对核盘菌菌丝和菌核的重寄生能力明显降低,但是?CmpacC-29突变体降解草酸盐的能力以及产抗真菌物质的能力显着增强。为了阐释?CmpacC-29突变体如何影响盾壳霉寄生核盘菌的能力、降解草酸盐的能力以及产抗真菌的能力,我们通过荧光定量PCR以及酶活试验,表明?CmpacC-29突变体的β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶以及蛋白酶基因的表达量,以及相对应酶的活性显着低于野生型chy-1和互补转化子?cmpacc-29c,但是?cmpacc-29突变体的cmoxdc1的表达量以及总的草酸脱羧酶的活性显着高于野生型chy-1和互补转化子?cmpacc-29c。酵母转录激活试验以及emsa试验结果进一步证实了cmpacc是一种转录因子,可以直接与cmg1、cmch1以及cmoxdc1的启动子序列中的保守结合位点（gccarg）结合。由此可以推出cmpacc正调控着盾壳霉对核盘菌的寄生,但同时也负调控着草酸盐降解以及抗真菌的活性。第三,从盾壳霉野生型菌株chy-1中克隆得到了5个pal基因同源物,即cmpala（genbank登录号:kp747602）、cmpalb（genbank登录号:kp747603）、cmpalc（genbank登录号:kp747604）、cmpalf（genbank登录号:kp747605）、cmpalh（genbank登录号:kp747606）和cmpali（genbank登录号:kp747607）。系统进化分析结果显示:cmpala、cmpalc、cmpalf和cmpalh与油菜黑胫病菌（leptosphaeriamaculans）中的同源基因亲缘关系最近,而cmpalb与小麦褐斑病菌（pyrenophoratritici-repentis）的palb亲缘关系最近,cmpali与小麦叶枯病菌（phaeosphaerianodorum）的pal1亲缘关系最近。第四,通过原生质体peg介导转化技术成功获得了cmpala、cmpalb、cmpalc、cmpalf和cmpalh等5个基因的敲除转化子,分别命名为?cmpala-33、?cmpalb-13、?cmpalc-5、?cmpalf-50和?cmpalh-26。cmpali基因的敲除转化子目前仍然没有获得。与野生型菌株chy-1相比较,在ph>6的条件下,突变体?cmpala-33、?cmpalb-13、?cmpalc-5、?cmpalf-50和?cmpalh-26菌株生长明显受到抑制,说明缺失这些基因使得盾壳霉对碱性ph值环境更加敏感。基因表达量分析结果显示:在这些突变体中,核心转录因子cmpacc的表达量非常低。可能的原因在于:cmpala、cmpalb、cmpalc、cmpalf和cmpalh等5个基因位于cmpacc的上游,敲除这些基因可能阻断cmpacc编码产物的剪切,使得cmpacc蛋白无法进入细胞核中调控自身表达。第五,明确了cmpala、cmpalb、cmpalc、cmpalf和cmpalh对盾壳霉重寄生作用以及抗真菌作用的影响。在重寄生作用方面,对峙培养试验结果表明:与野生型菌株chy-1相比较,菌株?cmpala-33、?cmpalb-13和?cmpalc-5寄生核盘菌菌丝能力显着降低,而菌株?cmpalf-50、?cmpalh-26寄生核盘菌菌丝的能力没有明显变化。但是,菌株?cmpala-33、?cmpalb-13、?cmpalc-5、?cmpalf-50和?cmpalh-26寄生核盘菌菌核的能力均有显着降低。抗真菌作用测定结果表明:mcd为基本培养基,菌株?CmpalA-33、?CmpalB-13、?CmpalC-5、?CmpalF-50、?CmpalH-26在pH8的条件下培养时,培养滤液抑制核盘菌菌丝生长的效果显着高于野生型菌株Chy-1。原因可能在于菌株?CmpalA-33、?CmpalB-13、?CmpalC-5、?CmpalF-50和?CmpalH-26中核心转录因子CmpacC表达量太低,使其不能抑制抗真菌作用相关基因的表达。根据上述试验结果,可以看出:CmpacC及其Pal信号通路基因在盾壳霉与核盘菌的互作中扮演重要角色。在盾壳霉与核盘菌互作的早期,核盘菌在菌丝生长的同时会分泌草酸,从而为自身菌丝的生长创造酸性的环境,盾壳霉在酸性的环境条件下会分泌草酸脱羧酶来降解草酸,随着草酸的降解,环境的pH值会随之增高。随着环境pH的升高,盾壳霉菌株通过以Cmpac C为核心转录因子的pH信号传导通路感应胞外的碱性pH信号,通过两步剪切加工形成有活性的CmpacC蛋白进入盾壳霉的细胞核中,与靶标蛋白基因（β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶以及草酸脱羧酶）的启动子序列中的保守结合位点（GCCARG）结合来调控盾壳霉对核盘菌的重寄生、草酸降解以及抗真菌的活性。
二、几种核盘菌菌核重寄生真菌生物防治潜能的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、几种核盘菌菌核重寄生真菌生物防治潜能的研究（论文提纲范文）
（1）重寄生真菌盾壳霉响应草酸毒素的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 第一章 文献综述 |
| 1 油菜菌核病及核盘菌研究进展 |
| 1.1 油菜菌核病的危害 |
| 1.2 核盘菌的病原学特征和侵染循环 |
| 1.3 核盘菌的致病机理 |
| 1.4 油菜菌核病的防治 |
| 2 重寄生真菌盾壳霉的研究进展 |
| 2.1 盾壳霉的发现及其分类 |
| 2.2 盾壳霉的生物学特性 |
| 2.3 盾壳霉的生态学特性 |
| 2.4 盾壳霉防治核盘菌的作用机制 |
| 2.5 盾壳霉基因组和基因功能研究 |
| 3 草酸及草酸脱羧酶研究进展 |
| 3.1 草酸的特性 |
| 3.2 草酸在生物体内的降解 |
| 3.3 草酸脱羧酶 |
| 4 真菌感应环境pH的机制研究 |
| 4.1 真菌应对环境pH变化的方式 |
| 4.2 以PacC为核心的真菌pH调控系统 |
| 4.3 真菌pH调控其他分子机制 |
| 5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 盾壳霉响应草酸胁迫的转录组分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 供试菌株及培养基 |
| 2.2 供试试剂及主要仪器设备 |
| 2.3 样品收集和总RNA的提取 |
| 2.4 转录组测序及分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 样品检测和总体测序质量评估 |
| 3.2 差异表达基因筛选 |
| 3.3 差异表达基因功能预测 |
| 3.4 差异基因表达趋势分析 |
| 3.5 盾壳霉响应草酸胁迫关键基因筛选 |
| 3.6 RT-qPCR验证转录组结果 |
| 4 结论与讨论 |
| 4.1 过量草酸会影响细胞正常的活动 |
| 4.2 发现一个新型草酸脱羧酶 |
| 4.3 大量未知功能的差异表达基因有待研究 |
| 第三章 盾壳霉草酸脱羧酶基因CmOxdc3 的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 供试菌株、质粒 |
| 2.2 供试培养基、试剂、主要仪器设备及网站和软件 |
| 2.3 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 盾壳霉CmOxdc3 基因的克隆与序列分析 |
| 3.2 草酸脱羧酶基因的系统进化树构建 |
| 3.3 CmOxdc1/3 表达模式分析 |
| 3.4 CmOxdc1和CmOxdc3 的单敲、双敲及回补突变体的获得 |
| 3.5 草酸敏感性测定 |
| 3.6 CmOxdc3 对降解草酸的影响 |
| 3.7 CmOxdc3 对重寄生的影响 |
| 3.8 CmOxdc3 蛋白的亚细胞定位 |
| 3.9 CmOxdc1 基因的分泌信号肽验证 |
| 4 结论与讨论 |
| 第四章 盾壳霉CRZ转录因子基因CmCRZ的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 供试菌株、质粒 |
| 2.2 供试培养基、试剂、主要仪器设备及网站和软件 |
| 2.3 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 CRZ基因克隆及系统进化树构建 |
| 3.2 CRZ基因的敲除与回补转化子验证 |
| 3.3 ΔCmCRZ菌丝生长速率及孢子性状测定 |
| 3.4 ΔCmCRZ产孢及黑色素形成相关基因的表达量测定 |
| 3.5 CmCRZ的亚细胞定位观察 |
| 3.6 ΔCmCRZ对草酸的敏感性测定 |
| 3.7 ΔCmCRZ对不同pH的敏感性测定 |
| 3.8 ΔCmCRZ对草酸钠的敏感性测定 |
| 3.9 ΔCmCRZ对核盘菌重寄生能力的测定 |
| 3.10 ΔCmCRZ对5 种非生物胁迫的敏感性测定 |
| 3.11 ΔCmCRZ对氧化剂的耐受性测定 |
| 3.12 ΔCmCRZ菌丝H_2O_2 含量的测定 |
| 3.13 ΔCmCRZ胞外氧化物检测 |
| 3.14 ΔCmCRZ活性氧清除酶类编码基因表达量的测定 |
| 3.15 ΔCmCRZ对峙拮抗带的成因分析 |
| 3.16 ΔCmCRZ对不同金属离子的敏感性测定 |
| 4 结论与讨论 |
| 第五章 盾壳霉b ZIP转录因子家族转录分析及CmbZIP16 的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 供试菌株 |
| 2.2 供试培养基、试剂、主要仪器设备及网站和软件 |
| 2.3 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 bZIP转录因子家族成员的鉴定及氨基酸性质预测 |
| 3.2 bZIP转录因子结构域序列分析 |
| 3.3 bZIP转录因子家族系统进化树构建 |
| 3.4 bZIP转录因子基因结构及内含子剪切位点分析 |
| 3.5 bZIP转录因子保守位点分析 |
| 3.6 bZIP转录因子在9种胁迫条件下的表达模式分析 |
| 3.7 bZIP转录因子在产孢不同阶段的表达模式分析 |
| 3.8 bZIP转录因子在应对草酸不同阶段的表达模式分析 |
| 3.9 4个CmbZIP基因敲除突变体验证 |
| 3.10 4个CmbZIP基因敲除突变体对OA和 H_2O_2 的耐受性测定 |
| 3.11 CmbZIP16 敲除突变体菌丝生长速率及产孢量测定 |
| 3.12 CmbZIP16 敲除突变体对5 种非生物胁迫的耐受性 |
| 3.13 CmbZIP16 敲除突变体重寄生能力测定 |
| 4 结论与讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1 全文主要结论 |
| 2 主要创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 本研究所涉及的PCR引物序列 |
| 附录二 盾壳霉接触草酸各时间点30个差异表达最大的基因集合 |
| 附录三 本研究所涉及的载体及其构建策略 |
| 附录四 CmCRZ调控的基因 |
| 附录五 CmbZIPs中保守位点预测结果 |
| 附录六 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（2）盾壳霉双组份组氨酸激酶基因CmHK03的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 第一章 文献综述 |
| 1 核盘菌研究现状 |
| 1.1 核盘菌生物学特征 |
| 1.2 核盘菌的危害与防治 |
| 2 盾壳霉研究现状 |
| 2.1 盾壳霉生物学及生态学特征 |
| 2.2 盾壳霉与核盘菌的互作研究 |
| 3 双组份信号系统 |
| 3.1 双组份信号系统的概念 |
| 3.2 酿酒酵母双组份组信号系统 |
| 4 组氨酸激酶研究进展 |
| 5 本研究的目的及内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 常用试剂及仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 盾壳霉菌株的保存与培养 |
| 2.2 盾壳霉基因组DNA的提取 |
| 2.3 PCR |
| 2.4 RT-q PCR |
| 2.5 DNA的琼脂糖电泳 |
| 2.6 PCR产物纯化 |
| 2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.8 DNA克隆技术 |
| 2.9 重组质粒的鉴定与提取 |
| 2.10 PEG介导的原生质体转化 |
| 2.11 RNA的提取与反转录 |
| 2.12 CmHK03基因敲除载体的构建 |
| 2.13 CmHK03敲除突变体的互补 |
| 2.14 CmHK03超表达载体的构建 |
| 2.15 生长速率测定 |
| 2.16 产孢量分析 |
| 2.17 寄生核盘菌能力的检测 |
| 2.18 NBT染色 |
| 2.19 甘油含量测定 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 CmHK03基因的克隆与系统进化分析 |
| 2 CmHK03敲除与回补突变体的获得 |
| 3 CmHK03超表达突变体的获得 |
| 4 突变体生物学表型分析 |
| 4.1 突变体对杀菌剂的敏感性测定 |
| 4.2 突变体对丙酮醛的敏感性测定 |
| 4.3 突变体对渗透压胁迫的敏感性测定 |
| 4.4 突变体对其他非生物胁迫的敏感性测定 |
| 4.5 突变体对草酸的敏感性测定 |
| 4.6 菌丝甘油含量测定 |
| 4.7 甘油合成关键酶基因的表达量测定 |
| 4.8 胁迫条件下 Hog1 通路相关基因的表达量测定 |
| 4.9 突变体菌落形态特征观察 |
| 4.10 突变体菌丝生长速度测定 |
| 4.11 突变体的产孢量和菌丝鲜重测定 |
| 4.12 突变体寄生核盘菌能力的检测 |
| 4.13 NBT 染色检测活性氧含量 |
| 第四章 全文讨论与展望 |
| 1 讨论 |
| 2 总结 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 本实验中使用的引物序列 |
| 附录二 CmHK03序列 |
| 附录三 本试验涉及到的载体 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（3）盾壳霉基因组学及其重寄生机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 核盘菌的危害及防治 |
| 1.1.1 菌核病的病害侵染循环 |
| 1.1.2 菌核病的防治 |
| 1.2 盾壳霉的研究进展 |
| 1.2.1 盾壳霉的生物学特征 |
| 1.2.2 盾壳霉的生防机制研究 |
| 1.2.3 盾壳霉的生物防治应用 |
| 1.2.4 盾壳霉生物学研究 |
| 1.2.5 次级代谢产物 |
| 1.3 立题思路与意义 |
| 第二章 盾壳霉基因组解析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 盾壳霉的单孢分离纯化 |
| 2.1.2 基因组DNA提取和质检 |
| 2.1.3 基因组de novo测序 |
| 2.1.4 基因组序列拼接 |
| 2.1.5 基因组组分分析 |
| 2.1.6 ITS进化关系树构建 |
| 2.1.7 基因组进化分析 |
| 2.1.8 基因功能注释 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 基因组数据量统计 |
| 2.2.2 盾壳霉基因组基本特征 |
| 2.2.3 重复序列分析 |
| 2.2.4 非编码RNA分析 |
| 2.2.5 基因组进化分析 |
| 2.2.6 功能基因注释 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 2.3.1 盾壳霉归于Montagnulaceae科 |
| 2.3.2 非编码RNA种类多样 |
| 2.3.3 盾壳霉基因组的共性与特性 |
| 第三章 盾壳霉不同生长时期RNA-seq分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 盾壳霉不同生长时期显微观察 |
| 3.1.2 总RNA的提取 |
| 3.1.3 转录组分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 盾壳霉全生长发育期 |
| 3.2.2 不同生长期基因表达 |
| 3.2.3 不同生长阶段基因表达差异 |
| 3.2.4 盾壳霉分生孢子萌发相关基因 |
| 3.2.5 盾壳霉菌丝生长基因 |
| 3.2.6 盾壳霉产孢相关基因 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 盾壳霉与核盘菌互作早期相关基因 |
| 4.1 材料及方法 |
| 4.1.1 菌株培养及样本收集 |
| 4.1.2 不同互作时段差异基因分析 |
| 4.1.3 q RT-PCR检测基因表达 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 映射到基因组reads统计 |
| 4.2.2 盾壳霉寄生核盘菌早期显着差异基因 |
| 4.2.3 热激蛋白和醛固酮/酮类还原酶参与重寄生作用 |
| 4.2.4 盾壳霉诱导的宿主应激反应 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 盾壳霉的重寄生作用 |
| 5.1 研究方法 |
| 5.1.1 膜转运蛋白预测 |
| 5.1.2 编码次级代谢产物合成酶相关基因簇分析 |
| 5.1.3 碳水化合物水解酶相关基因预测 |
| 5.1.4 分泌蛋白预测 |
| 5.1.5 效应子基因在核盘菌中表达 |
| 5.1.6 直系同源蛋白集 |
| 5.2 .结果与分析 |
| 5.2.1 ABC和 MFS转运子家族 |
| 5.2.2 次级代谢产物基因簇 |
| 5.2.3 细胞壁降解酶类 |
| 5.2.4 分泌蛋白鉴定及功能分析 |
| 5.2.5 盾壳霉胞外分泌蛋白 |
| 5.2.6 盾壳霉中效应子类似蛋白 |
| 5.2.7 盾壳霉效应子基因影响核盘菌菌落 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 核盘菌SsNEP2影响盾壳霉重寄生过程 |
| 6.1 试验方法 |
| 6.1.1 核盘菌NPP1蛋白基因克隆 |
| 6.1.2 核盘菌SsNEP2进化树构建 |
| 6.1.3 核盘菌SsNEP2基因沉默载体构建 |
| 6.1.4 核盘菌SsNEP2基因沉默转化子验证 |
| 6.1.5 沉默转化子生物学特性检测 |
| 6.1.6 重寄生能力检测 |
| 6.1.7 核盘菌沉默转化子发酵液对盾壳霉生长影响 |
| 6.1.8 核盘菌SsNEP2基因敲除体系建立 |
| 6.1.9 基因表达半定量和荧光定量检测 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 SsNEP2基因被显着诱导表达 |
| 6.2.2 Ss NEP2是I型 NPP1 蛋白 |
| 6.2.3 SsNEP2的沉默不影响核盘菌落形态和致病力 |
| 6.2.4 SsNEP2抑制盾壳霉分生孢子萌发 |
| 6.2.5 核盘菌SsNEP2负调控盾壳霉重寄生作用 |
| 6.2.6 沉默转化子发酵液降低盾壳霉分生孢子产量 |
| 6.2.7 核盘菌Ss NEP2 的沉默诱导盾壳霉Cm CH1和Cmg1 基因的表达 |
| 6.3 小结与讨论 |
| 第七章 主要研究结论及全文展望 |
| 7.1 全文研究结论 |
| 7.1.1 盾壳霉比较基因组学 |
| 7.1.2 分泌蛋白功能解析 |
| 7.1.3 糖苷水解酶类降解核盘菌细胞壁 |
| 7.1.4 其它参与盾壳霉重寄生过程 |
| 7.1.5 盾壳霉-核盘菌的互作 |
| 7.2 研究展望 |
| 7.2.1 盾壳霉与球孢菌的比较 |
| 7.2.2 盾壳霉胞外水解蛋白 |
| 7.2.3 不同阶段寄生相关基因 |
| 7.2.4 盾壳霉专一寄生核盘菌机制 |
| 7.2.5 盾壳霉提高植物抗病性研究 |
| 7.2.6 盾壳霉-核盘菌-环境的“三角关系” |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ 本文附图、附表 |
| 附录 Ⅱ 本文涉及到的引物序列 |
| 附录 Ⅲ 硕博阶段发表论文 |
| 致谢 |
（4）两株拮抗细菌的鉴定及对油菜菌核病的生防作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株与培养基 |
| 2.1.2 主要试剂与药品 |
| 2.1.3 试验仪器 |
| 2.1.4 油菜品种 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 拮抗菌的分离与筛选 |
| 2.2.2 拮抗菌株鉴定 |
| 2.2.3 生防菌最适生长条件测定 |
| 2.2.4 发酵液抑菌活性测定 |
| 2.2.5 发酵液抑菌物质稳定性测定 |
| 2.2.6 拮抗细菌抑菌图谱的测定 |
| 2.2.7 拮抗菌挥发性物质抑菌活性研究 |
| 2.2.8 发酵液粗提物抑菌活性研究 |
| 2.2.9 拮抗菌NS-19脂肽类抗生素抑菌物质初步研究 |
| 2.2.10 拮抗菌株TR-17和NS-19防效试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 拮抗菌分离筛选与活性测定 |
| 3.1.1 拮抗菌分离与筛选 |
| 3.1.2 平板对峙活性测定 |
| 3.1.3 拮抗菌对核盘菌菌丝生长影响的显微照片 |
| 3.2 拮抗菌株鉴定 |
| 3.2.1 形态学观察 |
| 3.2.2 生理生化特征观察 |
| 3.2.3 拮抗菌株16SrDNA序列分析及系统发育树构建 |
| 3.3 拮抗菌最适生长条件分析 |
| 3.3.1 培养时间对拮抗菌TR-17和NS-19生长的影响 |
| 3.3.2 培养温度对拮抗菌TR-17和NS-19生长的影响 |
| 3.3.3 培养初始p H对拮抗菌TR-17和NS-19 生长的影响 |
| 3.3.4 拮抗菌TR-17和NS-19生长所需最适碳氮源分析 |
| 3.4 无菌发酵液抑菌活性分析 |
| 3.4.1 菌株TR-17无菌发酵液抑菌活性 |
| 3.4.2 菌株NS-19无菌发酵液抑菌活性 |
| 3.5 菌株发酵液抑菌物质稳定性分析 |
| 3.5.1 发酵液抑菌物质热稳定性分析 |
| 3.5.2 发酵液抑菌物质pH耐受性分析 |
| 3.5.3 发酵液抑菌物质紫外处理耐受性分析 |
| 3.6 抑菌图谱结果 |
| 3.6.1 拮抗菌TR-17抑菌图谱测定 |
| 3.6.2 拮抗菌NS-19抑菌图谱测定 |
| 3.7 拮抗菌挥发性物质抑菌活性分析 |
| 3.7.1 挥发性物质对核盘菌菌丝生长的影响 |
| 3.7.2 挥发性物质对核盘菌菌核萌发的影响 |
| 3.8 发酵液粗提物抑菌活性分析 |
| 3.8.1 蛋白类粗提物对核盘菌菌丝生长的影响 |
| 3.8.2 脂肽类抗生素对核盘菌菌丝生长的影响 |
| 3.9 拮抗菌NS-19脂肽类抗生素抑菌物质分析 |
| 3.9.1 拮抗菌NS-19脂肽类抗生素部分合成基因扩增结果 |
| 3.9.2 拮抗菌NS-19 脂肽类抗生素LC-MS检测结果 |
| 3.9.3 拮抗菌NS-19脂肽类抗生素抑菌图谱结果 |
| 3.10 拮抗菌株TR-17和NS-19防效试验结果 |
| 3.10.1 离体叶片防效试验结果 |
| 3.10.2 油菜(蓉油14)盆栽叶片防效试验结果 |
| 3.10.3 油菜(南油9号)盆栽茎基部防效试验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）粉红粘帚菌发酵产物抑菌生化机制、分离鉴定及剂型制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 粉红粘帚菌的研究现状 |
| 1.1.1 粉红粘帚菌对植物病原菌的作用机制 |
| 1.1.2 粉红粘帚菌的制剂及应用 |
| 1.2 真菌代谢产物分离鉴定研究进展 |
| 1.2.1 色谱-质谱分离鉴定研究进展 |
| 1.2.2 代谢组学研究进展 |
| 1.3 本文研究目的、意义及技术路线 |
| 1.3.1 本文研究目的及意义 |
| 1.3.2 本文研究的技术路线 |
| 2 粉红粘帚菌发酵产物生物活性及抑菌生化机制 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 粉红粘帚菌对苹果轮纹病菌的影响 |
| 2.2.2 粉红粘帚菌对核盘菌的影响 |
| 2.2.3 粉红粘帚菌发酵产物的稳定性 |
| 2.2.4 对苹果轮纹病菌3种保护酶活性的影响 |
| 2.2.5 对苹果轮纹病菌GSH、MDA含量、PAL活性及菌体电导率的影响 |
| 2.2.6 对苹果轮纹病菌解毒酶ACP和AKP活性的影响 |
| 2.2.7 对核盘菌3种保护酶活性的影响 |
| 2.2.8 对核盘菌GSH含量的影响 |
| 2.2.9 对核盘菌MDA含量及菌体电导率的影响 |
| 2.2.10 对番茄早疫病菌部分酶及非酶类的影响 |
| 2.3 本章小结 |
| 2.3.1 粉红粘帚菌发酵产物的稳定性 |
| 2.3.2 粉红粘帚菌发酵产物对植物病原菌酶和非酶物质的影响 |
| 3 粉红粘帚菌发酵产物代谢组学分析及分离纯化 |
| 3.1 试剂与仪器 |
| 3.1.1 试剂 |
| 3.1.2 仪器 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌种与昆虫 |
| 3.2.2 粉红粘帚菌发酵液的制备 |
| 3.2.3 粉红粘帚菌发酵产物提取 |
| 3.2.4 粉红粘帚菌发酵产物杀虫活性测试 |
| 3.2.5 粉红粘帚菌发酵产物抗菌活性测试 |
| 3.2.6 粉红粘帚菌发酵提取物的分离纯化 |
| 3.2.7 粉红粘帚菌发酵提取物中化合物的结构鉴定 |
| 3.2.8 代谢物提取 |
| 3.2.9 代谢组学实验流程 |
| 3.2.10 液相参数描述 |
| 3.2.11 质谱参数描述 |
| 3.2.12 信息分析流程 |
| 3.2.13 峰提取及鉴定 |
| 3.2.14 QC-RLSC |
| 3.2.15 主成分分析(PCA,Principal Component Analysis) |
| 3.2.16 色谱条件 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 粉红粘帚菌发酵产物代谢组学 |
| 3.3.2 粉红粘帚菌代谢产物的分离纯化与结构鉴定 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 粉红粘帚菌可湿性粉剂研制及应用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试菌株与昆虫 |
| 4.1.2 供试材料 |
| 4.1.3 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 载体的筛选 |
| 4.2.2 紫外线保护剂的筛选 |
| 4.2.3 润湿剂及分散剂的筛选 |
| 4.2.4 粉红粘帚菌可湿性粉剂配制及质量检测 |
| 4.2.5 粉红粘帚菌可湿性粉剂防治试验 |
| 4.3 本章小结 |
| 5 粉红粘帚菌干悬浮制剂的研制及应用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试菌株与昆虫 |
| 5.1.2 供试材料 |
| 5.1.3 试验方法 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 干悬浮制剂助剂的筛选与优化 |
| 5.2.2 喷雾干燥参数的优化 |
| 5.2.3 粉红粘帚菌干悬浮剂的物理性质 |
| 5.2.4 粉红粘帚菌干悬浮剂防治试验 |
| 5.3 本章小结 |
| 6 结果与讨论 |
| 6.1 粉红粘帚菌发酵产物的稳定性 |
| 6.2 粉红粘帚菌发酵产物对3种植物病原菌的影响 |
| 6.2.1 对苹果轮纹病菌的影响 |
| 6.2.2 对核盘菌的影响 |
| 6.2.3 对番茄早疫病菌的影响 |
| 6.3 粉红粘帚菌发酵产物代谢组学分析及分离纯化 |
| 6.4 粉红粘帚菌可湿性粉剂研制及应用 |
| 6.5 粉红粘帚菌干悬浮剂研制及应用 |
| 6.6 讨论 |
| 创新点及展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）盾壳霉产孢、寄生和维持渗透相关基因CmSMT1的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 核盘菌的概况 |
| 1.1.1 核盘菌的危害 |
| 1.1.2 菌核病的防治措施 |
| 1.2 盾壳霉的研究概况 |
| 1.2.1 盾壳霉的生物学特性 |
| 1.2.2 盾壳霉防治菌核病的生防机制 |
| 1.2.3 盾壳霉基因功能研究概况 |
| 1.3 麦角甾醇的研究进展 |
| 1.3.1 麦角甾醇的生物学功能 |
| 1.3.2 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中麦角甾醇生物合成途径 |
| 1.3.3 真菌中甾醇C-24甲基转移酶的研究进展 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 第二章 盾壳霉CmSMT1突变体的生物学功能研究 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 载体 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 盾壳霉基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 总RNA的提取 |
| 2.2.3 盾壳霉cDNA第一链的的合成 |
| 2.2.4 盾壳霉基因CmSMT1表达动态分析 |
| 2.2.5 盾壳霉CmSMT1 的基因敲除及验证 |
| 2.2.5.1 同源重组的原理 |
| 2.2.5.2 PCR扩增获得目标基因的上下游序列和HYG片段 |
| 2.2.5.3 融合片段的获得 |
| 2.2.5.4 UHY和YGD测序验证 |
| 2.2.5.5 盾壳霉ZS-1原生质体的制备 |
| 2.2.5.6 PEG介导的盾壳霉原生质体转化 |
| 2.2.5.7 CmSMT1敲除转化子的PCR验证 |
| 2.2.6 盾壳霉CmSMT1 的基因互补及验证 |
| 2.2.6.1 CmSMT1互补载体的构建 |
| 2.2.6.2 质粒的提取 |
| 2.2.6.3 农杆菌介导的盾壳霉转化 |
| 2.2.6.4 CmSMT1互补转化子的PCR验证 |
| 2.2.7 盾壳霉因CmSMT1功能的研究 |
| 2.2.7.1 盾壳霉菌株的菌落形态特征观察 |
| 2.2.7.2 盾壳霉菌株的菌丝尖端观察 |
| 2.2.7.3 盾壳霉菌株的生长速度测定 |
| 2.2.7.4 盾壳霉菌株的生物产量测定 |
| 2.2.7.5 盾壳霉菌株对核盘菌菌丝寄生作用测定 |
| 2.2.7.6 NBT染色检测活性氧 |
| 2.2.7.7 盾壳霉菌株对高渗培养基敏感性测定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 CmSMT1特性分析 |
| 2.3.2 CmSMT1的表达动态分析 |
| 2.3.3 验证CmSMT1敲除转化子 |
| 2.3.4 CmSMT1互补转化子的PCR验证 |
| 2.3.5 CmSMT1转化子菌落形态 |
| 2.3.6 CmSMT1转化子菌丝尖端形态 |
| 2.3.7 CmSMT1转化子的生长速率 |
| 2.3.8 CmSMT1转化子的生物产量 |
| 2.3.9 CmSMT1转化子的寄生能力 |
| 2.3.9.1 CmSMT1转化子与核盘菌对峙培养 |
| 2.3.9.2 CmSMT1转化子寄生核盘菌菌核 |
| 2.3.10 CmSMT1转化子的活性氧(ROS) |
| 2.3.11 Cm SMT1转化子对高渗培养基的敏感性 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 CmSMT1对盾壳霉合成次生代谢产物的影响 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 菌株活化与培养 |
| 3.2.2 样品的提取 |
| 3.2.3 LC-MS分析 |
| 3.2.4 试验数据处理 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 ZS-1和CmSMT1敲除转化子总离子流图分析 |
| 3.3.2 CmSMT1敲除转化子差异代谢分析 |
| 3.3.2.1 CmSMT1敲除转化子差异代谢云图分析 |
| 3.3.2.2 CmSMT1敲除转化子成对差异比较 |
| 3.3.3 CmSMT1敲除转化子代谢组数据的统计学分析 |
| 3.3.3.1 CmSMT1敲除转化子代谢组数据PCA主成分分析得分图 |
| 3.3.3.2 CmSMT1敲除转化子代谢组数据层次聚类树状图 |
| 3.3.4 系统生物学预测CmSMT1敲除转化子差异代谢物和涉及的代谢途径 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 致谢 |
（7）粉红螺旋聚孢霉67-1菌寄生相关基因的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 植物土传病害及防治 |
| 1.2 菌寄生真菌的研究进展 |
| 1.3 粉红螺旋聚孢霉的研究进展 |
| 1.4 技术路线 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第2章 粉红螺旋聚孢霉67-1寄生核盘菌差异基因相对表达量的监测 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第3章 粉红螺旋聚孢霉67-1钠离子ATP酶基因功能研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第4章 粉红螺旋聚孢霉67-1异核体不亲和蛋白基因功能研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 粉红螺旋聚孢霉67-1乙醇胺利用蛋白基因功能研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第6章 粉红螺旋聚孢霉67-1短链脱氢酶基因功能研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.3 小结与讨论 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）盾壳霉铁载体铁转运类似蛋白CmSIT1功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1 寄主核盘菌 |
| 1.1 致病力及危害 |
| 1.2 菌核病的防治 |
| 2 用作生防菌的盾壳霉 |
| 2.1 分子生物学研究 |
| 2.2 防病机理 |
| 2.2.1 盾壳霉的重寄生作用 |
| 2.2.2 盾壳霉的抗生作用 |
| 3 真菌铁载体-铁转运子(SITS) |
| 4 代谢组学及其质谱分析技术 |
| 4.1 代谢组学简介 |
| 4.2 代谢组学质谱分析技术 |
| 5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 盾壳霉T-DNA插入体库的构建及突变体筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 菌株及培养方法 |
| 1.1.2 质粒与载体 |
| 1.1.3 试剂和仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 农杆菌介导的盾壳霉孢子转化方法 |
| 1.2.2 盾壳霉总基因组DNA的提取 |
| 1.2.3 转化子的PCR鉴定和测序分析 |
| 1.2.4 转化子T-DNA插入Souhthern杂交分析 |
| 1.2.5 利用Inverse PCR扩增T-DNA侧翼序列 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 表型异常的突变体及其生物学特性 |
| 2.2 转化子中T-DNA标记插入位点数Southern杂交分析 |
| 2.3 T-DNA侧翼基因组序列分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 第三章 CmSIT1基因克隆及功能验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株的保存及培养 |
| 1.1.2 质粒及载体 |
| 1.1.3 试剂和仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 盾壳霉菌株生长速度的测定 |
| 1.2.2 突变体菌株寄生致腐核盘菌菌核能力测定 |
| 1.2.3 菌丝显微形态观察 |
| 1.2.4 拮抗真菌特性测定 |
| 1.2.5 ZS-1TN1812菌株抗生物质的初步特性鉴定 |
| 1.2.6 菌株ZS-1TN1812发酵液对菌核病的防治 |
| 1.2.7 CmSIT1的功能预测 |
| 1.2.8 CmSIT1基因的表达动态分析 |
| 1.2.9 DNA提取和Southern杂交 |
| 1.2.10 CmSIT1基因超表达载体的构建 |
| 1.2.11 基因转化子的形态特征观察 |
| 1.2.12 对铁离子压力的反应 |
| 1.2.13 与寄主和非寄主共同培养时CmSIT1基因的表达模式 |
| 1.2.14 菌丝内铁含量测定 |
| 1.2.15 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 盾壳霉突变体ZS-1TN1812表型异常 |
| 2.2 突变体ZS-1TN1812能够产生大量的抗真菌物质 |
| 2.3 突变体ZS-1TN1812中T-DNA的插入激活了CmSIT1的表达 |
| 2.4 CmSIT1推定编码铁载体-铁转运子 |
| 2.5 CmSIT1的超量表达导致了突变体ZS-1TN1812的异常表型 |
| 2.6 适量的铁离子致使ZS-1与ZS-1TN1812表型相似 |
| 2.7 CmSIT1在盾壳霉与核盘菌互作早期表达 |
| 2.8 突变体ZS-1TN1812菌丝内铁高度积累 |
| 3 结论与讨论 |
| 第四章 盾壳霉转录组测序及分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株及培养方法 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 盾壳霉测序菌株的培养和样品制备 |
| 1.2.2 转录表达谱构建 |
| 1.2.3 表达谱差异表达基因的筛选 |
| 1.2.4 表达谱差异基因的表达验证 |
| 1.2.5 Gene Ontology功能富集分析 |
| 1.2.6 Pathway富集分析 |
| 1.2.7 转录组表达谱结果中重要通路的分析与验证 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转录组测序质量评估 |
| 2.2 表达谱的差异基因 |
| 2.3 差异基因的GO分析 |
| 2.4 差异基因Pathway分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 第五章 代谢组物质鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 菌株及培养方法 |
| 1.1.2 仪器和试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 盾壳霉样品代谢组学研究流程 |
| 1.2.2 GC-MS样品的准备和提取方法 |
| 1.2.3 LC-MS样品的准备和提取方法 |
| 1.2.4 数据预处理 |
| 1.2.5 多元统计分析 |
| 1.2.6 代谢物质分析 |
| 1.2.7 过氧化氢的含量的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 盾壳霉测定样品的多维定标和主成分分析 |
| 2.2 鉴定出物质的差异显着性 |
| 2.3 盾壳霉测定样品的分析 |
| 2.4 代谢节点与转录组数据的相互验证 |
| 3 结论与讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录 Ⅱ 已发表的文章 |
| 致谢 |
（9）基于代谢组分析的盾壳霉寄生植物病原菌核盘菌初步机理探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1 盾壳霉简介 |
| 1.1 盾壳霉生物防治能力 |
| 1.2 盾壳霉生物性能研究进展 |
| 2 盾壳霉与核盘菌的相互作用 |
| 2.1 重寄生机制简介 |
| 2.2 代谢物与重寄生的关联 |
| 3 代谢组分析 |
| 3.1 代谢组简介 |
| 3.2 代谢组数据分析 |
| 3.3 微生物代谢组研究进展 |
| 4 研究目的和意义 |
| 第二章 不同对峙时间下盾壳霉的代谢差异分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 对峙培养和菌丝观察 |
| 2.2 对峙培养时间序列的代谢差异分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 第三章 不同宿主刺激下盾壳霉的代谢差异分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 盾壳霉接触不同真菌的代谢谱差异 |
| 2.2 盾壳霉的宿主差异变化代谢物筛选鉴定 |
| 3 小结与讨论 |
| 第四章 盾壳霉专性重寄生机制的代谢途径分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同刺激下盾壳霉菌丝形态观察 |
| 2.2 接触不同宿主时盾壳霉代谢谱差异分析 |
| 2.3 基于网络聚类的差异富集分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 拟发表文章 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）重寄生真菌盾壳霉感应环境pH值的分子机制及其对生防效果影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(ABBREVIATION) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.核盘菌的研究进展 |
| 1.1.核盘菌及其危害 |
| 1.2 核盘菌的形态及生物学特性 |
| 1.3 核盘菌的致病机理 |
| 1.3.1 侵染结构 |
| 1.3.2 草酸 |
| 1.3.3 细胞壁降解酶 |
| 1.4 油菜菌核病的防治 |
| 2 盾壳霉研究进展 |
| 2.1 盾壳霉生物学特性 |
| 2.2 盾壳霉生态学特性 |
| 3 盾壳霉防治核盘菌的机制 |
| 3.1 重寄生作用 |
| 3.2 抗生作用 |
| 3.3 降解草酸毒素 |
| 4 环境PH对盾壳霉生防机制的调控 |
| 4.1 环境pH对盾壳霉重寄生作用的调控 |
| 4.2 环境pH对盾壳霉降解草酸以及抗生作用的调控 |
| 5 真菌适应环境PH值的研究进展 |
| 5.1 受环境pH值调控的基因 |
| 5.2 真菌pH调控的分子机理 |
| 6 本课题的研究意义与内容 |
| 6.1 研究意义 |
| 6.2 研究内容 |
| 第二章 核心转录因子Cmpac C参与调控盾壳霉的菌丝生长发育 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 溶液和培养基配方 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 不同pH值条件下菌丝培养 |
| 1.4.2 菌丝生长以及产孢量试验 |
| 1.4.3 核酸提取 |
| 1.4.4 c DNA的合成 |
| 1.4.5 实时定量PCR（q RT-PCR）分析 |
| 1.4.6 Sourthern杂交 |
| 1.4.7 转录激活试验 |
| 1.4.8 原生质体PEG介导Cmpac C基因的敲除 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Cmpac C蛋白的转录功能分析 |
| 2.2 核心转录因子Cmpac C的功能研究 |
| 2.2.1 Cmpac C的敲除与互补转化子的筛选与鉴定 |
| 2.2.2 Cmpac C敲除突变体的生物学表型分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 讨论 |
| 第三章 Cmpac C对盾壳霉重寄生、草酸毒素降解以及抗真菌作用的调控 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 供试菌株 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 试验试剂 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 盾壳霉寄生核盘菌能力检测的试验 |
| 1.4.2 盾壳霉降解草酸盐的定量检测 |
| 1.4.3 盾壳霉菌株产抗真菌物质（AFS）能力的检测 |
| 1.4.4 盾壳霉重寄生相关基因的表达量检测以及酶活分析 |
| 1.4.5 蛋白纯化和表达 |
| 1.4.6 凝胶阻滞试验（EMSA） |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Cmpac C对盾壳霉寄生核盘菌的影响 |
| 2.1.1 Cmpac C对寄生核盘菌菌丝的影响 |
| 2.1.2 Cmpac C对盾壳霉寄生核盘菌菌核的影响 |
| 2.2 Cmpac C对盾壳霉寄生相关胞外酶基因表达以及酶活性的调控 |
| 2.2.1 Cmpac C对重寄生相关基因表达以及酶活性的影响 |
| 2.2.2 EMSA验证Cmpac C与Cmch1和Cmg1启动子的结合活性 |
| 2.3 Cmpac C对盾壳霉降解草酸盐能力的影响 |
| 2.3.1 Cmpac C对盾壳霉在弱酸性pH下降解草酸根离子的影响 |
| 2.3.2 Cmpac C敲除对Cmoxdc1表达量和总草酸脱羧酶活性的影响 |
| 2.4 Cmpac C敲除对盾壳霉产生AFS（抗真菌物质）的影响 |
| 2.5 Cmpac C敲除后抗真菌物质合成仍然受氮源调控 |
| 3 小结与讨论 |
| 3.1 小结 |
| 3.2 讨论 |
| 第四章 Pal信号途径对盾壳霉菌丝生长发育的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 溶液和培养基配方 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 系统进化树分析 |
| 1.3.2 敲除载体的构建 |
| 1.3.3 原生质体制备与转化 |
| 1.3.4 不同pH下菌丝生长速度的测定 |
| 1.3.5 产孢量的测定 |
| 1.3.6 对高渗高盐压力的敏感性 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 系统进化树分析 |
| 2.2 Pal-pH信号途径上游相关基因的敲除 |
| 2.3 敲除突变体在不同pH下条件下的菌丝生长 |
| 2.4 敲除突变体对高渗高盐压力的敏感性 |
| 2.5 敲除突变体与野生型菌株的产孢量比较 |
| 3 小结与讨论 |
| 第五章 Pal信号途径对盾壳霉重寄生和抗生作用的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 供试菌株 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 突变体寄生核盘菌菌丝能力检测 |
| 1.3.2 抗真菌作用的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 敲除Pal信号通路基因对盾壳霉寄生核盘菌菌丝的影响 |
| 2.2 敲除Pal基因对盾壳霉寄生核盘菌菌核的影响 |
| 2.3 Pal基因对盾壳霉重寄生相关酶基因表达量的影响 |
| 2.4 敲除Pal基因对盾壳霉AFS产量的影响 |
| 3 小结与讨论 |
| 3.1 小结 |
| 3.2 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1 主要结论 |
| 2 展望 |
| 3 论文主要创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1 本研究中所使用的引物序列 |
| 附录2 本研究中所使用的培养基以及缓冲液的配方 |
| 附录3 多因素方差分析I |
| 附录4 多因素方差分析II |
| 附录5 Cmoxdc1, Cmch1和Cmg1启动子序列中潜在的转录因子的统计 |
| 附录6 本论文研究所用到的载体 |
| 附录7 载体的构建以及相关试验结果的附图 |
| 附录8 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
四、几种核盘菌菌核重寄生真菌生物防治潜能的研究（论文参考文献）
- [1]重寄生真菌盾壳霉响应草酸毒素的分子机制研究[D]. 徐玉平. 华中农业大学, 2020
- [2]盾壳霉双组份组氨酸激酶基因CmHK03的功能研究[D]. 梁纳. 华中农业大学, 2020
- [3]盾壳霉基因组学及其重寄生机制研究[D]. 赵会长. 华中农业大学, 2020
- [4]两株拮抗细菌的鉴定及对油菜菌核病的生防作用研究[D]. 姜庆雨. 安徽农业大学, 2020(04)
- [5]粉红粘帚菌发酵产物抑菌生化机制、分离鉴定及剂型制备[D]. 吴红渠. 东北林业大学, 2020
- [6]盾壳霉产孢、寄生和维持渗透相关基因CmSMT1的功能研究[D]. 蔡爽. 华中农业大学, 2019
- [7]粉红螺旋聚孢霉67-1菌寄生相关基因的功能研究[D]. 姜维治. 新疆农业大学, 2018(05)
- [8]盾壳霉铁载体铁转运类似蛋白CmSIT1功能研究[D]. 孙西苹. 华中农业大学, 2017(01)
- [9]基于代谢组分析的盾壳霉寄生植物病原菌核盘菌初步机理探究[D]. 贺珍. 华中农业大学, 2016(02)
- [10]重寄生真菌盾壳霉感应环境pH值的分子机制及其对生防效果影响的研究[D]. 楼轶. 华中农业大学, 2015(02)